1α，25二羟维生素对树突状细胞的调节D类_三及其类似物：维生素D受体依赖途径促进持续的不成熟状态体外和体内

摘要

树突状细胞（DC）发挥作用在协调细胞对自身和外来抗原。发生在获取抗原会导致MHC/肽的上调DC表面和分泌中的共刺激配体免疫调节细胞因子。在成熟状态下，DC准备以抗原特异的方式激活T细胞。DC成熟不是，然而，抗原获取的结果就其本身而言.暴露于组织微环境中的物质调节DC成熟事件。诱导DC成熟的因素包括致病微生物的成分，由实质细胞和巨噬细胞，并与活化的T细胞接触(1–6). 保存处于不成熟状态的DC是否会导致由于缺乏成熟的刺激或也被积极地维持未知。

我们已经报道了添加1α，25-二羟基维生素D类_三[1α，25（OH）₂D类_三（该维生素D的活性形式_三)]至在里面体外细胞因子驱动的小鼠骨髓培养结果抑制DC成熟。类似于1α，25（OH）₂D类_三[1α，25（OH）₂-16-烯-23-基-26,27-六氟-19-或-维特曼D类_三，后简称D类_三模拟]在浓度降低100倍。影响1α，25（OH）₂D类_三和D类_三骨髓培养缺乏类似物从1α，25（OH）₂D类_三受体（VDR）缺乏小鼠，并且不会导致DC总数(7). 我们在这里证明DC受到D类_三模拟抗后续成熟刺激和介导耐受性免疫反应在里面活泼地此外，我们提供的证据表明1α，25（OH）₂D类_三/视频数据记录器复合物有助于DC稳态体内.

材料和方法

结果

骨髓培养物的10倍调节⁻¹⁰M（M）D类_三未成熟表型积累的模拟结果DC。

图。​图11显示了来自第7天骨髓培养。如果没有D_三类比大多数细胞具有较高的前向散射CD11c，高水平结合CD80/CD86配体（CTLA-4Ig）（图。​（图11A类). 低前向散射细胞较少，也是CD11c^{+ve（虚拟）}，并表示中度至高水平的CD80/CD86。在D中_三含类似物培养优势细胞为低前向细胞CD80/CD86低到中等水平的散射。高向前散射细胞数量较少，CD80/CD86水平较低与未经处理培养的细胞相比。无条件条款DC和D_三模拟调节DC为随后用于描述缺席或在场时生成的DC第页，共页D_三模拟。

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图1

(A类)来自第7天小鼠骨髓培养物的细胞和不带10⁻¹⁰M月D日_三模拟物被染色CD11c（αCD11c）和CD80/CD86（mCTLA-4Ig）。无条件跟单信用证低前向散射（1号）表示中到高水平的CD80/CD86，而高前向散射细胞（2号）表达高CD80/CD86水平。D类_三低水平模拟调节细胞前向散射（no.3）表示中低水平的CD80/CD86，而高前向散射单元(4)数量较少并且主要表达CD80/CD86的中间水平。(B类)第6天产生或不产生D的DC_三在有无D_三类似物、IL-12p40和TGF-β1用ELISA检测。D类_三分泌的类似条件DCIL-12p40明显低于非条件DC(上部,P（P）<0.05）而TGF-β1水平没有两个群体之间存在显著差异(下部). 添加D_三模拟到无条件DC也导致IL-12p40的中度降低生产。结果代表三个或六个的平均值±标准差每种条件下的上清液样本。转化生长因子-β1略有增加添加D后无条件DC的生产_三模拟在这个实验中，没有统计学意义，也不是可重复的发现。

来自无条件和D的上清液_三分析模拟条件下DC的IL-12 p40和TGF-β1（图。​（图11B类). IL-12 p40的基础分泌D类_三模拟条件下的DC显著减少与无条件DC相比，无论模拟与否在最后48小时存在。基础IL-12 p40的减少在48小时后还观察到非条件DC的分泌暴露于D_三模拟。尽管1α，25（OH）₂D类_三已经是据报道在一些细胞系中诱导TGF-β(10,11)，没有TGF-β1分泌存在显著差异。类似结果如下在多项IL-12 p40实验中观察到实验）和TGF-β1（另外两个实验）分泌两个DC群体。

D类_三模拟条件DC对成熟型DC有抵抗力刺激。

进行了实验，其中DC在存在或D缺失_三类似的，经过额外的成熟刺激（图。​（图2）。2). 图。​图22 A类和B类证明CD40交联对来自VDR WT和VDR KO小鼠。将Anti-CD40添加到无条件和D类_三模拟条件下的DCD类_三模拟。48小时后DC成熟通过分析CD80/CD86的表面表达进行评估（图。​（图22A类)并通过测量IL-12 p40分泌（图。​（图22B类). 对于非条件野生型DC抗CD40导致CD80/CD86的表达显著增加IL-12 p40分泌。D类_三模拟调节DC表达出较低水平的CD80/CD86，即使在退出模拟添加抗CD40。IL-12 p40分泌在CD40结扎。VDR缺乏的DC对CD40结扎反应相似形成野生型DC，但未观察到抑制作用D类_三模拟调节。图。​图22 C类和D类举例说明了实验结果，其中无条件或D_三模拟条件DC为暴露于不同浓度的MCM或LPS中D类_三模拟。通过表面评估成熟度MCM和LPS刺激后CD80/CD86的表达。无条件DC的CD80/CD86表达显著增加暴露于低浓度MCM和LPS。相反，D类_三模拟条件下的DC未显示在MCM和LPS浓度下，CD80/CD86上调。D依赖LPS分泌IL-12 p40_三类似条件下的DC也被抑制（数据未显示）。

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图2

(A类和B类)使用生成的第6天DC或不带D_三VDR WT和VDR KO小鼠的类似物为在有或无抗CD40。48小时后进行流式细胞术分析用CD80/CD86的中值荧光强度（MFI）表示CD11c公司^{+ve（虚拟）}单元格(A类). IL-12 p40的ELISA是48小时后在培养上清液上进行(B类).WT和KO非条件DC均显示CD80/CD86增加表达和IL-12 p40分泌抗CD40。D类_三模拟条件下的WT DC未能显著上调调节CD40交联后CD80/CD86的表达和IL-12 p40的分泌而D_三模拟条件下KO DC对无条件跟单信用证。(C类和D类)第6天无条件或D_三B6小鼠的类似条件DC培养48小时，无需额外刺激每个MCM的浓度(C类12.5%和50%最终体积）或LPS(D类10和50纳克/毫升）。显示结果CD11c对CD80/CD86的MFI^{+ve（虚拟）}细胞。无条件跟单信用证对两种低浓度刺激的反应显著增加CD80/CD86表达。D类_三模拟调节的DC的CD80/CD86基础表达较低即使二者浓度较高，也会显著增加刺激。*，P（P）与相比<0.05来自同一人群的未刺激细胞；†，P（P）与未经处理的DC相比<0.05。

通过使用CD40结扎（三个附加实验）、MCM（两个附加实验）和LPS刺激（另外三个实验），结果一致。对于D类_三模拟调节DC，添加D类_三刺激期间的模拟不一致导致进一步抑制（数据未显示）。我们的结论是小鼠DC的分化D类_三模拟导致不成熟状态在退出模拟和接触不同的成熟刺激。

维生素D_三模拟条件DC无法敏化雌性宿主对雄性抗原的反应并促进后续抗原的接受男性皮肤移植。

比较无条件和D类_三模拟调节DC体内，我们使用了DC使雌性小鼠对次要抗原敏感的模型系统由同基因雄性细胞表达（图。​（图3）。三). 男性B6脾细胞标记有一种荧光染料，接种到雄性或雌性B6小鼠体内(12). 流量用于定量标记的PBL的细胞学分析细胞。序列分析显示，雄性细胞被雌性在接种后19天内被保留在雄性的恒定水平。给雌性小鼠接种10⁵男性DC在移植前7天导致加速消除，在第2天清除大部分细胞。我们测试是否为D_三模拟调节男性B6 DC也会使雌性B6小鼠预致敏（图。​（图44A类). 五组女性用10⁵无条件或D类_三模拟调节男性DC并移植雄性细胞7天后。对照组由天真的人组成雌性和雄性。脾细胞移植后两天，PBL分析在用未经治疗的男性DC，但未经预处理的DCD类_三模拟条件DC。

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图3

一组五只雄性B6小鼠和两组五只雌性B6小鼠接种CFSE标记的男性B6脾细胞。另一个雌性B6小鼠组接受3×10⁷CFSE标记BALB/c小鼠脾细胞。标记细胞的持久性为通过PBLs的顺序流式细胞术分析确定并表达作为总单元格的%(插入). 男性收件人和一名雌性受体组雄性细胞未经预处理。A类第二组接受男性细胞的女性10⁵脾细胞前7天静脉注射未经处理的男性B6 DCs接种。BALB/c细胞的受体未接受任何预处理。尽管男性受试者保留了固定比例的标签在19天的时间内，女性受试者消除了标记的细胞在第7天和第19天之间。非条件雄性树突状细胞的预处理导致雄性细胞加速清除，与消除BALB/c细胞。*，P（P）< 0.05与男性组相比。

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图4

(A类)一组五名男性B6和三组五名雌性B6小鼠接种CFSE标记的雄性B6脾细胞。两天后对移植细胞进行定量。结果表示为每组的平均值±SD。拥有未接受预处理组分别为3.15±0.54%和3.70±0.75%CFSE^{+ve（虚拟）}单元格，分别(P（P）=0.2). 雌性在7天前接种了10粒⁵未经治疗的男性B6 DC的CFSE为0.67±0.20%^{+ve（虚拟）}单元格(P（P）=0.0002与男性相比组）。雌性预先接种10⁵D类_三模拟条件下DC的CFSE为2.54±0.50%^{+ve（虚拟）}单元格(P（P）=0.1（与男性对男性组相比）。(B类)10只雌性B6小鼠接受10⁵D类_三7天后，接受模拟条件治疗的男性B6树突状细胞CFSE标记的雄性B6脾细胞。由五名女性B6组成的对照组小鼠接受标记的脾细胞，无需预先接种DC。这个CFSE的百分比^{+ve（虚拟）}16天后测定PBL每只动物(居中). 10只动物中有6只预先接种带D_三模拟条件下DC的标记细胞水平大于对照组。七天后，所有动物与男性B6皮肤移植，并确定移植排斥反应的时间(赖特). 对照组拒绝男性皮肤移植移植后15至19天。10只DC处理动物中的6只无限期保留皮肤移植（>100天），而剩余的移植后11至27天内有4例移植物被排斥。不确定皮肤移植存活与男性长期滞留相关预接种D组脾细胞_三模拟条件DC。

在随后的实验中（图。​（图44B类)，10只雌性预先接种D_三模拟调节男性DC并测定了雄性脾细胞移植物的持久性，直到被天真的对照组淘汰的时间。此时此刻点（第16天）预处理组60%保留雄性细胞，这不仅表明未能敏化，而且表明响应。然后用B6雄性皮肤移植动物。控件该组平均17天时均拒绝男性皮肤。在最初用D预处理的组_三然而，模拟条件下的男性DC，无限期男性皮肤移植10只动物中有6只存活（>100天）。皮肤延长移植物存活与男性脾细胞滞留时间延长相关。用无条件雄性DC对雌性动物进行预处理会导致随后的男性皮肤移植物的加速排斥反应（数据未显示）。

缺乏维生素D受体导致淋巴结DC在体内.

我们对D效应的观察_三模拟开启体外-衍生树突状细胞提示其生理作用1α，25（OH）₂D类_三/直流VDR平衡体内因此，我们分析了成熟度年龄匹配的VDR对淋巴结和脾脏DC中的标记物WT和VDR KO小鼠。我们绘制了6对年龄匹配的WT和KO（6和12周龄），用于淋巴细胞的比较分析器官。每对在单独的时间进行分析。皮下淋巴VDR KO动物的淋巴结总是比WT动物的大（图。​（图55A类). 脾脏大小没有两组之间存在差异（未显示数据）。流动的结果皮下淋巴结和脾脏的细胞学分析总结如图。​图55B类。虽然细胞的比例是CD11c^{+ve（虚拟）}没有显著差异WT和KO动物之间，通过CD11c公司^{+ve（虚拟）}II类MHC电池（I-A）^b条)CD40和CD80/CD86配对分析显示VDR KO小鼠淋巴结中的高表达(P（P）分别为0.01、0.003、0.03）。未配对时分析MHC II类和CD40表达的差异仍具有统计显著性(P（P）=0.016，以及分别为0.012），而CD80/CD86表达的差异没有达到显著性(P（P）= 0.33). 相反，II类MHC和CD40的脾脏DC表达在这两个组。DC成熟标记的表达增加主要是大（高）比例增加的结果前向散射），II类MHC^你好DC（图。​（图55C类).

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图5

VDR WT和VDR对皮下淋巴结和脾脏DC的分析6至12周龄的KO小鼠。(A类)淋巴结来自KO小鼠均大于WT小鼠（典型示例来自一对动物）。(B类)双色流式细胞术淋巴结（○）和脾脏分析（●）来自六个单独分析的WT和KO的细胞使用CD11c、II类MHC（I-A）着色剂配对^b条)，CD40，和CD80/CD86。行连接每个的WT和KO成员的值单个配对。P（P）成对值和非成对值WT和KO动物之间的差异分析为：淋巴节点-%CD11c^{+ve（虚拟）}(P（P）=0.6和0.77），I-A公司^b条货币金融机构(P（P）=0.01和0.016），CD40 MFI(P（P）=0.003和0.012），CD80/CD86 MFI(P（P）=0.03和0.33）；脾脏-%CD11c^{+ve（虚拟）}(P（P）=0.05和0.18），I-A^b条货币金融机构(P（P）=0.4和0.7），CD40 MFI(P（P）=0.3和0.8），CD80/CD86 MFI(P（P）=0.05和0.06). (C类)流式细胞术示例VDR WT和KO对淋巴结细胞的分析。二级MHC（I-A）^b条)CD11c表达^{+ve（虚拟）}显示单元格。CD11c内^{+ve（虚拟）}来自两种动物种群的细胞具有低、中、高表达的I-A^b条是存在。对于KO动物，I-A^b条高位单元格（环绕）代表主要人口的相对减少I-A公司^b条与WT相比的中低电池动物。

讨论

影响1α，25（OH）₂D类_三论免疫功能一直是众多报道的主题(13–22). 直接T细胞和巨噬细胞/单核细胞的调节1α，25（OH）₂D类_三已经是记录在案的体外(13–15). 免疫抑制作用1α，25（OH）₂D类_三和相关类比也有文献记载体内在动物模型中免疫介导疾病，如实验性自身免疫性疾病脑脊髓炎、自身免疫性糖尿病和同种异体移植排斥反应(16–20). 最近1α，25（OH）₂D类_三在DC上人类的分化和成熟也已被证实和小鼠培养系统(7,21,22). 这些发现提出了重要的关于1α，25（OH）₂D类_三-有条件的DC的生理作用1α，25（OH）₂D类_三/直流VDR体内平衡和控制DC的分子机制分化和成熟。在本报告中，我们使用了一个模拟1α，25（OH）₂D类_三延长我们之前和其他人对抑制作用的观察1α，25（OH）₂D类_三/视频数据记录器DC成熟途径。该模拟具有相同的VDR依赖性体外对母体化合物的影响降低100倍浓度(7).

相比之下1α，25（OH）₂D类_三在某个单元格上类型(15,23)，骨髓中DC的生成不会受到以下因素的影响1α，25（OH）₂D类_三尽管是成熟进程减弱。重要的是，我们发现D类_三模拟条件DC未进展为提取D后的更高到期水平_三模拟并对成熟表现出明显的迟钝反应信号。这一观察结果与皮耶蒙蒂等。(22)用于现场产生的人类DC1α，25（OH）₂D类_三之后LPS或CD40结扎刺激。此外，我们还发现接触MCM不会导致D类_三成熟表型的类似条件DC，进一步强调缺陷涉及多个途径和暗示着1α，25（OH）₂D类_三/视频数据记录器调节功能重要的基因表达谱。影响1α，25（OH）₂D类_三及其DC培养物的类似物与沃尔特曼报告的相似et（等）阿尔。(24)地塞米松对人DC的作用。这些作者发现，然而，早期添加地塞米松导致直流发电。IL-10和环孢菌素也被发现可以减弱DC到期日体外但观察到的效果不是对成熟刺激有抵抗力(25,26). 作为1α，25（OH）₂D类_三已经是在许多细胞系中诱导TGF-β的表达TGF-β1对DC成熟产生负面影响体外文化(10,11,27)，我们的观察结果可能解释为转化生长因子β1的诱导。然而，我们观察到没有一致的差异通过无条件或D分泌TGF-β1_三模拟调节DC。The influences of the1α，25（OH）₂D类_三/视频数据记录器因此，DC成熟的途径在生理上是不同的可能会为体内免疫疗法而不是其他抗原提呈细胞修饰剂。

我们的结果与体内-敏化特性无条件或D_三模拟调节DC强调直流调制在发展中的潜在作用免疫疗法。用于肿瘤的管理和疫苗，抗原与辅助信号的协同传递DC成熟已经产生了有希望的结果(28,29). 在以下情况下据报道，移植排斥、不成熟的表型DC有利于延长同种异体移植物存活时间(30,31). 在如所示的实验中图。​图44B类以及其他体内实验（数据未显示），预接种D类_三模拟条件下的DC发现但并非一成不变。在实验动物可能反映出少数D内的成熟DC_三模拟条件培养或者是“敏感化”和T细胞/未成熟DC相互作用期间的“耐受”途径。1α，25（OH）的研究₂D类_三以及减轻同种异体排斥反应的相关类似物已经证明与钙调神经磷酸酶抑制剂、霉酚酸酯和西罗莫司(20). 免疫治疗策略使用1α，25（OH）₂D类_三-有条件的DC或系统D_三因此，类比可以证明与额外的DC或T细胞调制器一起使用时最有效。这个“耐受性”表现的一般观察外周淋巴器官内DC的同种抗原可以改变随后的抗原特异性反应是有希望永久植入同种异体或异种组织可能是可行的。

尽管在体外-生成的DC被接受为有效研究DC功能特性的系统重要的是要认识到文化条件不能重演体内DC群体的生理学。因此，我们寻求获得生理作用的直接证据1α，25（OH）₂D类_三/VDR输入调节直流功能。我们发现淋巴结肥大和VDR KO小鼠皮下淋巴结中成熟表型DC过多与免疫稳态失调相一致动物。有趣的是，脾脏或肠系膜淋巴结（未发表的观察结果），表明这一观察结果并不次于像may这样的系统过程由这些动物的代谢或营养异常引起(8).

免疫学局限性的另一种解释异常是体内组织抗原的异常表达哪些DC局部暴露于1α，25（OH）₂D类_三。视图免疫稳态被提出，不成熟树突状细胞持续存在健康组织中的样本抗原及其“交叉存在”T细胞耐受方式(32). 目前没有直接VDR KO动物自身免疫性疾病发病率增加的证据疾病。然而，VDR的非免疫特性可能缺乏掩盖了这种表现和小鼠的产生只有免疫室对1α，25（OH）₂D类_三将必须明确解决这个问题。一个很难理解的VDR-KO表型的特征是在4个月大时，广泛脱发(8). 用于免疫分析的动物轻微至轻度脱发，因此，淋巴结肥大不是可能继发于晚期皮肤病。另一种选择可能是本地生成的对DC成熟度的抑制1α，25（OH）₂D类_三在皮肤上可能是局部免疫耐受的重要因素。有支持角色的证据1α，25（OH）₂D类_三在里面调节皮肤中的抗原呈递细胞。暴露于紫外线后光，皮肤合成胆钙化醇和紫外线照射皮肤在皮内抗原暴露期间可产生抗原特异性公差(23,33,34). 此外，角质形成细胞能够生成1α，25（OH）₂D类_三,表明该化合物在皮肤(15,23). 最后，局部应用1α，25（OH）₂D类_三类似钙三醇抑制T细胞介导的皮肤病牛皮癣(34).

总之，我们发现1α，25（OH）₂D类_三/DC上的VDR成熟导致一种不易形成的独特表型状态被成熟刺激逆转，与改变抗原特异性免疫反应体内，并可以播放在调节免疫稳态中发挥重要作用。我们建议正在进行的研究“负面”和单个组织中DC成熟的“积极”调节可能提高我们对组织特异性免疫耐受和允许设计新的自身免疫治疗方法疾病、肿瘤和异体移植。

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