胃肠病学。作者手稿；PMC 2013年4月1日提供。
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美国国立卫生研究院：NIHMS349071号
小鼠和人体组织中激活的肝星状细胞自噬释放促进纤维化的脂质
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弗吉尼亚州赫尔南德斯–GEA
★纽约州纽约市西奈山医学院医学部肝病科
ZAHRA GHIASSI–内贾德
★纽约州纽约市西奈山医学院医学部肝病科
拉斐尔·罗森菲尔德
†纽约州纽约市西奈山医学院药理学和系统治疗学系
玛丽亚·伊莎贝尔·菲尔
§纽约州纽约市西奈山医学院病理学系
ZHENYU YUE镇余月
||纽约州纽约市西奈山医学院神经病学和神经科学系
马克·J·捷克
¶纽约布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院医学系和马里恩·贝辛肝脏研究中心
★纽约州纽约市西奈山医学院医学部肝病科
†纽约州纽约市西奈山医学院药理学和系统治疗学系
§纽约州纽约市西奈山医学院病理学系
||纽约州纽约市西奈山医学院神经病学和神经科学系
¶纽约布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院医学系和马里恩·贝辛肝脏研究中心
如需重印，请联系：Scott L.Friedman，医学博士，1123号信箱，西奈山医学院，1425 Madison Avenue，11-70C室，纽约州，邮编10029-6574。ude.msms@namdierf.ttocs; 传真：（212）849-2574 V.H.-G.和Z.G.-N.对这项工作做出了同等贡献。
- 补充资料
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摘要
背景和目标
肝纤维化的发病机制涉及肝星状细胞的激活，这与细胞内脂滴的耗竭有关。当肝细胞发生自噬时，细胞内脂质在溶酶体中降解。我们研究了自噬是否也能促进肝星状细胞中脂质的丢失，为其活化提供能量，并将这些发现扩展到其他成纤维细胞。
方法
我们分析了来自C57BL/6野生型的肝星状细胞，附件7前/后、和附件7前/后-GFAP-核心小鼠，以及小鼠星状细胞系JS1。CCl诱导小鼠纤维化4或硫代乙酰胺（TAA）；对肝组织和星状细胞进行分析。使用小干扰RNA阻断来自肝脏和其他组织的纤维生成细胞的自噬附件5或Atg公司7和化学拮抗剂。从特发性肺纤维化患者或健康供体的肺组织样本中分离出人肺成纤维细胞。
结果
在小鼠中，CCl诱导肝损伤4或TAA增加自噬水平。我们还观察到受损人类肝组织内活化星状细胞的自噬特征。培养的小鼠星状细胞和小鼠损伤后自噬功能的丧失减少了纤维生成和基质积累；通过提供油酸作为能量底物，部分克服了这种影响。自噬还调节胚胎、肺和肾成纤维细胞中纤维生成基因的表达。
结论
激活的星状细胞的自噬是小鼠肝纤维化所必需的。选择性降低肝脏和其他组织中纤维生成细胞的自噬活性可能用于治疗纤维疾病患者。
关键词：肌成纤维细胞，炎症，小鼠模型，能量消耗
纤维化疾病占全球死亡率的45%，1然而，抗纤维化治疗的发展仍然遥不可及，这突出表明需要对纤维化的发病机制有更深入的了解。常驻间充质细胞的肌纤维母细胞转化是肝、肺、肾和其他器官纤维化发展的基础，这表明不同组织之间有共同的伤口修复途径。2在肝脏中，通过获得收缩、增殖、炎症和纤维生成表型，将常驻肝星状细胞激活为肌成纤维细胞是纤维化发生的关键事件。三活化的星状细胞/肌成纤维细胞是细胞外基质的主要来源，细胞外基质的积累导致肝实质被瘢痕逐渐取代。4
星状细胞活化的最显著特征之一是由视黄酯和甘油三酯组成的细胞质脂滴（LD）的丢失，5然而，在脂质损失和细胞活化之间几乎没有功能联系。最近的一项研究发现，细胞内脂质通过大分子自噬（以下简称“自噬”）分解，生成脂肪酸，用于肝细胞的能量生产6提出了自噬导致LDs丢失驱动星状细胞纤维化反应的可能性。我们研究的目的是确定自噬在肝星状细胞激活中的作用，以及在其他成纤维细胞（如胚胎肌成纤维细胞和来自肾和肺的成纤维细胞）中的作用。
材料和方法
细胞与细胞培养
从C57BL/6野生型、，附件7前/后、和附件7前/后-GFAP-核心小鼠通过酶消化和改良Percoll密度梯度离心。7小鼠永生化星状细胞系JS1，之前在我们实验室产生，8用含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基培养。使用的小鼠系膜细胞如前所述获得。9人肺成纤维细胞培养自接受肺移植的特发性肺纤维化患者的肺组织或未用于移植的正常供体肺。10用10 mmol/L 3-甲基腺嘌呤（3-MA；西格玛，圣路易斯，MO）、10 mmol/L氯喹（西格玛）或20μmol/L依托莫司（Sigma）。对于脂质补充分析，将1:100稀释的牛血清白蛋白（BSA）-油酸（Sigma）或等效浓度的BSA单独添加到培养细胞中。使用甘油三酯定量试剂盒（加州Milpitas BioVision）进行甘油三酸酯测量。
慢病毒Atg5小干扰RNA的构建
用于附件5和Atg公司7个克隆到前面描述的慢病毒载体中6,11使用了。敲除和自噬抑制在转导8天时最为理想，这是所有实验所用的时间点。
动物
附件7前/后先前描述的小鼠12在C57BL/6背景下，在胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子的控制下，与表达cre重组酶的转基因FVB系杂交(GFAP-芯)生成附件7前/后-GFAP-芯星状细胞特异性敲除小鼠13属于附件7。
所有研究均由西奈山医学院动物护理和使用委员会批准，并遵循国家卫生研究院动物护理指南。
毒素诱导的急慢性肝损伤和纤维化模型
四氯化碳（Sigma）和硫代乙酰胺（TAA；Acros Organics，Geel，Belgium）用于诱导肝纤维化。在急性损伤研究中，小鼠接受了3次10%CCl的腹腔注射4（在玉米油中稀释），剂量为0.5μL/g体重。在慢性损伤模型中，小鼠接受10%CCl的腹腔注射4（在玉米油中稀释），剂量为0.5μL/g体重，每周3次，持续6周。每隔一天通过3次腹腔注射（100毫克/体重）给予TAA（磷酸盐缓冲盐水稀释）治疗。在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下，最后一次给药后48小时处死动物。所有实验均在4个月大的雄性小鼠身上进行。
免疫印迹
细胞裂解物进行免疫印迹分析。将膜与以下主要抗体孵育：兔抗ATG7、兔抗微管相关轻链3（LC3）、兔抗ATG 5（细胞信号技术，马萨诸塞州波士顿）、鸡抗脂肪细胞分化相关蛋白（ADRP）（密立波，比勒里卡州）、，兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（Sigma），兔抗I型胶原（Rockland Inc，Gilbertsville，PA），兔-β–平滑肌肌动蛋白（SMA）（Millipore），兔抗-β–血小板衍生生长因子受体(β-PDGFR；圣克鲁斯生物技术公司，加利福尼亚州圣克鲁斯），兔抗基质金属蛋白酶2（MMP2）（马萨诸塞州坎布里奇Abcam），小鼠抗微管蛋白（Sigma），兔抗病毒P62（纽约州恩佐）和小鼠抗cre重组酶（Abcam。用辣根过氧化物酶结合二级抗体检测反应。使用ECL检测系统（英国白金汉郡Amersham Pharmacia Biotech）开发印迹。
油红O染色
用油红O（ORO；0.5%丙二醇）染色细胞以显示LDs。细胞核用苏木精进行复染，以进行明亮视野显微镜检查。使用ImageJ软件进行量化。
电子显微镜
细胞和肝组织用3%戊二醛在0.2mol/L的二碳酸二钠中固定，pH 7.4。解剖前，用上述溶液充分灌注小鼠肝脏。然后用1%四氧化锇处理样品1小时，然后通过环氧丙烷分级步骤进行乙醇脱水，然后将其嵌入Embed 812（宾夕法尼亚州哈特菲尔德电子显微镜科学）。超薄切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。图像是在日立（加拿大安大略省多伦多）H7650透射电子显微镜上采集的。
定量实时聚合酶链反应
使用Qiagen微型柱（Qiagen，Germantown，MD）和柱上脱氧核糖核酸酶处理提取细胞RNA。使用RT Complete Double PrePrimed Kit（Clontech，Mountain View，CA）逆转录一微克RNA。采用FastStart SYBR Green Master（印第安纳波利斯罗氏）进行聚合酶链反应。样品在Microsoft Excel（Microsoft Corp，Redmond，WA）中分析一式三份，并归一化为β-肌动蛋白表达。
组织学和免疫组织化学研究
肝脏样本用福尔马林固定，石蜡包埋，4岁时切片μm、 常规处理用于H&E染色。天狼星红（Sigma）用于测定胶原蛋白沉积。一位失明的病理学家对每张幻灯片上的10个随机区域进行了纤维化评分。免疫组织化学染色αSMA是用兔多克隆抗体（Abcam）进行的。切片用天狼星红溶液（含有0.1%直接红80和0.1%快速绿的饱和苦味酸）染色，以观察胶原沉积。
肝脏测试
使用分光光度计分析（Pointe Scientific，Inc，Canton，MI）定量测定血清天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶水平。
统计
结果表示为平均值和SEM。P（P）值（学生双尾，未配对t吨用Microsoft Excel软件计算至少3个独立测定值。数据在P（P）< .05.
结果
体内肝星状细胞激活可增加自噬功能
我们首先研究了在体内星状细胞激活过程中自噬活性是否发生改变。三种剂量CCl后从野生型小鼠中分离的细胞4(0.5μ免疫印迹法显示，L/g体重）或TAA（100 mg/g体重）（但不包括经车用处理的动物）的共轭LC3、LC3II的积累增加，P62/SQSTM1降低(); 后者是一种选择性自噬适配器分子，将泛素化底物带入自噬体，并被自噬降解。14根据电子显微镜（EM），这些细胞中自噬空泡（AVs）的数量显著增加(). 还使用溶酶体抑制剂氯喹（CQ）进行自噬通量测定()证实肝损伤后自噬上调。
体内肝损伤后星状细胞自噬上调。(A类和C类)野生型小鼠急性肝损伤诱导后星状细胞的免疫印迹(A类)CCl公司4和(C类)添加和不添加CQ的TAA显示LC3II转化率增加，P62降低。(B类和D类)整个肝组织的电子显微照片，显示术后的星状细胞(B类)CCl公司4和(D类)TAA治疗.箭头指示AV。(赖特)每100个细胞AV数的电子显微定量(★P（P）< .05,★★P（P）< .001;误差线表示SEM）。蛋白质比率（标准化为GAPDH）用于量化相对于对照组的折叠变化，如图所示在下面每个污点。数据表示至少3个实验的平均值(★P（P）<.05），每个条件下使用3只动物。
我们还评估了人类细胞中的自噬水平(补充图1A–C). 与未感染的肝脏相比，从乙型肝炎病毒感染的人类肝脏中分离出的星状细胞中，LC3II水平以及AV数量增加，P62减少也很明显(补充图1A和B). 然后，我们分析了非纤维化肺和特发性肺纤维化患者的成纤维细胞，发现特发性肺部纤维化样本中LC3II增加，P62减少(补充图1C). 这些数据表明，自噬功能的增强发生在不同组织和不同物种的纤维化细胞活化过程中。
阻断星形细胞自噬减弱成纤维活性
为了解决自噬调节星状细胞活化的前景，我们培育了一个永生化小鼠星状细胞系JS1，8含2种药物自噬抑制剂：3-MA15或CQ。16每种化合物在12小时内降低自噬水平；3-MA处理的细胞显示自噬空泡数量减少(补充图2B)并增加了P62(补充图2A). 正如预期的那样，氯喹阻断了LC3II的周转，导致其通过免疫印迹积聚14(补充图3A)同时P62/SQSTM1增加(补充图3B)和自噬体数量，这是由于自噬体与溶酶体融合受阻所致(补充图3C). 3-MA或CQ处理均不影响细胞活力（数据未显示）。
因为3-MA和CQ的影响(补充图5)对自噬并不完全特异，JS1细胞也用表达小发夹RNA的慢病毒载体转导到必要的自噬基因附件7（siAtg公司7个单元格）或附件5（si）Atg公司5个细胞）或带有空慢病毒对照（VEC）(补充图4和6). 免疫印迹证实了这两种自噬蛋白的敲除，并导致LC3II显著降低(补充图4和6)和AV数量(补充图4B).
接下来，我们评估了自噬的特异性抑制是否调节星状细胞激活的主要特征，即纤维生成基因的表达。通过药理学方法或特异性方法抑制自噬Atg公司5或Atg公司7敲除，显著降低编码胶原蛋白的信使RNA的表达α1（一） 和α2（一）(第1α1列，第1α2列),β-Pdgfr,α-平滑肌肌动蛋白、和百万-2(和补充图6B)及其相应的蛋白质(和补充图6C).
抑制自噬减少纤维生成。(A类和C类)第1列α1,第1列α2,α-斯马,百万分之二、和β-Pdgfr信使RNA（定量逆转录聚合酶链反应分析）和(B类和D类)JS1细胞中的蛋白表达（免疫印迹）(A类和B类)用3-MA治疗24小时后或(C类和D类)用siAtg7慢病毒转导后8天。所有数据均代表至少3个独立实验。信使RNA表达为相对于对照的折叠变化(★P（P）< .05,★★P（P）< .001;误差线表示SEM）。蛋白质比率（标准化为GAPDH）用于量化相对于对照组的折叠变化，如图所示在下面每个污点。数据表示至少3个实验的平均值(★P（P）<.05）。
为了评估自噬是否是纤维化的普遍调节途径，我们分析了3-MA对原代人星状细胞自噬抑制的作用(补充图7A)和原代人肺成纤维细胞(补充图7B). 胚胎成纤维细胞Atg公司5缺陷小鼠也有特征(补充图8A)自噬被3-MA阻断或沉默Atg公司7在小鼠肾小球细胞中(补充图8B和C)，肾脏中的纤维生成细胞类型。自噬抑制在不同细胞类型中对纤维化具有相同的保护作用，从而加强了自噬作为纤维化核心途径的作用。
阻断星形细胞自噬减轻体内肝纤维化
确定自噬在体内星状细胞激活中的作用仍然至关重要。为此，我们建立了一个转基因小鼠系，其中表达Atg公司7通过交叉在肝内的星状细胞中特异性减弱附件7前/后动物在胶质纤维酸性蛋白启动子下表达cre重组酶(GFAP-芯).13细胞类型特异性Atg公司通过免疫印迹和定量实时聚合酶链反应在这些动物的原代分离星状细胞中证实了7个基因敲除(补充图9A和C)这与cre重组酶蛋白表达增加有关(补充图9B). 星形细胞分离自附件7前/后-GFAP-芯包含LC3-II水平降低、LC3-I水平补偿性增加和P62积累(). 这些孤立细胞的EM显示，与它们的AV相比，AV的数量显著减少附件7前/后室友(). 在附件7前/后-GFAP-芯小鼠自噬水平的降低是星状细胞特有的，因为肝细胞AV数量或附件7通过全肝EM和Atg7免疫组织化学评估其他细胞类型的表达(补充图9D).
自噬调节体内星状细胞活化和纤维化。(A类)星状细胞蛋白的免疫印迹附件7前/后和附件7前/后-总楼面面积cre小鼠ATG7、LC3-II表达降低，P62增加。(B类)分离的星形细胞的电子显微照片附件7前/后和附件7前/后-GFAP-芯小鼠和AV量化(正确的)说明转基因动物的AV显著降低。箭头指示AV。(C类和D类)免疫印迹(C类)I型胶原蛋白和α-分离星状细胞中的SMA附件7前/后和附件7前/后-GFAP-芯CCl慢性肝损伤小鼠4. (E类)慢性肝损伤后CCl的全肝切片4被染上天狼星红(赖特)天狼星红定量-阳性区域。★P（P）< .05,★★P（P）< .001.误差线显示SEM。蛋白质比率（标准化为GAPDH）用于量化相对于对照的倍数变化，如图所示在下面每个污点。数据表示至少3个实验的平均值(★P（P）<.05），共18只动物：9只附件7前/后和9附件7前/后-GFAP-芯。
自噬缺陷肝星状细胞小鼠的肝脏结构正常(补充图10A)，星状细胞超微结构完整（数据未显示）。然而，肝损伤后，附件7前/后-GFAP-芯小鼠肝纤维化减轻。慢性纤维化由6周CCl诱导4在里面附件7F/F-GFAP-核心和地址：7F/F老鼠。根据天狼星红形态计量学的评估，胶原蛋白积累在附件7前/后-GFAP-芯老鼠(). 此外，鉴于α-SMA–转基因动物中的阳性星状细胞没有变化（数据未显示），总计α-分离星状细胞中的SMA蛋白显著降低()，表明Atg公司7在星状细胞中减弱α-SMA在每个细胞中的表达并不影响星状细胞的数量。在分离自附件7前/后-GFAP-芯与来自附件7前/后().附件7前/后-GFAP-芯和附件7前/后小鼠表现出相似的肝脏重量比(补充图10B)和肝损伤的可比水平，表明自噬减弱对星状细胞肝纤维化的影响不是继发于肝损伤程度的改变(补充图10C). 为了证明自噬是独立于潜在损伤类型的星状细胞激活的关键调节器，我们还诱导了肝损伤附件7前/后-GFAP-芯和附件7前/后TAA小鼠，证实阻断自噬对纤维化发展具有相同的保护作用(补充图11).
自噬刺激星状细胞激活过程中LDs的丢失以提供细胞能量
尽管之前没有研究过，星状细胞激活可能是一个需要大量能量的过程，以促进细胞增殖、细胞外基质分泌和细胞收缩。因此，我们推断自噬可能以储存在细胞质液滴中的甘油三酯的形式提供关键的能量底物来源。因此，我们研究了抑制自噬是否会减弱与细胞活化相关的脂质含量的消耗。ORO染色显示用3-MA处理或用3-MA转导的细胞中LD数量增加签名地址7()或siAtg5（未显示数据）。这些发现与EM上的LD增加有关()，甘油三酯含量增加(补充图12A和B)与对照细胞相比，自噬缺陷细胞中ADRP的表达(). 从附件7前/后-GFAP-芯含有增加的LD含量和ADRP(补充图13D和E)在原代培养（数据未显示）或体内用3剂量CCl治疗后10天诱导激活后4和简要的原始文化(补充图13B和C)与Atg7的星状细胞比较前/后小鼠，即使所有细胞在激活前都有相同数量的LDs(补充图13A).
星状细胞自噬缺陷导致LD积累。JS1细胞的脂质含量分析(A类–C类)用3-MA处理或(D类–F类)用siAtg7转导。(A类和D类)ORO染色和(正确的)ORO染色面积的量化(★P（P）< .05,★★P（P）< .001).误差线表示SEM(B类和E类)显示中性LD的电子显微照片(箭头)和(C类和F类)ADRP免疫印迹(误差线表示SEM）。蛋白质比率（标准化为GAPDH）用于量化相对于对照组的折叠变化，如图所示在下面每个污点。数据表示至少3个实验的平均值(★P（P）< .05).
LDs被细胞内脂肪酶分解为游离脂肪酸（FFA），以进行线粒体β-氧化，生成三磷酸腺苷（ATP）。因为自噬刺激β-氧化速率和能量生产，6,17我们评估了抑制自噬对星状细胞中ATP产生的影响。正如预测的那样，3-MA对自噬的抑制导致ATP水平下降(). 此外，脂肪酸氧化抑制剂埃托莫西尔的治疗会刺激星状细胞中LDs的积累()COL1减少，α-SMA、MMP2和β-PDGFR表达()不影响自噬活性（数据未显示）。
β-氧化调节星状细胞的活化。(A类)用3-MA抑制JS1细胞的自噬，并在处理后12小时测定ATP含量。(B类和C类)β-COL1表达12小时后，用依托莫西阻断JS1细胞的氧化，α-SMA和β-PDGFR由(B类)免疫印迹分析和(C类)用ORO染色法检测LD含量(正确的，ORO染色区域的量化）。ATP水平以皮摩尔/10表示6细胞。误差线显示SEM。蛋白质比率（标准化为GAPDH或微管蛋白）用于量化相对于对照组的折叠变化，如图所示在下面每个污点。数据表示至少3个实验的平均值(★P（P）< .05).
总的来说，这些数据表明自噬通常是FFA的一个关键来源，为星状细胞激活提供燃料，而其抑制会损害能量的产生(). 如果这一假设是真的，那么在自噬缺陷细胞中提供FFA的替代来源应该至少部分挽救减弱的激活。正如预测的那样，在3-MA阻断星状细胞自噬后添加油酸（OA）()或siAtg公司7 ()能够增加ATP生成（数据未显示），并显著挽救自噬阻滞介导的纤维生成减少。
描述自噬在星状细胞激活和纤维形成中作用的简化模型。星状细胞对肝损伤的反应涉及自噬的上调，自噬促进星状细胞活化，部分通过其在脂质分解和能量生成中的作用，从而驱动肝脏的纤维化反应。
外源性FFA可以挽救自噬抑制引起的纤维生成减少。JS1细胞用(A类)3-MA或用(B类)siAtg7，并补充与BSA偶联或仅与BSA结合的OA。COL 1的表达，α-SMA、MMP2和β-PDGFR由(A类和B类)免疫印迹分析。蛋白质比率（标准化为GAPDH）用于量化相对于对照组的折叠变化，如图所示在下面每个污点。数据表示至少3个实验的平均值(★P（P）< .05).
讨论
我们的研究结果表明，在肝星状细胞中建立活化表型需要自噬活性。与最近的研究一致18仅限于培养细胞，并使用非特异性自噬抑制剂，我们的数据证实，抑制肝星状细胞的自噬会损害其体内成纤维潜能，导致成纤维基因表达降低α-平滑肌肌动蛋白,胶原蛋白1α1,胶原蛋白1α2,β-Pdgfr、和百万-2不影响细胞存活率。这些发现强调了自噬在产生能量以支持星状细胞活化和驱动细胞外基质生成方面的重要作用。在两种不同的损伤模型（CCl）中，星状细胞自噬的基因抑制可减轻纤维化4和TAA），因为附件7F/F-GFAP-核心肝损伤后，小鼠的星状细胞活化和纤维化程度降低。此外，我们的数据证实了自噬不仅在肝星状细胞激活和肝纤维化中起作用，而且在其他组织（肺、肾、胚胎成纤维细胞）以及小鼠和人类中的成纤维细胞中也起作用。
基础自噬存在于所有类型的细胞中，并在细胞应激条件下作为一种适应性反应迅速上调，以产生细胞内营养物质和能量。19,20据报道，正常肝脏的溶酶体活性很低。21,22对肝脏的几次侮辱（如饮酒）23已被确定为自噬触发物；然而，这些研究主要集中在肝细胞上。我们在这里表明，肝星状细胞中的自噬诱导是对肝脏损伤性刺激的反应。具体来说，遵循CCl4和TAA诱导的肝损伤，原代活化的星状细胞上调自噬，与纤维生成标记物的诱导平行。
因此，我们假设在肝损伤期间代谢应激后，自噬可能对维持肝星状细胞活化至关重要。在自噬缺陷型肝星状细胞未经治疗的小鼠中，肝结构得以保留，星状细胞超微结构完整，表明抑制星状细胞的基础自噬并不影响静止状态的维持。然而，肝损伤后，当细胞面临细胞内能量需求增加时，阻断自噬会损害其激活和成纤维活性。
静止的肝星状细胞含有类似浓度的视黄酯和甘油三酯，24它们共同占细胞质LDs中总脂质含量的75%。5这些液滴的丢失是肝损伤中星状细胞活化的特征，4,25然而，它与这一回应的功能联系一直不明确。有趣的是，自噬有助于肝细胞、成纤维细胞、，6和神经元，26但一直缺乏与更广泛的组织背景的联系。此外，药物或基因对肝细胞自噬的抑制会导致β-细胞溶质LDs中的氧化和显著脂质积聚。6自噬是一个依赖ATP的过程，27自噬抑制降低线粒体β-氧化速率6,17和能源生产。然而，LDs在提供能量以支持星状细胞活化方面的作用以前还没有被研究过。如肝细胞所示，我们发现自噬缺陷的星状细胞可能无法通过酸性脂肪酶处理LD，导致LD积累和FFA可用性降低，导致线粒体减少β-氧化和ATP生成。此外，自噬非依赖性抑制β-依托莫西的氧化作用模拟了阻断自噬对活化、纤维生成和脂质积聚的作用，暗示β-星状细胞活化中的氧化和ATP生成。我们的发现，加上先前的研究表明，缺乏维甲酸存储不能影响肝星状细胞的激活，28提示储存为甘油三酯而非维甲酸的脂质在肝星状细胞活化中起关键作用。
研究已将FFA与刺激自噬联系起来29,30补充自噬抑制。17我们之前的研究表明，OA本身对自噬活性细胞中的肝星状细胞激活没有影响。31然而，由于自噬抑制导致的纤维生成减少可以通过外源性OA补充部分修复；相反，在具有自噬能力的细胞中，添加OA不会进一步增加纤维生成。
我们的结果表明，自噬通过LD动员、FFA释放和线粒体提供支持星状细胞活化所必需的能量β-氧化。这些事件使激活的细胞在面对由纤维生成和增殖引起的细胞能量需求增加时保持能量稳态。该发现为理解肝病和星状细胞活化的调控提供了一个新的框架。此外，由于阻断来自其他器官的纤维生成细胞的自噬也会减弱纤维生成，自噬似乎是进化上保守的核心途径1这可能有助于在广泛的组织中产生纤维化反应。
致谢
作者感谢Beca Juan Rodés（Asociación Española para el Estudio del Hígado）和Beca de Formacióal estranger（Catalana de digestologia de l'Academia de Ciéciences Médiques de Catalunya I de Balears）的支持，Joseph Samet的技术援助，Masaaki Komatsu博士的附件7前/后小鼠，Meena Bansal博士负责初级人类星状细胞，Carol Fenghali-Bostwick博士负责正常和特发性肺纤维化肺的初级人类肺细胞，Erwin Bottinger博士负责小鼠系膜细胞，Noboru Mizushima博士负责小鼠胚胎成纤维细胞。
基金
由美国国立卫生研究院资助（RO1DK56621、R01 AA020709、KO5AA018408、P20AA017067、5T32GM007280、R01DK044234、R01DX061498和R01NS060123）。
本文中使用的缩写
| 美国存托凭证 | 脂肪细胞分化相关蛋白 |
| 成人影片 | 自噬空泡 |
| 英国标准协会 | 牛血清白蛋白 |
| CQ公司 | 氯喹 |
| 相对长度单位 | 电子显微镜 |
| 金融流量账户 | 游离脂肪酸 |
| GAPDH公司 | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 |
| GFAP公司 | 胶质纤维酸性蛋白 |
| 生命周期3 | 微管相关轻链3 |
| 劳埃德 | 脂滴 |
| 3-MA公司 | 3-甲基腺嘌呤 |
| 基质金属蛋白酶2 | 基质金属蛋白酶2 |
| 办公自动化 | 油酸 |
| ORO公司 | 油红O |
| PDGFR公司 | 血小板衍生生长因子受体 |
| 斯马 | 平滑肌肌动蛋白 |
| TAA公司 | 硫代乙酰胺 |
工具书类
1Mehal WZ、Iredale J、Friedman SL。刮除纤维化：通往纤维化核心的高速公路。自然医学。2011;17:552–553. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Blaner WS，O’Byrne SM，Wongsiriroj N等。肝星状细胞脂滴：一种用于类视黄醇储存的专门脂滴。Biochim生物物理学报。2009;1791:467–473. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Singh R，Kaushik S，Wang Y，等。自噬调节脂质代谢。自然。2009;458:1131–1135. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Blomhoff R，Berg T.大鼠肝星状细胞的分离和培养。方法酶制剂。1990年；190:58–71.[公共医学][谷歌学者] 8郭杰，洛克J，郑峰，等。Toll样受体4的肝硬化导向单核苷酸多态性与肝星状细胞反应的功能联系。肝病学。2009;49：960–968。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Satriano JA、Banas B、Luckow B等。RANTES和ICAM-1在小鼠系膜细胞中表达的调节。《美国肾脏病杂志》。1997;8:596– 603.[公共医学][谷歌学者] 10Pilewski JM、Liu L、Henry AC等。胰岛素样生长因子结合蛋白3和5在特发性肺纤维化中过度表达，并有助于细胞外基质沉积。《美国病理学杂志》。2005;166:399– 407. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Singh R，Xiang Y，Wang Y，等。自噬调节小鼠脂肪质量和分化。临床投资杂志。2009;119:3329–3339. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Komatsu M，Wang QJ，Holstein GR，等。自噬蛋白Atg7在维持轴突稳态和预防轴突变性中的重要作用。美国国家科学院院刊。2007;104:14489–14494. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Yang L，Jung Y，Omenetti A，等。肝星状细胞是成年小鼠肝脏上皮祖细胞的命运定位证据。干细胞。2008;26:2104–2113. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Blommaart EF、Krause U、Schellens JP等。磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂沃特曼和LY294002抑制分离大鼠肝细胞的自噬。欧洲生物化学杂志。1997;243:240–246.[公共医学][谷歌学者] 16Blommaart EF、Luiken JJ、Meijer AJ。肝蛋白降解的调节。Contrib Nephrol公司。1997;121:101–108.[公共医学][谷歌学者] 17Heaton NS、Perera R、Berger KL等。登革病毒非结构蛋白3将脂肪酸合成酶重新分配到病毒复制部位，并增加细胞脂肪酸合成。美国国家科学院院刊。2010;107:17345–17350. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Thoen LF、Guimaraes EL、Dolle L等。肝星状细胞激活过程中自噬的作用。肝素杂志。2011;55：1353–1360。[公共医学][谷歌学者] 19水岛N、莱文B、克尔沃AM等。自噬通过细胞自我控制与疾病作斗争。自然。2008;451:1069–1075. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Mehrpour M、Esclatine A、Beau I等，《健康与疾病中的自噬》。1.自噬的调节和意义：综述。美国生理学杂志《细胞生理学》。2010;298：C776–C785。[公共医学][谷歌学者] 21Cuervo AM、Knecht E、Terlecky SR等。长期饥饿对大鼠肝脏溶酶体蛋白水解选择性途径的激活。美国生理学杂志。1995;269：C1200–C1208。[公共医学][谷歌学者] 22Jones RG、Plas DR、Kubek S等。AMP活化蛋白激酶诱导p53依赖性代谢检查点。摩尔细胞。2005;18:283–293.[公共医学][谷歌学者] 23丁文新，李明，陈欣，等。自噬降低小鼠乙醇诱导的急性肝毒性和脂肪变性。胃肠病学。2010;139:1740–1752. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Senoo H、Yoshikawa K、Morii M等。肝星状细胞（维生素A储存细胞）及其相关的过去、现在和未来。细胞生物学国际。2010;34：1247–1272。[公共医学][谷歌学者] 25Friedman SL，Wei S，Blaner WS。活化大鼠肝脂肪细胞的视黄醇释放：Kupffer细胞调节介质和PDGF的调节。美国生理学杂志。1993;264：G947–G952。[公共医学][谷歌学者] 26Martinez-Vicente M、Talloczy Z、Wong E等。货物识别失败是亨廷顿病自噬效率低下的原因。自然神经科学。2010;13:567–576. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Meijer AJ，Codogno P.哺乳动物细胞自噬的调节和作用。国际生物化学与细胞生物学杂志。2004;36:2445–2462.[公共医学][谷歌学者] 28Kluwe J、Wongsirroj N、Troeger JS等。肝星状细胞视黄醇脂滴的缺乏不会增强肝纤维化，但会降低肝癌的发生。内脏。2011;60:1260–1268.[公共医学][谷歌学者] 29Komiya K、Uchida T、Ueno T等。游离脂肪酸通过JNK途径刺激胰腺β细胞自噬。生物化学与生物物理研究委员会。2010;401:561–567.[公共医学][谷歌学者] 30Choi SE，Lee SM，Lee YJ，等。自噬在棕榈酸酯诱导的INS-1β细胞死亡中的保护作用。内分泌学。2009;150:126–134.[公共医学][谷歌学者] 31Lee TF，Mak KM，Rackovsky O，等。脂肪分化相关蛋白（ADRP）介导的视黄醇和棕榈酸酯对肝星状细胞活化的下调细胞生理学杂志。2010;223:648– 657. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
