硫氧还蛋白还原酶抑制诱导克拉拉细胞中Nrf2介导的反应：氧化诱导肺损伤的意义

补充硒可增强TrxR1活性

TrxR1 C末端活性中心中的Sec残基直接有助于其催化功能(1). 为了确保TrxR1合成的足够硒饱和度，mtCC补充了越来越多的硒浓度（如亚硒酸钠）。在补充了亚硒酸钠的mtCC中检测到TrxR1活性的剂量依赖性增加，在补充了浓度高于25 n的亚硒酸钠的mtCC中检测到TrxR1活性M（M）彼此之间没有显著差异(补充图S2). 因此，培养基补充了25 nM（M）亚硒酸钠在随后的所有实验中。

AFN、二硝基氯苯和萝卜硫烷降低了TrxR1的活性

我们之前发现，TrxR1抑制剂ATG可以减轻成年小鼠的高氧肺损伤(38). 因此，我们试图通过研究TrxR1抑制剂AFN和二硝基氯苯（DNCB）以及特性良好的Nrf2诱导剂萝卜硫烷（SFN）的作用来确定Nrf2激活是否可能参与。我们的数据显示AFN(图1A)，DNCB(图1B)和萝卜硫烷（SFN）(图1C)处理1h后，所有药物均显著降低mtCC裂解物中的TrxR1活性。与经载体处理的对照组相比，经AFN处理的细胞中的裂解物TrxR1活性降低了约90%，经DNCB处理的细胞降低了62%，经SFN处理的电池降低了21%。由于用1或2μM（M）AFN无显著差异，1μM（M）AFN用于随后的实验。AFN处理1小时后24小时，AFN处理的mtCC中的TrxR1活性与车辆处理的对照组没有差异（数据未显示）。这些数据表明，用AFN、DNCB或SFN处理mtCCs 1小时后显著抑制TrxR1活性。

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图1。

AFN、DNCB或SFN处理1小时后mtCC中的TrxR1活性（A）AFN处理使TrxR1活性降低约90%；（B）DNCB处理使TrxR1活性降低62%；和（C）与车辆处理对照组相比，SFN处理使TrxR1活性降低21%。数据（平均值±SEM，n个=3–4）通过单因素方差分析或非配对分析t吨-在以下位置标注显著性的测试第页<0.05（*与车辆控制不同）。AFN，金诺芬；方差分析；二硝基氯苯；mtCC，小鼠转化的Clara细胞；SEM，平均值标准误差；SFN、萝卜硫烷；TrxR1，硫氧还蛋白还原酶-1。

TrxR1抑制增加核Nrf2水平

为了确定短暂的TrxR1抑制是否改变Nrf2反应，对经1μM（M）AFN，15μM（M）DNCB或5μM（M）SFN 1小时(图2). 与对照处理细胞相比，AFN、DNCB和SFN使核Nrf2蛋白水平分别增加了30、18和15倍(图2B). AFN或DNCB治疗2小时后，核Nrf2蛋白的积累仍很明显，而在5小时时，其水平与车辆治疗对照组无差异（数据未显示）。

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图2。

AFN、DNCB或SFN处理后mtCC中Nrf2核丰度和ARE驱动的mRNA水平，以及用TrxR1特异性siRNA处理的mtCC中的ARE萤光素酶活性。（A）代表性Western blot。（B）AFN、DNCB和SFN处理使核Nrf2丰度分别增加了30倍、18倍和15倍，与车辆处理对照组相比。数据（平均值±SEM，n个=5–8）归一化为核仁蛋白，并与Bonferroni进行单向方差分析事后（post-hoc）其重要性在第页<0.05. （*与车辆不同；^$与AFN不同）。（C–F）用1μM（M）AFN或15μM（M）1小时的DNCB qRT-PCR分析表明（C）HO-1，（D）NQO1、，（E）TrxR1和（F）AFN和DNCB治疗后的GCLM比车辆治疗对照组的GCLM。分析表明，对于HO-1、NQO1、TrxR1和GCLM，AFN和DNCB的独立影响以及AFN/时间和DNCB/时间之间的相互作用。dCt值（平均值±SEM，n个=3）通过双向ANOVA与Bonferroni进行分析事后（post-hoc）其重要性在第页<0.05. （*不同于同一时间/车辆；^%不同于同一时间/AFN；^$不同于相同处理/0h；^#不同于相同处理/5h）。（G）用TrxR1特异性siRNA或空载体对照、ARE-核糖核酸酶和呼吸道合胞病毒-β-半乳糖苷酶质粒DNA转染mtCC 48 h。TrxR1-siRNA处理细胞的荧光素酶活性是空载体处理对照细胞的2.7倍。数据（平均值±SEM，n个=9）被归一化为β-半乳糖苷酶，并由一个未配对的t吨-具有显著性的测试第页<0.05（*与空载矢量控制不同）。ARE，抗氧化反应元件；谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基；血红素加氧酶1；NQO1，NADPH：醌氧化还原酶1；核因子E2相关因子2；qRT-PCR=定量逆转录酶-聚合酶链反应。

TrxR1抑制增加ARE介导的基因转录和细胞内GSH水平

定量逆转录酶介导的聚合酶链反应（qRT-PCR）用于评估AFN或DNCB处理mtCCs 1后ARE调节基因的mRNA水平h.双向方差分析（ANOVA）表明AFN和DNCB处理以及血红素加氧酶1（HO-1）、NADPH：醌氧化还原酶1（NQO1）、TrxR1和谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基（GCLM）转录物中的时间依赖性诱导的独立效应。在车辆处理的mtCC中，基线HO-1、NQO1、TrxR1和GCLM mRNA水平在5小时时比基线低约50%(图2C–F). 治疗后即刻AFN和DNCB同样升高HO-1转录物，治疗后2小时进一步升高，5小时后恢复到基线水平(图2C). 治疗后立即用AFN将NQO1转录物增加两倍，在2小时分别用AFN和DNCB提高11倍和9倍，并在5小时保持升高(图2D). 在AFN或DNCB治疗后2小时，TrxR1 mRNA的增加最为显著(图2E). 在AFN处理的细胞中，GCLM转录物在处理后立即增加两倍，在处理后2小时增加三倍，并在5小时恢复到基线水平(图2F).

为了确定TrxR1敲除是否增加Nrf2介导的反应，用pU6-m3对照或siTR1-3质粒瞬时转染mtCC。siTR1-3强烈下调小鼠肺细胞TrxR1的表达(40). 由于转染效率低（5%–10%），mtCC与ARE驱动的荧光素酶质粒共同转染，以评估Nrf2的激活。与pU6-m3处理的对照组相比，来自siTR1-3处理细胞的裂解液中的ARE-淀粉酶启动子活性高2.7倍(图2G).

抑制TrxR1可增加高氧状态下mtCC中的总GSH水平

我们通过测量用1μM（M）AFN或15μM（M）DNCB处理1小时(图3A). 双向方差分析表明AFN和DNCB处理对GSH水平的独立影响以及AFN/time和DNCB/time之间的相互作用。在DNCB处理的细胞中，治疗后即刻细胞内GSH含量比载体处理的对照组低72%；然而，在5小时时，谷胱甘肽含量增加了29%。在5 h时，AFN处理细胞中的GSH含量增加了33%。在测试的任何时间点，AFN或DNCB处理细胞中GSH还原酶活性与车辆处理对照组没有差异（数据未显示）。

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图3。

AFN或DNCB治疗后mtCC中的总GSH含量，以及AFN或SFN治疗后RA或高氧暴露mtCC中GSH含量。（A）AFN-或DNCB处理的mtCC在处理后5小时的总GSH含量高于载体处理的对照。分析表明，治疗和时间对谷胱甘肽水平的独立影响和相互作用。数据（平均值±SEM，n个=6）使用Bonferroni进行双向方差分析事后（post-hoc）其重要性在第页<0.05（*不同于同一时间/辆；^%不同于同一时间/AFN；^$不同于相同处理/0h；^#不同于相同处理/2h）。（B、C）mtCC用1μM（M）AFN或5μM（M）SFN 1 h，如方法中所述，暴露于RA或高氧（B）5小时或（C）24 h。对总谷胱甘肽水平的分析表明，5 h时AFN和SFN处理的独立影响以及24 h时处理和暴露的影响。数据（平均值±SEM，n个=4-6）使用Bonferroni进行双向方差分析事后（post-hoc）其重要性在第页<0.05（*不同于车辆/21%O₂;^$与车辆不同/85%O₂;^#不同于相同处理/21%O₂). 谷胱甘肽；RA，室内空气；SFN，萝卜硫素。

为了确定高氧暴露对谷胱甘肽含量的影响，在暴露于室内空气（21%O₂或高氧（85%O₂)5或24小时的双向方差分析表明，AFN和SFN处理对5小时时谷胱甘肽水平的独立影响(图3B). 与高氧暴露对照组相比，高氧暴露5小时后，AFN处理细胞中的GSH水平增加了31%，SFN处理细胞增加了21%。双向方差分析表明AFN处理和暴露以及SFN处理和24小时暴露的影响(图3C). 与RA暴露的对照组相比，经车用高氧处理的mtCC中的GSH含量在24小时时增加了25%。24小时时，高氧暴露AFN处理的mtCC中的GSH水平比车用处理的对照组高16%。SFN诱导的GSH含量增加与AFN处理引起的增加相当。

缺乏谷胱甘肽而非AFN处理会增加mtCC对高氧暴露的敏感性

为了确定短暂TrxR1抑制对细胞活力的影响，用1μM（M）去除AFN 1 h，清洗细胞，并应用含有载体或丁硫氨酸亚砜胺（BSO）的新培养基，其抑制γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GSH合成的速率限制步骤）(27). 在RA或高氧暴露24小时后，通过台盼蓝排除法评估细胞活性(图4A)和ATP内容(图4B). 通过台盼蓝排除法，AFN处理使RA中的活细胞数减少了28%，而ATP含量没有检测到差异。在RA-暴露细胞的分析中，通过台盼蓝排除法测定，BSO处理的细胞的存活率显著低于载体处理的对照组，与AFN单独处理的细胞没有差异。AFN和BSO的联合使用与台盼蓝排除法的车用对照组相比，使活细胞数减少了89%(图4A). 此外，在RA暴露后，用BSO处理的AFN处理的mtCC的ATP含量比同样暴露的车辆处理的对照组低49%。在RA中，与溶媒治疗相比，AFN治疗和BSO治疗均未显著改变细胞数量(图4B).

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图4。

mtCC的AFN处理和在BSO存在或不存在的情况下暴露于RA或高氧24小时后的活细胞数、ATP含量和培养基LDH水平。用1μM（M）AFN持续1小时，介质发生变化，随后暴露于RA或85%O₂有无0.25 m，持续24小时M（M）英国标准组织。（A）增加0.25 mM（M）根据台盼蓝排除法评估，BSO对AFN处理细胞培养基的作用降低了RA和高氧状态下的活细胞数。（B）AFN处理的细胞在RA和有BSO存在的高氧培养中ATP含量较低。（C）在RA或高氧条件下培养的经AFN处理的mtCC中，培养基LDH水平高于在类似条件下培养、经载药处理的mtCCs。数据（平均值±SEM，n个=9–12）由Kruskal–Wallis分析，然后由Dunn分析事后（post-hoc）其重要性在第页<0.05（*不同于车辆/RA；^#与车辆/O不同₂;^¥不同于相同治疗/RA；^$与AFN/O不同₂;^¢与AFN/RA不同；^€不同于BSO/RA）。BSO，丁硫氨酸亚砜胺；LDH、乳酸脱氢酶。

通过台盼蓝排除法评估，与相应的RA对照组相比，高氧暴露降低了所有治疗组的活细胞数(图4A). AFN单独处理不会改变高氧暴露24小时后的活细胞数，而AFN处理后向培养基中添加BSO会使活细胞数减少99%以上。在高氧状态下，BSO对细胞ATP含量的影响显示出与使用台盼蓝排除法评估存活率相似的趋势(图4B). 高氧暴露后，BSO治疗组的ATP含量比车辆治疗对照组低79%。AFN处理和BSO处理使ATP含量又降低了9%。

为了确定高氧暴露、BSO和/或AFN治疗是否与细胞膜完整性丧失相关，对所有治疗组的细胞培养基中的乳酸脱氢酶（LDH）水平进行了测量(图4C). 在类风湿关节炎中，AFN和BSO联合治疗使LDH水平增加了1.5倍，这与车辆治疗的对照组相比。与同样治疗的RA和高氧暴露对照组相比，BSO存在下的高氧暴露分别使介质LDH水平增加61%和59%。此外，AFN和BSO联合治疗的高氧暴露mtCC中的介质LDH水平比高氧暴露对照组高90%。

细胞培养和治疗

mtCC（Franco DeMayo博士，贝勒大学）在1×Dulbecco改良的Eagle’s培养基中培养，该培养基含有4.5 g/l葡萄糖、l-谷氨酰胺和丙酮酸钠、10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素（Mediatech，Manassas，VA）和25 nM（M）亚硒酸钠（密苏里州圣路易斯西格玛化学公司），除补充图S2。将细胞以等密度电镀，让其贴壁过夜，并用二甲基亚砜（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）对照、AFN（Sigma）、DNCB（Sigma-）或SFN（LKT Laboratories，Inc.，St.Paul，MN）在无血清培养基中处理1小时，然后用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水冲洗三次。收集细胞或在无抑制剂的新鲜培养基中培养，并暴露于RA或85%O₂在氧气控制孵化器中（纽约州拉科纳市Biospherix）。对于实验子集，6.25 m的4μl/mlM（M）BSO（西格玛，0.25米M（M）最终浓度）或4μl/ml Dulbecco磷酸盐缓冲盐水在去除AFN后添加到培养基中。

TrxR1活性和GSH水平

如前所述，测定细胞裂解物中的TrxR1活性(6,33). 如前所述，测定细胞裂解物的谷胱甘肽浓度(38).

核级分制备和蛋白质印迹

收集用AFN、DNCB或SFN处理1h的mtCC，并在蔗糖缓冲液（0.32M（M）蔗糖，10米M（M）三氯化氢，pH 8.0，3 mM（M）氯化钙₂，2米M（M）草酰乙酸镁，0.1 mM（M）乙二胺四乙酸[EDTA]，0.5%Nonide P-40，1 mM（M）二硫苏糖醇和0.5 mM（M）PMSF[苯甲基磺酰氟]）。将裂解液在500℃下离心5分钟克在4°C下，去除上清液（细胞质部分）。在不含Nonide P-40的蔗糖缓冲液中清洗细胞核，并按刚才所述进行离心。去除上清液后，将核颗粒重新悬浮在30μl低渗缓冲液（20 m）中M（M）HEPES，pH值7.9，1.5 mM（M）氯化镁₂，20米M（M）氯化钾，0.2米M（M）EDTA，25%甘油（v/v），0.5 mM（M）二硫代三糖醇[DTT]和0.5米M（M）PMSF）。高渗缓冲液（30μl；20米M（M）HEPES，pH值7.9，1.5 mM（M）氯化镁₂，800米M（M）氯化钾，0.2米M（M）EDTA、25%甘油（v/v）、1%诺奈德P-40、0.5 mM（M）DTT，0.5米M（M）PMSF，以及亮蛋白肽、抑肽酶和肽抑制素各4.0μg/ml）。蛋白质浓度使用生物反应蛋白检测试剂盒测定。样品在4%–12%的双三凝胶（Invitrogen）上分离，转移到硝化纤维素膜（iBlot，Invitrogen）上，用含有1%吐温-20（TBS-T）的10%牛奶/三缓冲盐水封闭，并使用多克隆兔抗Nrf2抗体（H-300，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA；1:500）进行探测TBS-T中的山羊抗兔免疫球蛋白G-辣根过氧化物酶二级抗体（Bio-Rad，Hercules，CA；1:12000）。使用增强化学发光法开发膜（英国白金汉郡GE Healthcare）。作为负荷控制，用多克隆兔抗核仁蛋白抗体（ab22758，Abcam，Cambridge，MA；1μg/ml）对细胞膜进行再增殖。

定量实时PCR

使用三唑从mtCC或肺部分离RNA^®（Invitrogen）和RNeasy^®迷你套件（马里兰州日耳曼镇齐根）。cDNA由寡核苷酸d（T）引物合成，上标^®III逆转录酶试剂盒（Invitrogen）和dNTPs（Fisher）。鼠TrxR1引物(18)，HO-1型(22)、NQO1(11)、GCLM(21)，和β-肌动蛋白(35)（集成DNA技术，加利福尼亚州圣地亚哥），SYBR^®将绿色/ROX主混合物（Superarray，Frederick，MD）和cDNA加载到96 well板中，并使用ABI 7500实时PCR系统（加利福尼亚州卡尔斯巴德应用生物系统公司）获得Ct值。Ct值归一化为β-肌动蛋白。使用2计算折叠变化^{（−ddCt）}.

ARE荧光素酶分析

mtCC瞬时转染siTR1-3或pU6-m3控制质粒（Dolph Hatfield，NIH）、pGL2（basic）3xARE Lux（Joan Massague，Memorial Sloan Kettering，Addgene#14934）和呼吸道合胞病毒（RSV）-β-半乳糖苷酶（Y.Liu博士，Nationwide Children’s）。细胞与每孔12μg质粒DNA（6μg 3xARE:RSV-βgal[25:1]和6μg siTR1-3或对照质粒）在9.6cm²根据制造商的说明，使用JetPEI（Polyplus-Transfection）组织培养板。转染48 h后，分别使用荧光素酶报告分析系统和β-半乳糖苷酶酶分析系统（Promega）以及Veritas微孔板光度计（Promeca）测定细胞裂解液中的ARE-核糖核酸酶和β-糖苷酶活性。

细胞活力

活细胞数通过台盼蓝排除法和ATP含量通过CellTiter-Glo测定^®化验（普罗米加公司，威斯康星州麦迪逊）。培养基LDH水平测定如下：100μl试验混合物（216μlM（M）60米烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）M（M）K-磷酸盐缓冲液，0.72 mM（M）向200μl培养基中添加pH 7.5的丙酮酸，并使用Spectramax M2（加利福尼亚州桑尼维尔市分子器件）在340 nm下记录NADH氧化5分钟。

ATG管理体内

成年C3H/HeN小鼠（6-8周，n个=3）在生理盐水中接受单次静脉注射0、25、100或200 mg/kg ATG（新泽西州佛兰德斯研究诊断公司），并在注射后24 h使用静脉注射氯胺酮/甲苯噻嗪（150/15）实施安乐死。将肺部取出，置于干冰上的TRIzol中。使用TissueLyser II（Qiagen）使左肺的一部分均匀化。