实验医学。2011年11月至12月；2(6): 1035–1040.
脂联素抑制非酒精性脂肪性肝炎患者的内质网应激
,1 ,1 ,2 ,2 ,2 ,2 ,三 ,三 ,三 ,三 ,三和2
TAKATO UENO公司
1库鲁姆大学创新癌症治疗研究中心；
岩本秀树
三福冈库鲁梅市库鲁梅大学医学院医学系消化科，日本
TORU NAKAMURA公司
三福冈库鲁梅市库鲁梅大学医学院医学系消化科，日本
HIRONORI KOGA公司
三福冈库鲁梅市库鲁梅大学医学院医学系消化科，日本
鸟村拓二
三福冈库鲁梅市库鲁梅大学医学院医学系消化科，日本
MICHIO SATA公司
三福冈库鲁梅市库鲁梅大学医学院医学系消化科，日本
1库鲁姆大学创新癌症治疗研究中心；
2内分泌和代谢科
三福冈库鲁梅市库鲁梅大学医学院医学系消化科，日本
收到日期：2011年7月24日；2011年8月22日接受。
摘要
在本研究中，我们使用脂肪组织中表达nSREBP-1c的雄性转基因小鼠、肝脏中表达人脂联素的nSREB-1-c/脂联素双转基因小鼠和野生型雄性小鼠作为对照，检测脂联素是否抑制非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的内质网（ER）应激。在30周龄的nSREBP-1c转基因小鼠的肝脏中观察到类似于NASH患者肝脏标本中观察到的组织学结果。相反，在年龄匹配的nSREBP1c/脂联素双转基因小鼠中，NASH样肝组织学显著减弱。nSREBP-1c/脂联素双转基因小鼠的肝脏中产生了人脂联素，循环中的人脂联蛋白水平恢复。人脂联素信使核糖核酸（mRNA）在nSREBP-1c/脂联素双转基因小鼠肝脏中表达，但脂联素受体1和2 mRNA在肝脏中表达正常。与nSREBP-1c转基因小鼠相比，nSREBP-1c/脂联素双转基因小鼠的肝脏中TNFαmRNA减少。nSREBP-1c/脂联素双转基因小鼠肝组织中X-盒结合蛋白-1、激活转录因子4、乙酰辅酶A羧化酶、TNFα和NFκB的蛋白表达下调。三组小鼠脂联素和激活转录因子6的表达几乎相同。与nSREBP-1c转基因小鼠相比，nSREBP-1c/脂联素双转基因小鼠的餐后血糖水平显著降低。这些结果表明，肝脏中表达的脂联素可抑制内质网应激，减轻NASH患者的肝脏脂肪变性、炎症和胰岛素抵抗。脂联素可能为人类NASH的新疗法开辟道路。
关键词：非酒精性脂肪性肝炎、脂联素、内质网应激
介绍
肝脏通过控制脂质的合成、氧化、运输和排泄，在全身脂质代谢中起着核心作用。未折叠蛋白反应（UPR）被鉴定为一种被内质网（ER）应激激活的信号转导系统(1). 内质网应激和UPR激活与许多人类疾病有关，包括肥胖、2型糖尿病和癌症(2). 此外，Rutkowski等表明未解决的内质网应激会导致代谢功能障碍和肝脂肪变性(三).
UPR是一种发自内质网的信号系统，当内质网蛋白折叠受到干扰时被激活(4). 先前的研究揭示了哺乳动物UPR的多种新功能，包括其在肝脏脂质代谢中的作用(三). 脂肪性肝病中观察到UPR激活，提示在这些情况下内质网应激的诱导(5). 先前的研究表明，内质网应激激活固醇调节元件结合蛋白（SREBPs），这些转录因子参与从头开始脂质生物合成(6). SREBPs在胆固醇代谢和低密度脂蛋白受体表达（SREBP-2）以及脂肪酸和甘油三酯生物合成（SREBP-1）中发挥重要作用(7). 我们以前曾报道，在aP2启动子（一种具有胰岛素抵抗和脂肪酸的遗传性脂肪营养不良模型）的控制下，脂肪组织中表达核SREBP-1c（nSREB-1c）的转基因小鼠自发发展为脂肪性肝炎(8).
脂联素是一种主要由脂肪组织产生的激素(9). 实验研究表明，脂联素在胰岛素抵抗的病理生理学以及胰岛素敏感性组织的代谢性脂质储存和脂解中起着重要作用，这可能导致脂肪组织向肝脏的游离脂肪酸流量增加，并导致脂肪变性(10). 脂联素在胰岛素抵抗和代谢综合征的病理生理学中起着重要作用。
我们以前曾报道，nSREBP-1c/脂联素双转基因小鼠的肝脏中脂联素转基因表达，年龄匹配的双转基因小鼠中非酒精性脂肪性肝炎（NASH）样肝损伤显著减轻(11). 此外，Awazawa等显示脂联素抑制脂联素受体1/LKB1/AMPK依赖途径中肝脏SREBP1c的表达(12). 在本研究中，我们检测了脂联素是否抑制NASH的内质网应激。
材料和方法
nSREBP-1c转基因小鼠和nSREBP-1c/脂联素双转基因小鼠的制备
脂肪组织中表达nSREBP-1c的转基因小鼠（C57BL/6背景）(13)购自Jackson Laboratory（美国ME巴尔港），并在我们的实验室中与野生型C57BL/6小鼠（日本静冈Nippon Clea）杂交繁殖。先前描述了在C57BL/6背景小鼠的肝脏中表达全长人脂联素的转基因小鼠的产生(14). 将脂肪组织中表达nSREBP-1c的雌性小鼠与表达脂联素的雄性小鼠杂交，获得nSREB-1-c/脂联素双转基因系。用nSREBP-1c特异性引物（5′-CTA CATTCGCTTTGCAAC-3′和5′-ATAGAGGACACC TAGTCAG-3′）和人脂联素转基因特异性引子（5′-TGAATTCGGCTCCAGGCTGTTGCT-3′和5’-AGAGCCTTGCAGTGAT-3′）对双转基因小鼠进行尾部DNA聚合酶链反应（PCR）鉴定。nSREBP-1c和人类脂联素杂合雄性小鼠用于以下实验。所有小鼠均喂食标准的小鼠饲料（347 kcal/100g，蛋白质24.9 g/100g，脂肪4.6 g/100g；日本Clea）和水随意.在献祭前测量了体重。所有程序均由久留梅大学医学院动物实验伦理审查委员会批准。
生化分析
分别使用过氧化物酶、脂蛋白脂肪酶和胆固醇氧化酶分光光度酶分析法测定天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶、甘油三酯和总胆固醇水平（日本大阪Wako有限公司）。采用腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）评估葡萄糖耐量。IPGTT是通过向熬夜的小鼠腹腔注射葡萄糖（10%溶液中的1 g/kg）进行的。在注射葡萄糖后0、30、60和120分钟，使用Free Style（日本大阪Nipro）的葡萄糖脱氢酶法测量从尾静脉获得的血液中的葡萄糖水平。分别使用来自R&D（英国Oxon）和AdipoGen（韩国首尔）的酶联免疫吸附试剂盒测量小鼠瘦素和脂联素的血清水平。
光学显微镜
用苏木精和伊红对肝脏石蜡包埋切片进行标准显微镜或Azan-Mallory染色，以观察肝组织中细胞外基质的位置。肝脏病理学家对标本进行了检查。为了进行比较分析，每个标本被分配到以下组织学亚组之一：1型，仅脂肪肝，在33%以上的小叶中以大囊泡为主；2型，脂肪堆积和小叶炎症；3型，脂肪堆积和肝细胞膨胀；4型，脂肪堆积，肝细胞膨胀，马洛里氏透明或纤维化。我们将3型和4型视为NASH，正如Matteoni之前所描述的那样等(5).
电子显微镜
传代和低温保存的HSC在4°C的1%戊二醛中固定1h，在4°C的1%锇酸中后固定1h、用乙醇脱水并包埋。然后切片并用柠檬酸铅染色。然后在电子显微镜下观察样品（H-7650，日本东京日立）。
实时PCR分析
对于实时定量PCR，使用7000序列检测系统ABI Prism序列检测器（Applied Biosystems，Tokyo，Japan）和双链特异性染料SYBR Green（Applied Biosystems）测定小鼠脂联素和AdipoR1和2以及人脂联素的信使核糖核酸（mRNA）水平。PCR条件和周期如下：初始DNA在95℃下变性10分钟，然后在95℃变性40个周期15秒，然后进行退火步骤，然后在60℃下延伸1分钟。每个点重复执行三次。为了确保引物产生单一且特异的PCR扩增产物，在PCR循环期间生成分离曲线，只选择具有唯一分离峰的引物，然后在2%琼脂糖凝胶上迁移，以确保PCR产物的唯一性。计算了每对引物的扩增效率。每个基因的表达水平由GAPDH水平调整，并表示为与GAPDH的比率。
蛋白质印迹分析
为了确定人和小鼠脂联素、TNF受体1（TNFR1）、pNFκB、乙酰辅酶A羧化酶（pACC）和内质网应激相关因子（如X盒结合蛋白-1（XBP-1）和激活转录因子-4（ATF-4）和ATF-6）之间是否存在协同作用，我们对全细胞蛋白提取物进行了Western blot分析。细胞在RIPA缓冲液中溶解。等量的蛋白质在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后在PVDF膜上印迹。膜被免疫印迹。使用ECL检测试剂显示免疫反应带。细胞在RIPA裂解缓冲液中孵育20分钟。使用BCA蛋白质检测试剂盒（美国伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯）测定蛋白质浓度后，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，并在硝化纤维素膜上电印迹。首先，他们与一级抗体反应，然后与过氧化物酶结合的二级抗体反应（稀释度1:1000）（英国白金汉郡GE Healthcare）。使用ECL Western印迹检测系统（美国加利福尼亚州旧金山Amersham）通过增强化学发光对抗原进行可视化。
统计分析
数值数据表示为平均值±标准偏差。采用未配对学生t检验评估各组之间的统计显著性。P<0.05的值被认为具有统计学意义。
结果
生化分析
20周龄时，与野生型和nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠相比，nSREBP-1c转基因小鼠的血清AST和ALT水平升高。AST水平在nSREBP-1c转基因小鼠中最高，在nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠中显著降低。nSREBP1c/脂联素转基因小鼠的ALT升高减弱至正常水平，尽管差异无统计学意义(). nSREBP-1c转基因小鼠和nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠的总胆固醇或甘油三酯水平没有显著差异().
20周龄时的血清转氨酶和血脂水平。（A） 与野生型和nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠相比，nSREBP-1c转基因小鼠的血清AST和ALT水平升高。AST水平在nSREBP-1c转基因小鼠中最高，在nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠中显著降低。nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠的ALT水平正常，但与nSREB-1-c转基因小鼠相比，差异无统计学意义。（B） nSREBP-1c转基因小鼠和nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠的总胆固醇或甘油三酯水平没有显著差异。
20周龄时进行的腹腔内葡萄糖耐受性试验（10%溶液中的1 g/kg）表明，在葡萄糖负荷后30和60分钟，nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠的血糖水平显著低于nSREB-1-c转基因小鼠().
20周龄时进行腹膜内葡萄糖耐量测试。20周龄时进行的腹腔内葡萄糖耐受性试验（10%溶液中的1 g/kg）表明，在葡萄糖负荷后30和60分钟，nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠的血糖水平显著低于nSREB-1-c转基因小鼠。
nSREBP‐1c/脂联素转基因小鼠的循环内源性小鼠脂联素水平略高于nSREBP-1c转基因小鼠，但差异显著(). 20周龄nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠的人类脂联素水平显著高于其他两组().
20周龄时循环内源性小鼠脂联素水平。（A） nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠的循环内源性小鼠脂联素水平略高于nSREBP-1c转基因小鼠，但差异显著。（B） nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠20周龄时的人类脂联素水平显著高于其他两组。
光学显微镜
光镜下，切片用苏木精-伊红染色或Mallory’s Azan染色。nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠脂肪滴、细胞浸润和细胞周纤维化减少()与nSREBP-1c转基因小鼠比较().
光学显微镜检查结果。与（C和D）nSREBP-1c转基因小鼠相比，（A和B）nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠的脂肪滴、细胞浸润和细胞周纤维化减少。
电子显微镜
SREBP-1c转基因小鼠的肝脏含有细胞核退化的肝细胞以及大小不同的脂肪滴。放大后的图像中可以看到放大的ER(). 然而，nSREBP-1c和脂联素双转基因小鼠肝脏中的肝细胞在细胞质中含有少量小脂肪滴。然而，细胞核和细胞器，如线粒体和内质网，与正常肝细胞相似。这些发现表明，双转基因小鼠的内质网应激降低().
电子显微镜检查结果。（A和B）在SREBP-1c转基因小鼠的肝脏中，可以看到细胞核退化的肝细胞、大小脂肪滴，以及放大图像中扩大的内质网。（C和D）然而，在nSREBP-1c和脂联素双转基因小鼠的肝脏中，只有少数小脂肪滴位于肝细胞的细胞质中。然而，细胞核和细胞器，如线粒体和内质网，与正常肝细胞相似。
实时PCR分析
实时PCR分析表明，与野生型和nSREBP-1c转基因小鼠相比，人脂联素在nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠的肝脏中的表达显著增加(). 然而，野生型、nSREBP-1c转基因小鼠和nSREB-1-c/脂联素转基因小鼠之间的小鼠脂联素mRNA表达没有显著差异().
实时PCR分析。（A） 与野生型和nSREBP-1c转基因小鼠相比，人脂联素在nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠的肝脏中的表达显著增加。（B） 然而，野生型、nSREBP-1c转基因小鼠和nSREB-1-c/脂联素转基因小鼠之间的小鼠脂联素mRNA表达没有显著差异。（C和D）nSREBP-1c转基因小鼠和nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠的AdipoR1和2表达水平没有显著差异。
我们观察到nSREBP-1c转基因小鼠和nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠在小鼠AdipoR1和2表达水平上没有显著差异().
蛋白质印迹分析
在Western blot分析中，与nSREBP-1c转基因小鼠相比，nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠的肝脏中TNFR1和磷酸化NFκB降低。可以假设脂联素通过TNFR1和NFκB通路抑制nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠肝脏中的炎症反应().
蛋白质印迹分析。与nSREBP-1c转基因小鼠相比，nSREBP1c/脂联素转基因小鼠的肝脏中TNFR1和磷酸化NFκB降低。（A） 可以假设脂联素通过nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠肝脏中的TNFR1和NFκB通路抑制炎症。此外，与nSREBP-1c转基因小鼠相比，nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠肝脏中XBP-1、ATF-4和磷酸化ACC的蛋白表达降低。（B） 然而，三组中ATF-6蛋白的表达几乎相同。
此外，与nSREBP1c转基因小鼠相比，nSREBP1c/脂联素转基因小鼠肝脏中XBP-1、ATF-4和磷酸化ACC的蛋白表达降低。然而，三组中ATF-6蛋白的表达几乎相同().
讨论
我们的研究表明，nSREBP-1c转基因NASH模型小鼠的肝脏内质网应激增强。我们的研究结果还表明，脂联素通过XBP-1、ATF-4和ACC途径抑制nSREBP-1c/脂联素转基因小鼠肝脏中的内质网应激。众所周知，脂联素可以抑制肥胖和糖尿病患者的内质网应激(16,17). 最近的研究将内质网应激与肥胖、胰岛素作用和2型糖尿病联系起来(18,19)UPR的激活由三种ER跨膜蛋白控制：肌醇需要激酶-1（IRE1）、蛋白激酶样ER激酶（PERK）和激活转录因子-6（ATF6）。在内质网应激时，IRE1内切酶促进XBP-1 mRNA的剪接，导致转录因子XBP-1激活版本的翻译。XBP-1与PI3K调节亚单位之一p85α或p85β的结合增强了该转录因子的核进入和UPR靶基因的诱导(20,21). p85亚单位不直接调节UPR的其他臂，包括IRE1与TRAF2的结合以及eIF2（p-eIF2）的JNK和PERK磷酸化的随后激活，后者抑制与UPR转录激活物ATF4优先翻译一致的蛋白质合成。然而，UPR的ATF6臂参与蛋白水解裂解和向细胞核释放转录因子，可能通过与p85结合而被激活(22).
尽管低脂联素血症与人类非酒精性脂肪肝（NAFLD）和NASH的发生有关(23)没有直接证据表明脂联素对自发发生的NASH有预防作用。在这项研究中，在肝脏中产生脂联素的双转基因小鼠的血清脂联素水平正常或略有升高。双转基因小鼠通常在肝脏中表达AdipoRs的两个亚型，即AdipoR1和2。肝脏中表达的脂联素分别通过AdipoR1和2刺激腺苷一磷酸活化蛋白激酶激活和PPARα信号通路。
脂联素也可能通过其抗炎作用发挥保护作用(9). 脂联素是一种由成熟脂肪细胞分泌的脂肪细胞因子，其受体广泛分布于包括肝脏在内的许多组织中。脂联素在肝脏中具有直接作用，在改善肝脏胰岛素敏感性、增加脂肪酸氧化和减少炎症方面发挥着重要作用。脂联素缺乏小鼠表现出肝再生受损和肝脂肪变性增加(24). 吉内（Yoshiuchi）等直接评价糖尿病药物吡格列酮对体内糖尿病条件下的内质网应激。吡格列酮治疗可减少肝内脂肪滴的积聚，并减弱胰岛素抵抗的发展，即吡格列酮可抑制肝脏内质网应激(25). 因此，脂联素可能直接改善包括NASH在内的NAFLD的发病机制。
总之，脂肪组织中表达nSREBP-1c的转基因小鼠可能是NASH的独特模型。脂联素在nSREBP-1c转基因小鼠肝脏中的转基因可诱导胰岛素抵抗、内质网应激、小叶内炎症和纤维化的改善。这些观察结果可能会为人类NASH的新型治疗方法的发展提供线索。
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