界面催化：磷脂酶A的作用机理₂

摘要

磷脂酶A₂（解放军₂)是钙介导的脂-水界面酶反应的范例，因为它对2-酰基具有水解活性（因此命名为a₂)第页，共页L（左）-1,2二酰基磷脂优先针对底物聚集体，如胶束、单层、囊泡或膜。对解放军行动的兴趣₂还来源于其通过从sn-2型磷脂在质膜中的位置。花生四烯酸盐是炎症二十烷介质的前体，包括白三烯、血栓素和前列腺素。秘密解放军₂s为生化和生物物理研究提供了便利，因为它们是坚固的小蛋白质（通常约为120到134个氨基酸），可以很容易地从胰液和蛇和昆虫的毒液中大量纯化。该蛋白很容易在有序晶格中结晶，并已从多种cDNA文库中克隆。其中两个克隆及其突变变异体已经过表达，并进行了生化和晶体学研究(1).

解放军的行动₂已经对其进行了详尽的综述，但对于该酶对层状或胶束底物的强烈偏好的催化细节或分子基础，还没有达成共识。在本文中，我们提出了解放军行动的机制₂我们对结合机制和催化化学的建议主要基于最近报道的两种聚乳酸的2.0Ω晶体结构₂与膦酸盐过渡态类似物的配合物。与PLA形成一个综合体₂中华眼镜蛇的毒液(2)是解放军一个大家族的成员₂被称为I/II类系列(三). 另一个综合体是由进化上分化的解放军形成的₂来自蜂毒(4). 在这两种情况下，抑制剂都是L（左）-1-O（运行）-辛基-2-庚膦基-锡-甘菊-三-磷酸乙醇胺₈（2相）PE(图1).

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图1

(A类)过渡状态模拟，L（左）--我-O（运行）-辛基-2-庚基膦酰基-锡-甘菊-三-磷酸乙醇胺是一类强聚乳酸的短链成员₂Gelb及其同事研究的抑制剂(31,32)其中磷酸盐取代了sn-2型酯。此模拟旨在模拟过渡状态(B类)在l，2-双鞣酰基水解过程中形成-锡-三-磷酸乙醇胺(C类)因此被指定为diC₈（2Ph）PE。diC的构象₈PLA综合体中的（2Ph）PE₂从N.N.阿特拉毒液被用来模拟l，2-双鞣酰基的结构-锡-3-磷酸乙醇胺及其过渡态；酯羰基具有正确的键距和键间角，但它们的位置不一定代表最小能量构象。（C、P、O和N原子分别由黑色球体、大开口球体、小开口球体和条纹球体表示；带星号的球体表示氧阴离子的位置。）

解放军立体化学图₂催化作用是由未受抑制的1.5μl晶体结构完成的N.N.阿特拉酶(图2). 这种结构使我们能够回答与蛋白质及其配体因底物的结合和水解引起的结构调整有关的重要问题。具体来说，这种结构使我们能够看到（i）稳定过渡态络合物包括保持初级钙离子的配位几何结构-两个来自未被抑制酶的钙相关水分子被底物四面体中间体的氧负离子和底物的非桥氧取代信噪比-3磷酸盐；（ii）稳定过渡态可能需要补充额外的正电荷，以中和四面体中间体的氧负离子；以及（iii）骨架中没有优化底物结合或催化所需的构象调整。

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图2

的结构N.N.阿特拉解放军₂; 电子密度图（2F类_o个–F_c（c）)His48从中提取质子的“攻击性”水分子(33). 酶是从粗毒液（迈阿密蛇毒）中提纯的(32). 含有10 mg/ml蛋白质、10 mM氯化钙的液滴（12μl）₂，0.1M二碳酸钠、20%1，4-丁二醇，pH 6.8，镀在塑料盖玻片上，并倒置在含有0.1M二碳酸钠、50%1，4-丁二醇和10%甲醇的1ml储液器上。晶体（0.4毫米×0.2毫米×0.2 mm）属于空间群我4，a=b=93.0奥，和c（c）=22.2Ω，不对称单元中有一个分子。数据分辨率达到1.5º(R（右）_{sym（对称）}=0.05）用两个圣地亚哥多线系统探测器收集；源辐射为石墨-单铬酸盐CuK_α，来自Rigaku 300 x射线发生器的发射。通过分子替换程序梅洛1.5解决了结构问题(34)按说明修改(35). 搜索分子是同一酶的模型，该酶源于其与膦酸盐过渡态类似物复合体的晶体结构(2). 精化容易收敛到R（右）分辨率范围为8.3至1.5º的数据的系数为0.143(F类> 1.5 σ_F类). 平均而言，键长、键角距离和平面度与理想值的偏差分别小于0.016、0.031和0.021Ω。

催化机理

过渡态的形成、稳定和崩溃如图所示图3在这一机制中，我们假设膦酸盐模拟酯化反应的四面体中间产物，其形成、稳定性和生产性崩解是由酶的催化表面促进的。磷酸盐与酶催化功能的相互作用如所示图4其中一个非桥联膦酸氧与活性位点His48的Nδ1氢键结合(34) (5,6)并代表组氨酸从水分子中提取质子所产生的攻击性羟基，该水分子以组氨酸的非抑制形式存在于同一位置N.N.阿特拉蛇毒PLA₂(图2). 在I类/II类PLA的所有高分辨率晶体结构中的这个位置都发现了水分子₂秒(7). 由于没有观察到酰基酶中间体，这种水被用作亲核试剂攻击羰基功能的可能来源(6,8). His48提取的质子(34)距离桥接只有2.6度sn-2型氧，因此它处于理想的位置，可以使这种氧与四面体中间产物的生产性坍塌相协调(9). 膦酸盐面对钙离子的非桥氧代表由底物羰基经亲核攻击形成的四面体中间体的氧负离子，并作为其赤道配体之一与钙离子相互作用。因此，氧阴离子由钙离子和Gly30中的主链酰胺N–H静电稳定(10)同时满足钙配位的几何要求。在催化过程中，氧阴离子、钙离子和攻击性亲核试剂被埋藏在酶的内部，在那里它们与溶剂没有氢键。溶剂进入活性中心的途径有限；最近的固定水分子距离进攻的亲核细胞至少5度。这种将水排除在活性位点之外可能会大大增强稳定过渡状态的静电力。

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图3

催化机理。这里使用第一类/第二类超家族的残留物是为了熟悉。在蜂毒酶中，它们被Asp67、His34和Tyr87取代。尽管Tyr52和Tyr72在I类/II同源超家族中是绝对保守的，但它们未在（B）和（C）中显示。(A类)在生产模式下对结合底物的催化攻击。质子的位置未知，但假设来自其他催化系统(36). (B类)四面体的中间体，当它折叠成产物时。(C类)产品由“生产性崩解”形成。三个水分子移动到活性部位（如箭头所示）以取代产品。一个将与His48的Nδ1结合，其余两个将协调钙离子（一个赤道方向，一个轴向）。

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图4

过渡态模拟物和催化表面之间的界面。(A类)眼镜蛇–蛇毒PLA₂; 没有diC的催化表面₈（2Ph）PE。水标记为W，初级钙离子标记为Ca，攻击性亲核细胞是交叉阴影。(B类)眼镜蛇-蛇毒PLA₂（不对称单位“b”）；P2模拟四面体中间物，P3对应于信噪比-3磷酸盐。不对称单元“a”中的相互作用是相同的，正如Asp49（35）贡献羧酸盐的蜜蜂-乙烯界面一样；钙结合环的残基28（8）、30（10）和32（12）为钙结扎笼提供了主链羰基。原子标识如（A）所示。

没有直接的结构证据，Verheij等。(6)提出了一种与过渡态类似物的结构非常接近的形式机制。我们建议活动站点His48(34)从束缚在Nδ1位置的水分子中提取质子(9). 提取的质子被完美地放置在醇盐离开基团上，以提供低能路径，将四面体中间体的坍塌引向所需产物。酶从攻击的水分子中提取质子时获得的正电荷可能通过扩展的氢键网络（包括His48）稳定下来(34)和Asp99（64）(图2). 然后，可以很容易地“召回”该电荷，用于sn-2型醇盐。

这种立体化学装置使人想起丝氨酸蛋白酶的催化系统。然而，有三个不同之处。首先，在解放军₂只有水可以作为亲核试剂的来源。在丝氨酸蛋白酶中，活性位点丝氨酸被脱质子以在酰化步骤中产生亲核试剂。在丝氨酸蛋白酶机制的脱乙酰化步骤中，几乎任何分散的潜在亲核试剂（如醇或羟胺）都可以攻击酰基酶的羰基。其次，酪氨酸存在于PLA的催化网络中₂; 这两种酶在所有Ⅰ/Ⅱ类酶（Tyr52和Tyr73）中绝对保守。bee-venom PLA的Tyr87₂形成与Tyr52相同的氢键北苏门答腊岛但它的环取向不同，因为它来自一个非相似的主干位点。虽然这些Tyr残基通过在其酚羟基和催化网络的Asp99（64）羧酸盐之间形成氢键来扩展催化网络，但定点突变研究(10)已经表明，这些酪氨酸的主要功能是提供结构支持。通过一个水分子将氨基末端连接到继电器Asp99（64）的Oδ1，催化网络在I/II类家族中进一步扩展(图2). 第三，咪唑环的氢键模式不同。吹(11)指出丝氨酸蛋白酶的催化三联体(12)和胰腺微生物脂肪酶(13)在活性组氨酸的Nε2处提取质子，而催化网络的天冬氨酸羧酸通过Nδ1相互作用。解放军的情况正好相反₂; Nδ1生成亲核试剂，Nε2与Asp99（64）的羧酸盐相互作用。此外，His48之间的相互作用(34)Asp99（64）的羧酸盐在反对的而不是同步器丝氨酸蛋白酶的构象。这一点值得注意，因为反对的孤对是一个较弱的基数（~10⁴折叠）比同步器单线对(14).

钙离子的作用

钙离子对于底物的结合和催化都是必不可少的。图4显示了钙离子辅因子在两个过渡态类似物络合物和非抑制酶中的配位几何。与其他蛋白质中钙结合位点的情况一样(15)，离子由O原子的五边形双锥笼七配位。钙离子通过提供两个连接位置来统一催化和结合：一个赤道位置用于假定四面体中间体中氧阴离子的亲电稳定，另一个轴向位置用于前体-S公司非桥氧信噪比-3磷酸盐。前者降低了过渡态的活化势垒，后者有助于底物结合和手性选择(16). 以无拘无束的形式北阿特拉酶以及其他PLA₂第一类/第二类家庭的结构(7)，底物的氧所使用的位置被两个水分子的氧所占据(17). 当底物发生催化作用时，氧阴离子和信噪比-3磷酸盐夹住钙离子，每一个都从连接笼中置换出一个水分子。将水置换到本体溶剂中应有助于通过熵因子稳定过渡态相互作用。由于水分子的偶极相互作用被更强烈的相互作用所取代，包括基底的正式带电原子，因此也应有焓增益。结构还表明，如果在亲核攻击之前，松脂酯的羰基氧由亲电钙配位，则需要酯旋转出由三角羰基和桥联氧定义的平面。虽然在酯类的情况下，可以容忍由非常规变形引起的应变，但对于含氮类似物，如sn-2型酰胺或氨基甲酸酯。我们认为，由于这些含氮类似物对这种变形具有抵抗力，因此不能以与磷酸盐和酯类相同的生产构象与酶结合。这可能至少部分解释了此类类似物对水解的巨大抵抗力(18).

补充电泳剂

这里描述的机理主要依赖于钙离子中和四面体中间体的氧负离子。然而，Asp49的负电荷和信噪比-3甚至在考虑四面体中间体中的氧负离子的贡献之前，磷酸盐已经中和了钙离子的正电荷。我们发现北阿特拉解放军₂具有第二个完全占据的七配位钙结合位点11位（源自Asp24和Asn119的侧链）。过渡态类似物复合体中不存在该位点；相反，有一种不同的二次钙离子与氧负离子结合4.6º(19). 我们认为钙在酶作用过程中与“新”位置结合，并由O29（与N30形成的肽的羰基氧）协调。从sn-2型我们推断，如图所示图3N30的氨基氢与四面体中间体的假定氧负离子相互作用。因此，新定位的钙离子可以使肽超极化，并实际上将其正电荷直接集中在氧阴离子上。二次钙离子在不对称单元的两个络合物中的出现表明其具有生理意义(20). 初级钙位点的配位几何形状可以为催化提供精确的支架，而由C29–N30肽聚焦的次级钙离子上的电荷可以作为辅助电泳剂来稳定氧阴离子。没有动力学或溶液研究直接关系到这种次生钙离子的功能甚至存在。如果此机制适用于PLA₂，我们应该在其他晶体结构中找到类似的二级钙结合位点，或者在C29–N30肽附近找到其他潜在的可移动正电荷。在这方面，我们注意到牛胰腺PLA的晶体结构₂(21)显示Lys122通过介入的水分子与O29相互作用，从而也使肽极化。Lys122侧链弯曲（Cα到Nζ距离为5.2º。我们没有发现在蜂毒复合物中有补充电泳的证据。

这个信噪比-3取代基对结合亲和力的影响

磷脂的特性很大程度上来源于形成远端部分的性质信噪比-3酯。磷脂酰乙醇胺衍生物是中性膜磷脂的常见成分。在以下情况下北阿特拉解放军₂，diC的氨基₈（2Ph）PE与表面天冬酰胺形成氢键。这种相互作用可能不会与胆碱的季铵基团发生。在蜂胶酶中，与碳水化合物的未精制部分发生类似的相互作用。很难解释信噪比-3PLA上的酯类₂由于磷脂酰酯的性质，底物结合也会影响聚集物的物理化学（如表面电荷电位分布或聚集状态）。

疏水通道：结合底物的进入和稳定

这个sn-1型和sn-2型烷基取代基大致平行于疏水性通道，该通道从催化位置延伸约14º到刚好“高于”氨基末端螺旋（残基1到12）的开口北阿特拉酶和蜂毒酶的功能类似的第三螺旋（残基76到90）(图5). 这个sn-2型与结晶磷脂一样，取代基在四面体膦酸盐处急剧弯曲(22). 然而，与磷脂的晶体结构不同信噪比-3取代基不会在sn-2型酯类，但与酶及其钙离子辅因子形成特定的极性相互作用。两种被抑制酶中的通道壁已被描述(2,4). 这两种复合物中的通道都具有动态特征，我们认为这有助于磷脂从底物聚集体扩散到酶的活性部位，而无需暴露于溶剂。通道的左壁由一个潜在的可移动疏水“瓣”形成，只有在基底被有效地结合后才能牢固地固定。在北阿特拉酶，该壁是Tyr69的环，其酚羟基与抑制剂结合信噪比-3磷酸盐，而磷酸盐又牢固地锚定在初级钙离子上。I/II类家族的一些成员具有Lys69残基，在这种情况下，该侧链的四个亚甲基可能形成通道的疏水性左壁，ε-氨基与信噪比-3磷酸盐。在蜂毒酶中，灵活的左壁由Arg57提供，Arg57也由信噪比-3磷酸盐与钙离子结合。

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图5

diC的配合物₈（2PH）PE带PLA₂第条(A类和B类)眼镜蛇-蛇毒PLA₂（A）范德瓦尔表面，显示磷脂的烷基取代基从表面凸出（红色），并被形成疏水通道“口”的残基[Leu（Val）2、Phe5、Tyr6、Ile9和Trp19]包围，以及被显示为[Tyr（Trp）3和Trp19的残基包围或很可能是界面结合面[Lys6和Arg31]的一部分。非烷基抑制剂元件为蓝色。（B） （A）的骨骼表示；初级钙离子以黄色显示。(C类和D类)蜂胶PLA₂（C）Van der Waal的表面颜色如上所述，但通道口和界面结合表面（绿色）的残留物是根据其与烷基取代基或酶表面或两者的接近程度推测出来的[Ile1、Tyr3、Cys9、His11、Thr56、Arg57、Leu59、Val83、Met86、Tyr87和Ile91]。（D） （C）的骨骼表示；初级钙离子以黄色显示。

界面结合面

如果在两个北阿特拉邦与蜜蜂-乙烯复合物抑制剂的酰基链被延长，以与天然底物的酰基相一致，它们将远远超出酶的表面，其“自由”末端可能仍嵌入聚集体中。通过这种方式，我们推断界面结合面与疏水通道的口相邻(图5). 对于I/II类酶，界面将包括氨基末端螺旋的前半部分、位置19处通常疏水的侧链，以及可能的高度保守的Tyr75。该位置与荧光和化学保护研究一致，表明Trp3和Trp19分别参与与聚集底物的结合(23)也很容易解释为什么胰腺酶能够结合并快速水解聚集的底物(24)依赖于原酶转化为酶过程中产生的新氨基末端螺旋的前半部分。就蜂毒解放军而言₂，第三螺旋（残基76到90）类似于I类/II族的氨基末端螺旋，尽管方向不同，但也会将侧链贡献到界面结合表面[参见(4)].

界面酶作用

解放军₂在脂质-水界面上比在溶液中更为活跃。这种现象被称为“界面活化”。这个术语具有误导性，因为它意味着酶的正常基础功能在遇到聚集物时被激活。当以这种方式观察时，很自然地认为，当酶遇到脂-水界面时，它会经历构象变化或齐聚，或两者兼而有之，从而增强催化活性。然而，解放军₂不具有大多数变构系统的性质；也就是说，这种酶是细胞外的，通常是单体的，非常坚固，其构象由七个二硫键严格维持(7). 声明解放军更准确，因此更有用₂是一种可溶性酶，旨在攻击sn-2型聚集磷脂的酯。其基本活性是结合和消化磷脂的片层和胶束聚集体。对抗单体分散磷脂的活性是一种罕见的细胞事件，构成了一种几乎无关的实验室事件。

显然，我们的被抑制酶的晶体并不能代表真正的界面复合物；事实上，PLA不太可能生长出晶体₂-浓缩底物络合物，其有序性足以揭示催化细节。然而，出于以下原因，我们认为我们的过渡态类似物复合物呈现出的结构为界面脂肪分解机制提供了新的见解。

一种普遍的观点是，界面结合诱导蛋白质发生有利的变构转变：结构证据反驳了这一观点。首先，PLA的高分辨率晶体结构₂已经表明，无论进化分歧程度、齐聚状态、离子强度或结晶条件的pH值如何，催化表面都是完全相同的。其次，如果比较活性位点在抑制形式的不对称单元中的两种表示北阿特拉邦酶与蜂毒酶晶体复合物中的酶、催化机制和抑制剂与催化表面接触的部分基本相同。在三种不同的晶体环境中，极不可能有三种相同的排列（其中一种涉及差异很大的进化同源物），除非这种排列代表了过渡状态和酶之间最稳定的，因此也是最佳的相互作用。自由形式的比较北阿特拉晶体不对称单元中含有两个过渡态类似物复合体的酶表明，蛋白质骨架和初级钙位点实际上是重叠的。如果过渡态抑制剂的结构代表了最佳的结合生产模式，那么不需要改变蛋白质骨架或其初级钙位点的构象即可实现这种最佳模式。

第三，在未受抑制的PLA的所有精细、高分辨率晶体结构中，四种水分子中有三种始终与催化表面结合₂被过渡态类似物的O原子取代，完美地保持了钙离子的五角双锥配位(25). 完美的立体化学匹配表明，这是一个旨在优化酶真正生理作用的特征，即在胶束或片层聚集体中浓缩的磷脂水解期间稳定过渡状态。事实上，这些水分子的置换（如上所述）所提供的热力学优势似乎需要在催化表面上保持恒定的立体化学，而不是变构变化。

当然，界面可以通过改变底物或辅因子的结合来影响催化作用。例如，可能的是信噪比-3磷酸盐受附近底物分子的存在或界面介导酶低聚物的形成的影响。一些动力学研究与PLA的模型兼容₂在界面上形成二聚体或高阶低聚物，以显示出充分的酶活性(26). 然而，酶聚集的作用不是强制性的，因为在高催化活性期间，相同的酶不会在阴离子囊泡上形成低聚物(27). 无论如何，我们对PLA的晶体学研究中没有任何内容₂-diC公司₈（2Ph）PE复合物表明二聚化如何增强活性。

在活性部位没有变构调制的情况下，界面结合如何“提高”PLA的效率₂催化作用？晶体结构表明，催化事件发生在刚性的内表面上，该内表面与本体溶剂很好地屏蔽。在我们对疏水通道和界面识别表面的讨论中，我们认为，经过水解的磷脂分子离开聚集物，通过疏水通道的促进扩散到达催化表面，疏水通道的开口位于界面结合表面(图6). 有两个因素促进了这种扩散并优化了催化作用。首先，复合物中底物的构象与晶体聚集体中的构象相似(22)以及胶束中磷脂的核磁共振实验推断的结果(28). 这表明，实现基板转移到生产模式结合部位不需要显著变形。本质上，这种酶进化出了一种特异性机制，可以选择聚集体施加在磷脂上的构象(7,29,30)并且只有能够遵循该通路的底物被适当地定位用于催化。这一观点与共价约束底物的研究相一致，该研究表明底物聚集对磷脂施加了对PLA完全敏感所需的构象₂行动(7,29). 因此，受磷脂聚集影响的是底物的构象，而不是酶的结构。其次，我们设想，由于界面结合提供的“密封”，底物通过疏水通道转移到活性中心时，不会发生疏水烷基取代基的溶剂化(图6). 除了没有扭转应变外，在磷脂从聚集物转移到其结合位点的过程中，也没有溶剂化效应来提高自由能。

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图6

PLA之间有效交互的示意图₂和聚集基质。

因此，晶体结构表明磷脂通过疏水通道从底物聚集物向催化表面进行等结构、去溶剂化和推测等能量转移，疏水通道的开口与脂质-水界面相连。此访问模式是最佳酶作用所必需的，只能在界面上发生。可溶性和分散的磷脂无法利用这些特性。

致谢

脚注

参与者信息

大卫·L·斯科特，耶鲁大学分子生物物理与生物化学系和霍华德·休斯医学院，纽黑文，CT 06511。

史蒂文·怀特，耶鲁大学分子生物物理与生物化学系和霍华德·休斯医学院，纽黑文，CT 06511。

兹比塞克·奥特温诺夫斯基，耶鲁大学分子生物物理与生物化学系和霍华德·休斯医学院，纽黑文，CT 06511。

魏源，华盛顿大学化学系和生物化学系，华盛顿州西雅图98195。

Michael H.Gelb，华盛顿大学化学和生物化学系，西雅图，WA 98195。

Paul B.Sigler，耶鲁大学分子生物物理与生物化学系和霍华德·休斯医学院，纽黑文，CT 06511。

参考文件和注释