自然杀伤（NK）细胞是宿主抵抗病毒病原体的第一道防线(1) (2);它们可以直接清除病毒感染的细胞通过细胞溶解机制和间接分泌细胞因子，如IFN-y(三-4). NK细胞活性受到抑制性NK受体（NKRs）的严格控制，在稳态条件下，抑制性NK受体会覆盖激活受体提供的信号。NKR包括主要的抑制性杀伤免疫球蛋白样受体（KIR）、CD94/NKG2家族的C型凝集素样受体，包括抑制性（NKG2A）和激活性（NKC2C/D）亚型，以及天然细胞毒性受体（NCR），如NKp30（NCR3/CD337）、NKp44（NCR2/CD336）和NKp46（NCR1/CD335）传递激活信号(5) (6) (7).
NKp46受体在静止和活化的NK细胞上表达，被认为是参与NK细胞细胞毒性的主要人类NCR(8) (9). 这种NCR的表达水平在供体之间有显著差异，并与这些个体的自然细胞毒性直接相关(8). 除了在抗肿瘤免疫中发挥重要作用外，NKp46对抗病毒免疫显然也很重要。最初报告与流感血凝素相互作用(9)，NKp46参与NK对流感感染的单核细胞衍生树突状细胞（mDC）的反应(10). 作为进一步的佐证，小鼠模型显示NKp46在体内消灭流感病毒(11). 尽管细胞配体尚未确定，但最近的研究表明，该受体在NK细胞对感染人巨细胞病毒（HCMV）的mDC的反应中对NK细胞的激活起主导作用(12). NKp46的下调与HPV-16感染和宫颈癌进展有关(13). 包括NKp46在内的NCR的下调与HIV感染中NK细胞活性的减弱有关(14). 迄今为止，关于HCV感染者中NKp46表达的数据有限。一些研究表明，急性和慢性丙型肝炎患者的NKp46降低(15) (16); 然而，其他人报告表达增加(17). 最近的一项研究表明，NKp46对IFN-α的反应上调可预测慢性HCV感染的SVR(18).
Toll样受体（TLR）是一个保守的模式识别传感器家族，在早期抗病毒反应中发挥着重要作用通过I型干扰素和炎性细胞因子的诱导(19). 一些病毒被证明可以激活TLR信号级联(20). NK细胞表达模式再认知受体，包括TLR家族的几个成员，尽管并非所有细胞都具有功能。人类NK细胞表达功能性TLR2(21)、TLR3(22)，TLR7/8(23)和TLR9(24). 因此，除了经典的NKR外，TLR对于有效的NK抗病毒反应可能也很重要。
大量证据表明，慢性丙型肝炎病毒感染的病毒持续性风险、自然病史和抗病毒治疗反应在种族群体中存在差异(25) (26). 在一项关于丙型肝炎自然史的大型研究中，病毒自发清除的患者更有可能是非黑人和女性(25). 在急性感染环境中，有症状的女性清除HCV感染的机会增加了八倍(27). 患有慢性丙型肝炎1型感染的非裔美国人（AA）对聚乙二醇干扰素和利巴韦林的病毒学应答率低于白种人（CA），并且这些差异不能用疾病特征、基线病毒水平或用药量来解释(28). 综上所述，上述研究提供了证据，证明性别和种族都会影响某些人类病毒感染的自然史和治疗效果。在本研究中，我们发现NCR NKp46表达的种族和性别相关差异与抗病毒细胞溶解活性和基因转录增加相关。我们的数据表明，NK细胞上NKp46的表达模式可以解释HCV自然史和治疗反应的一些差异。NKp46表达与抗HCV活性相关在体外因此可能被证明是一个有用的治疗靶点。
材料和方法
研究人群
这项研究使用了58名非裔美国人（AA，n=29）或白人美国人（CA，n=28）种族中分布均匀的未感染对照受试者。AAs的中位年龄为33.5岁（范围21-62岁），55%为男性。CA受试者的中位年龄为34岁（21-60岁），48%为男性。这项研究是根据赫尔辛基原则进行的：所有患者在参与研究之前都给予了知情的书面同意，并得到了科罗拉多丹佛大学（UCD）机构审查委员会的批准。
样品采集和储存
用细胞制备管从全血中分离外周血单个核细胞（PBMC）（Becton-Dickinson，Franklin Lakes，New Jersey；抗凝柠檬酸钠）。PBMC可以在80%的FBS（马里兰州沃克斯维尔的BioWhittaker）、10%的DMSO和10%的RPMI 1640 Media（纽约州格兰德岛生命科技公司）中冷冻，并储存在液氮中进行后续分析。
检测抗体和抗原表达的FACS分析
使用BD-FACSCanto II或BD-FACScan仪器（BD Biosciences，San Jose，CA）进行四色多参数流式细胞术，并使用Diva™或CellQuest™软件（BD-Biosciences）进行分析。淋巴细胞群体通过其特征性前向散射/侧向散射（fsc:ssc）特性进行鉴定。使用对CD3和CD56特异的荧光标记（PerCP/APC）单克隆抗体（MAb）（BD Biosciences）来鉴定NK（CD3-CD56型+)和NT（CD3+CD56型+)淋巴细胞总数中的细胞。抗NK受体（NKR）抗体（FITC/PE）CD161、CD94、CD95、CD16、CD158a、CD158b、CD158e和NKG2D来自BD Biosciences。抗-NKG2C-PE和TRAIL-PE单克隆抗体从研发系统（明尼阿波利斯，明尼苏达州）购买。抗NKG2A-PE、NKp30-PE、NKp44-PE和NKp46-PE从Immunotech（加利福尼亚州富勒顿市贝克曼·库尔特）获得。Anti-FasL-Pe从eBioscience（加利福尼亚州圣地亚哥）购买。解冻PBMC（1-2×106)在黑暗中4°C下染色30分钟，以检测细胞表面抗原的表达。然后，在含有1%牛血清白蛋白（BSA）和0.01%叠氮化钠的2ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤两次（Facs-Wash），随后固定在200ul 1%多聚甲醛（PFA，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）中。使用同型匹配的对照抗体来确定染色的背景水平。
细胞毒性分析
根据制造商的说明，使用Miltenyi Biotec（德国格拉德巴赫）的NK隔离试剂盒II对解冻的单核细胞悬浮液进行NK富集。在所有病例中，NK的中位纯度>90%。分离后，NK在37°C和5%CO下培养+/-IL-2（25ng/ml，R&D）48小时2培养后，将羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的靶细胞（K562s）添加到NK中，靶浓度为0:1（阴性对照）和10:1（试验），并在37°C下培养4小时。孵育后，使用免疫化学（明尼苏达州布卢明顿）基于流式细胞术的总细胞毒性和凋亡检测试剂盒测量细胞毒性。在获取前，将7-氨基放线菌素D（7-AAD）添加到效应物：靶标（E:T）群体中，并在冰上孵育15分钟。用0.1%Triton-X处理的细胞作为阳性对照。
肝细胞毒性试验
如上所述，使用磁珠富集NK，并对CD3、CD56和NKp46进行表面染色。NK（CD3-CD56型+)使用FACS Aria仪器（BD）根据NKp46的表达对FACS进行分类。Huh 7.5细胞（密苏里州圣路易斯Apath LLC）以1.25×10的浓度接种524孔板中的细胞/孔。24小时后NKp46高的和NKp46低/负NK组分以5 NK与1 Huh 7.5细胞（或1:1）的比例添加。细胞同时感染JFH-1（日本东京国立传染病研究所），MOI=0.01。感染后五天；收集细胞进行RNA提取（RNeasy mini Kit，Qiagen）。使用QuantiTect逆转录试剂盒（Qiagen）将RNA转录到cDNA，并使用7300实时PCR仪器（Applied Biosystems；加利福尼亚州卡尔斯巴德）检测HCV转录物。使用JFH-1质粒储备（范围1×107– 1×101). PCR Taqman Master Mix、引物和探针购自Applied Biosystems。引物和探针序列如下：；HCV转发GCA CAC TCC GCC ATC AAT CAC T；丙型肝炎病毒反向CAC-TCG-CAA-GCG-CCC-TAT-CA；HCV探针6FAM AGG CCT TTC GCA ACC CAA CGC TAC T TAMRA。
TLR响应
从PBMC（n=4）中富集NK细胞，并如上所述染色CD56/CD3和NKp46的表达。根据NKp46的表达，采用FACS分选（Aria，BD）分离NK细胞。在TLR刺激鸡尾酒（100ug/ml poly-IC[TLR3]、5uM洛克索里尼[TLR7]和5uM CpG[TLR9]）存在或不存在的情况下，以100万/ml的浓度培养分类群体6小时。培养后，使用PicoPure™RNA分离试剂盒（加州卡尔斯巴德应用生物系统公司Arcturus）清洗NK细胞并从细胞颗粒中提取RNA。使用Quantitect RT Kit（加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen），在20ul反应中使用500ng RNA转录cDNA。为了在蛋白水平上检测TLR反应，PBMC（n=5）与TLR鸡尾酒培养24小时，并通过流式细胞仪分析评估TRAIL、Fas和Fas-Ligand的细胞表面表达。细胞内流式细胞术染色检测刺激6小时后TNF-α和IFN-γ的反应。在一些实验中，使用细胞因子刺激（IL-12/IL-15）。
实时PCR
使用Step One Plus Real-time PCR系统和Fast SYBR Green Master Mix Protocol（Applied Biosystems）评估基因表达。用于Sybr Green检测的QuantiTect引物检测从Qiagen/Superarray购买。
肝细胞的免疫荧光染色
将Huh 7.5细胞（密苏里州圣路易斯Apath LLC）接种在盖玻片（1.25×10）上524孔板中的细胞/孔）并培养过夜。然后用日本东京国家传染病研究所（JFH-1）以0.01的MOI感染细胞。感染后5天，取下盖玻片，清洗、固定，并用NKp46受体与FITC偶联的fc融合蛋白染色，以检测NKp46-配体的表达。图像是用20倍物镜在恒定曝光下拍摄的。使用同型对照排除背景染色。
统计
结果以中位数（范围）表示。使用非参数Mann-Whitney U比较患者组之间的差异。显著性定义为p值<0.05。使用了JMP 6.0（SAS Institute，Inc，Cary NC）统计软件包。
结果
NKp46表达与女性和白人种族相关：
我们假设NK细胞群体中与种族和性别相关的先天性差异可能解释了慢性病毒感染自然史的改变以及抗病毒治疗的不同治疗反应。为了解决这个问题，我们使用了58名年龄和性别匹配的未感染对照受试者作为队列(). 采用多参数流式细胞术分析14种不同活化和抑制NK受体（NKR）的NK细胞水平和表型。NK细胞总水平无种族或性别差异(). 在我们的四个试验组中，NK细胞的表型非常相似(). 然而，活化的自然细胞毒性受体（NCR）NKp46的NK表达与美国白人（CA）种族和女性密切相关。女性CA的表达显著高于所有其他测试组().
女性和白人中NKp46的高表达采用多参数流式细胞术分析58名正常对照受试者NK细胞上一系列NK受体的表达。在检测的14个受体中，只有天然细胞毒性受体NKp46在供体之间存在显著差异。NKp46在女性（F）白人美国人（CA）组中的表达最高，在男性（M）非裔美国人（AA）组中最低(A类). NKp46表达水平相对增加与女性相关(B类)和白种人(C类).
表1
淋巴细胞分布
| 人口 | F AA公司† | M AA型 | F CA公司 | M CA公司 |
|---|
|
CD56+细胞*
| 17.5 (5.9-26.2)± | 20.35 (7.5-55.66) | 14.8 (6.3-33.95) | 16.32 (3.9-30.12) |
|
自然杀伤细胞*
| 12.2 (4.6-24.2) | 15.01 (6.3-38.64) | 8.8 (2.6-27.81) | 12.25 (3.2-20.6) |
|
CD56型+NT单元格*
| 2.9 (0.73-14.4) | 3.36 (1.55-17.02) | 3.7 (1.2-22.88) | 2.32 (0.4-17.8) |
|
CD56型明亮的挪威克朗*
| 6.61 (2.88-59.77) | 5.7 (0.4-15.15) | 7.56 (0.97-24.06) | 6 (0.93-19.26) |
表2
自然杀伤细胞表型
| 受体* | F AA公司† | M AA型 | F CA公司 | M CA公司 |
|---|
| 纳克30 | 39.1 (12.4-79.67)‡ | 40.16 (2.4-92.92) | 44.4 (15.62-82.79) | 45.3 (16.03-79.1) |
| NKp44号 | 1.5 (0.5-10.1) | 2.8 (1.0-29.79) | 2.35 (1.2-4.43) | 2.51 (0.65-7.3) |
| NKp46号 | 57.6 (13.8-94.04) | 42.18 (10.5-89.48) | 81.64 (49.2-93.34) | 67.49 (33.3-92.88) |
| NKG2A公司 | 51.3 (38.72-84) | 58.5 (20-79.05) | 49.73 (32.4-69.69) | 51.27 (26-66.93) |
| NKG2C公司 | 9.8 (0.8-57.36) | 12.2 (0.5-51.1) | 6.22 (2.06-32.44) | 5.61 (1.62-31.02) |
| NKG2D公司 | 88.2 (60.7-98.82) | 91.02 (48.5-98.4) | 93.5 (40.3-99.23) | 89.24 (55.4-98.11) |
| CD158a型 | 36.4 (8.4-61.93) | 36.84 (9.23-55.69) | 25.8 (5.12-60.23) | 26.59 (9-64.44) |
| CD158b型 | 25.8 (19.84-62.5) | 33 (8.93-50.66) | 32.02 (15.37-49.83) | 26.69 (21.9-49.99) |
| CD158e型 | 9.35 (3.9-21.65) | 13.2 (0-48.7) | 12.22 (0-47.2) | 11.35 (0-27.4) |
| TRAIL（跟踪） | 1.4 (0.6-22.2) | 5.53 (0.75-58.39) | 1.63 (0.68-8.7) | 4.09 (0.52-26.6) |
| Fas公司 | 32.4 (4.1-82.08) | 73.68 (11.2-86.75) | 56.6 (15.5-82.95) | 52.45 (11-80.5) |
| 配体 | 1.3 (0.5-7.9) | 1.9 (0.48-29.92) | 1.4 (0.59-8.42) | 3.11 (0.6-14.4) |
| CD16型 | 79 (37-92.2) | 67.71 (20.1-88.27) | 83.35 (40.53-92.6) | 81.17 (29.8-95.15) |
| CD161型 | 56.7 (18.53-95.44) | 59.84 (22.8-91.39) | 69.9 (12.28-97.34) | 68.22 (22-94.77) |
LAK活性与NKp46表达相关
NK细胞通过细胞溶解机制直接清除病毒感染的细胞；因此，我们使用标准的基于流动的检测方法检测了珠蛋白纯化的NK细胞杀伤NK敏感细胞系K562的能力(29). LAK活性反映了NKp46表达的模式，女性CA活性最高，男性AA最弱。女性NK细胞活性高于男性（35.93%比17%，p=0.0105）。此外，CA受试者的淋巴因子激活杀伤（LAK）活性显著高于AA受试者（39.08%比16.92%，p=0.0004）。NKp46表达与LAK活性呈正相关（p=0.0054），表明NKp45表达增加有助于NK细胞更有效的细胞溶解活性(). 我们通过测试FACS纯化NKp46的能力证实了这一点高/低在IL-2存在（淋巴因子激活杀伤，LAK）或不存在（自然细胞毒性）的情况下，NK细胞亚群可裂解NK细胞敏感靶点（K562）。表达高水平NKp46的NK细胞与NKp45相比，LAK活性增加低的NK细胞。天然细胞毒性无差异（数据未显示）。
LAK活性与NKp46表达相关如材料和方法所述，对K562靶细胞测定白细胞介素2诱导的（25ng/ml）淋巴因子激活杀伤（LAK）活性。LAK活性最高的是女性（F）白人美国人（CA）组，最低的是男性（M）非裔美国人（AA）组(A类). LAK活性相对增加与女性相关(B类)和白种人(C类). LAK活性与NKp46的表达水平直接相关(D类).
NKp46表达与抗病毒NK细胞活性增加有关
由于NKp46对细胞毒性功能很重要，NK细胞上的表达与LAK活性显著相关，我们接下来在更相关的病毒模型中测试NKp45表达的功能意义。我们使用了Huh 7.5 JFH-1在体外HCV感染系统比较FACS分类NKp46的能力低/负和NKp46高的NK细胞亚群减轻HCV对肝细胞的感染。NKp46号高的在该系统中，NKs在控制HCV拷贝数方面比NKp46更有效低的对应物，即使效应物与目标物的比率（E:T）为1:1(). 类似地，在分离的NK细胞上使用激动剂抗体直接连接NKp46，导致在E:T为5:1的Huh-7.5/JFH-1共培养中检测到的HCV拷贝数显著减少().
NKp46表达与抗病毒NK细胞活性增加有关(A类)Huh 7.5 JFH-1在体外感染系统用于评估FACS分类NKp46的疗效低/负和NKp46高的NK细胞亚群减轻HCV对肝细胞的感染。实验一式三份。表达高水平NKp46（白条）的NK细胞在预防Huh 7.5细胞感染方面比NKp30更有效低/负效应器处的对应物（黑色条）：目标比率为1:1或5:1。(B类)使用相同的系统比较用靶向NKp46的激动剂抗体刺激的珠纯化NK细胞减弱感染的能力。在MOI=0.01的对照IgG存在下，Huh 7.5细胞感染会导致5天后出现强烈感染（黑色条）。在缺乏外源性细胞因子的情况下，通过NKp46激活NK细胞可显著降低肝细胞中检测到的HCV拷贝数。
NKp46水平与死亡受体基因和蛋白质的NK细胞表达增加有关
NK细胞表达的TLR通过诱导I型干扰素和炎性细胞因子在早期抗病毒反应中发挥重要作用(19); 因此，我们测试了FACS纯化NKp46的能力高/低NK细胞亚群对刺激的反应通过TLR途径。6小时后通过实时RT-PCR评估NK细胞亚群的基因表达在体外TLR配体刺激。如所示与干扰素-γ基因的表达没有变化相比，NK细胞中表达高水平NKp46的几个与细胞毒性有关的基因上调。在NK细胞亚群中，I型和III型干扰素或SOCS-3的表达没有差异。由于IFN-γ的产生是NK细胞除细胞毒性外的主要功能，我们想评估NKp46的表达是否与NK细胞对细胞因子的反应有关。6小时后通过流式细胞术检测基于NKp46表达的NK细胞亚群中IFN-γ的表达在体外用不同浓度的IL-12和IL-15刺激。刺激后，NKp46的百分比更高高的NKs表达IFN-γ，而NKs低水平表达该受体(). 如前所述(30)，我们没有发现IFN-γ在用激动剂抗体连接NKp46时增强。这些数据表明，在表达高水平NKp46的NK细胞中，产生IFN-γ的能力较高，但并没有通过激活TLR通路或NKp45本身而增强。由于TLR刺激导致NK细胞溶解活性相关基因的上调，我们想看看这种上调在蛋白质水平上是否也明显。在24小时刺激后，通过TLR鸡尾酒或细胞因子刺激，总NK细胞上的Fas蛋白显著上调。也观察到TRAIL上调，但与细胞因子激活相比，TLR刺激在更大程度上上调(). 值得注意的是，在这些培养物中，Fas和TRAIL对NKp46的表达更为显著高的NK细胞亚群与表达低水平NKp46的NK细胞的比较(). 短期（6小时）用TLR鸡尾酒刺激导致TNF-α生成增加，主要是在NK细胞中表达高水平NKp46(). 经TLR刺激后，Fas-L表达无变化（数据未显示）。TLR对NKp46的脱颗粒诱导（CD107a表达）显著升高，表明该基因与蛋白质上调存在功能相关性高的相同培养物中的NK细胞().
NKp46表达与杀伤基因和蛋白质表达增加有关(A类)FACS分选NKp46的6小时刺激高/低含有TLR配体的NK细胞亚群导致编码死亡受体/配体、TRAIL、TNF-α、Fas/Fas-L的基因相对上调，但在表达高水平（NKp46高的). (B类)在存在不同浓度的IL-12和IL-15的短期细胞因子刺激后，通过流式细胞术分析总NK细胞或NK亚群的高或低水平NKp46的表达来评估细胞内IFN-γ的产生。在NKp46高NK细胞亚群中，干扰素-γ的产生更为强劲（*p<0.05，**p<0.001，**p<0.0001）。(C类)用TLR配体或IL-12/IL-15（分别为1ng/ml和10ng/ml）刺激PBMC（n=5）24小时，会导致经TLR激动剂治疗的NK细胞TRAIL在更大程度上上调。(D类)NK细胞对NKp46表达的亚门控性研究表明，Fas和TRAIL的上调主要发生在NKp45高的子集。(E类)用TLR激动剂刺激6小时会导致NK细胞中TNF-α的上调，但在NKp46中上调幅度更大高的NK细胞亚群。(F类)NKp46中TNF-α表达的代表性直方图高/低显示了子集。
TLR刺激诱导NK细胞脱颗粒(A类)流式细胞术分析表明，与对照培养物相比，用TLR配体刺激PBMC（n=5）6小时会导致NK细胞脱颗粒（CD107a表达）增加。对于高水平表达NKp46的NK细胞，与细胞表面分子数量直接相关的平均荧光强度（MFI）明显较高。(B类)NKp46的CD107a表达的代表性直方图高/低显示了子集。
HCV感染上调肝细胞NKp46-Ligand的表达
接下来，利用可溶性NCR-Fc融合蛋白的可用性，我们确定Huh7.5细胞系内的复制是否诱导NKp46配体的上调。如所示HCV感染的肝细胞显示NKp46配体的细胞表面染色模式。虽然未感染的对照肝细胞也对NKp46配体染色阳性，但染色强度要低得多。与感染肝细胞的染色模式相比，NKp46配体染色更为弥漫，并且大部分局限于细胞质。这些数据表明，NKp46配体不仅上调，而且在HCV感染时被转运到细胞表面。
NKp46配体在肝细胞上表达HCV感染的肝细胞显示NKp46配体的细胞表面染色模式。未感染对照肝细胞的NKp46配体也呈阳性染色；然而，染色的强度要低得多。与感染肝细胞的染色模式相比，NKp46配体染色更为弥漫，大部分位于细胞质。这些数据表明，NKp46配体不仅被上调，而且在HCV感染时被转运到细胞表面。图像是用一个20倍的物镜在恒定曝光下拍摄的，是三个独立实验的代表。对于同型对照，未检测到FITC信号。
