MiR-30e和MiR-181d通过HtrA1调节控制放射状胶质细胞增殖

Gfap胚胎和出生后DG细胞增殖紊乱^Cre公司Dicer公司^{飞行/飞行}老鼠

我们检测了Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}通过计算IdU⁺0.05 mm装箱区域内的电池²包括SGZ和DG的hilar区。E16.5时增殖细胞总数显著减少(图2a-c)和E18.5处(图2d–f). 然后，我们研究了Tbr2在小鼠DG中的表达Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}老鼠。在DG中，我们发现在E16.5时表达Tbr2的细胞数量显著减少(图2j–l)和E18.5处(图2m–o). 通过在E18.5对磷酸化氢istone 3（pH3）阳性细胞进行计数，进一步证实了增殖细胞的耗竭(图2p–r). 在P15和P40，我们发现控制组和Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}老鼠。事实上，EdU的数量⁺背侧SVZ中的细胞约减少了八倍Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}P15和3倍的小鼠在P40时减少(图2g–i和补充图S8d–f). 我们进一步观察到P15处DG细胞结构的明显紊乱，如GFAP/Dcx标记所示(图2s和t). 这些结果表明DG的细胞构筑Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}小鼠严重精神错乱，SGZ中的细胞增殖显著减少。

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图2

Gfap公司^Cre公司-介导的Dicer失活干扰了发育中DG的细胞增殖。在来源于Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^（f）/+(一,d日和克)和Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}(b条,e（电子）和小时)分别用IdU或EdU示踪剂刺激大脑6和3小时(n个=每组3个）。方框区域，包括E16.5的DG(一和b条)，E18.5(d日和e（电子）)，表示区域（0.05 mm²)其中计算细胞数，而计算P15前脑整个DG区域的细胞增殖。在每组三个独立样本上计算增殖细胞的平均值（±S.D.），并在面板上绘制c（c）和（f）细胞增殖在P15时显著降低(克和小时)如面板所示我E16.5的相邻部分(j个和k)和E18.5(米和n个)对大脑进行Tbr2染色。在面板中绘制平均细胞数（±S.D.）我和o个E18.5大脑pH3染色(第页和q个)和pH3⁺平均数（±S.D.）绘制在面板上第页进一步对P15切片进行GFAP和Dcx（s和t）染色**P（P）<0.01; ***P（P）<0.001;t吨测试。比例尺100μ米

Gfap公司^Cre公司Dicer公司^{飞行/飞行}小鼠前脑转录组发生改变

为了确定细胞和形态变化背后的分子机制Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}我们对小鼠进行了无偏见的转录组分析Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}大脑皮层和海马(图3a). 由于我们在妊娠末期检测到细胞增殖率的显著变化以及VZ/SVZ细胞结构的明确改变，所以在P0时收集组织。由于Dicer失活后前脑内miRNAs的半衰期可变（天到月），²⁶我们推断，与神经发生相关的miRNAs不再表达于Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}此时点的前脑。在这两种组织中，大多数差异表达基因在Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}小鼠与野生型（WT）小鼠的比较。在皮层中，代表258个基因的280个探针有差异表达；其中161个探针（140个基因）上调，119个探针，118个基因下调。海马体中有510个探针（447个基因）差异表达，其中315个探针（264个基因）上调，195个探头（183个基因）下调(图3b). 海马体和皮层共有99个基因表达。令人惊讶的是，其中98个基因受到类似的调控（68个上调基因和30个下调基因），因此表明GFAP表达细胞的Dicer消融以皮层和海马的保守转录变化为特征。为了对每个特征中的基因进行优先排序，我们应用了Ingenuity软件的生物标记筛选模块，重点关注与CNS相关的基因以及在CNS中上调的基因Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}与倍数变化＞2.5的WT小鼠相比。这种筛选策略突出了这两个区域中普遍表达的八个基因。其中，五个基因在微阵列平台上根据多个探针进行差异表达。我们将注意力集中在提高HtrA1型基因，因为其蛋白产物结合广泛的转化生长因子（Tgf）-β家族蛋白（例如BMP4、BMP2和Tgf-β1),²⁷它们在神经发生调节细胞增殖或细胞存活方面起着关键作用。^28,29,30,31

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图3

转录组学强调了Gfap公司^Cre公司Dicer公司^{飞行/飞行}转基因动物。面板一显示了P0前脑的冠状切片示意图，显示了转录组分析中包含的取样微区。面板b条显示了转录组分析的工作流程。对45281个探针的原始数据进行背景减法、归一化和检测滤波相对于Gfap^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}通过LIMMA方法在生物导体封装中进行P（P）-值<0.01，折叠变化阈值为±1.7。给出了大脑皮层和海马体的不同调节探针数量以及基因。差异表达的方向用红色（上调）和绿色（下调）表示Gfap公司^Cre公司 骰子^{飞行/飞行}与小波变换相比，样本的无监督层次聚类方法对样本进行了适当的分类Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}来自WT样本。上维恩图显示了大脑皮层和海马体中共享和独特的差异表达基因（DEG），这些基因具有调节方向。最后，在Ingenuity软件中对上调的探针进行生物标志物过滤分析，分别对皮层和海马进行生物体=小鼠、组织=神经系统和折叠变化>+2.5的参数分析。这导致大脑皮层和海马体分别有23个和30个基因。底部的维恩图突出显示了（粉红色）底部列出的大脑皮层和海马体中的八种常见生物标记物。星号突出显示了阵列中多个探针显著调控的基因

HtrA1的过度表达影响发育中前脑的细胞增殖和细胞形态

P0的RT和实时PCR检测Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}大脑证实了HtrA1型信使核糖核酸(图4a–c). 通过放射性就地杂交，我们分析了HtrA1型表达式。尽管E10.5未检测到(图4d),HtrA1型在E14.5海马和神经节VZ/SVZ中检测到表达(图4e). WT皮质VZ/SVZ表达HtrA1型E18.5的可检测水平(图4f).Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}前脑表现出高度兴奋HtrA1型皮质VZ/SVZ，尤其是SGZ中的水平。此外，异位HtrA1型观察到皮层和海马板散在细胞中的表达(图4g).HtrA1型通过阻止蛋白与细胞受体结合，作为分泌BMP的负调节剂。²⁷通过敲除BMP受体抑制BMP活性，导致DG严重降低。^29,30本构活性形式的过度表达百万英镑R1a抑制福克斯G1在大脑皮层中，这表明BMP是福克斯G1.³¹图18.5Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}表现出高水平BMPs拮抗剂的大脑HtrA1型(图4g)，显示福克斯G1在海马体中(图4h–j). 转导BMP信号的磷酸化Smad转录因子（pSmad1/5/8）的水平，³²年减少了Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}小鼠(图4k和l). 因此，Msx1型由BMP信号正调控，^33,34年被下调Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}危险品(图4m和n). 因为百万英镑R1a和百万卢比双敲除小鼠表现出Prospero同源盒基因表达减少探头1在DG颗粒细胞中，²⁹我们探测了P15Gfap公司^Cre公司 骰子^{飞行/飞行}Prox1的前脑。Prox1的总数⁺细胞减少Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}前脑(图4o和p). 我们接下来进行了IUEHtrA1型-在皮层表达质粒。³⁵E13.5皮质细胞接受pCAG-GFP，无论是否含有编码小鼠的质粒HtrA1型，随后在E15.5收集胚胎。高效过度表达HtrA1型通过用HtrA1特异性抗体探测靶向前脑证实（未显示）。³⁶接受GFP质粒的VZ限制性细胞表现出典型的栅栏组织。相比之下，接受HtrA1型受到严重干扰。事实上，大量靶细胞获得了圆细胞形态，并失去了与根尖膜的适当连接(图5a和b). GFP和RC2双重染色(图5c–h)或GFP和Blbp(图5i和j)接受治疗的脑内RG细胞的细胞构筑改变得到了实质性证实HtrA1型根据牺牲日EdU公司的成立，我们注意到HtrA1型过表达损害VZ中的细胞增殖(图5k–m)，轻微但显著地降低了Tbr2的表达(图5n–p)，但不影响细胞存活(补充图S9a–d). 我们执行了IUEHtrA1型E14.5位于前脑背侧。然后在E17.5收集胚胎，并通过EdU标记概述细胞增殖。海马细胞接受HtrA1型质粒(图5q–s)Tbr2的表达也减少(图5t–v).

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图4

HtrA1在Gfap中表达增加^Cre公司Dicer公司^{飞行/飞行}前脑。WT和Gfap公司^Cre公司 骰子^{飞行/飞行}前脑(n个=每组3个）用于RT-PCR介导的检测HtrA1型.面板一显示了代表性的电泳HtrA1型（252个基点）和H3级（189 bp）扩增子。实时PCR检测Dicer公司和HtrA1型mRNA显示在面板中b条和c（c）(n个=每组3个）。现场检测HtrA1型mRNA是通过放射性检测的就地杂交(d日–克).HtrA1型在E10.5（d，n个=3），而在WT E14.5海马的VZ/SVZ和神经节隆起中检测到稳定的表达水平(e（电子）,n个=3). E18.5处HtrA1型主要在大脑皮层、海马的VZ/SVZ和DG中表达(（f）). 图18.5Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}小鼠(n个=4）显示出高表达水平的HtrA1型在大脑皮层、海马体的VZ/SVZ中(克)和DG（箭头在克). 有趣的是，HtrA1型在发育中的皮层和海马的异位细胞中都发现了表达（箭头所示克).福克斯G1表达式，测量单位就地杂交(n个=每组4人，小时,我)并通过实时PCR(n个＝每组3个，j个)E18.5海马区增加Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}老鼠。WT中E16.5海马的冠状切片(k)和aGfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}突变体(我)pSmad1/5/8免疫染色，转录因子激活BMP信号下游。缺乏Dicer的小鼠pSmad1/5/8的表达降低(n个=每组3）Msx1型由放射性物质揭示就地杂交，在Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}小鼠(n个=每组3人，米,n个). P15中Prox1表达水平显著降低Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}(o个,第页). **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001;t吨测试。比例尺100μ米

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图5

WT脑中HtrA1过度表达改变了RG细胞形态并损害了细胞增殖。pCAG-GFP质粒(一,c（c）,d日,e（电子）,我,k和n个)，有或没有质粒编码HtrA1型(b条,（f）,克,小时,j个,我和o个)在E13.5时在大脑皮层被电穿孔(n个=每组6个）。大脑有待开发子宫内然后在48小时后收集。在安乐死时用EdU刺激小鼠1小时，勾画细胞增殖轮廓。The overexpression ofHtrA1型RG细胞形态改变（a和b）。GFP和RC2的双重染色证实了前脑受试者经典栅栏形态的改变HtrA1型质粒(（f）–小时)与仅接受pCAG-GFP质粒的对照组相比(c（c）-e（电子）). 面板我和j个显示GFP和Blbp标记截面的共焦堆栈。面板中显示了为EdU和GFP双重标记的部分k和我.双阳性细胞的百分比（±S.D.）显示在面板中米平行切片进行GFP和Tbr2（n和o）染色，并在面板中显示GFP/Tbr2双阳性细胞的百分比（±S.D.）第页用pCAG-GFP质粒电穿孔E14.5野生型胚胎(q个和t吨)，有或没有质粒编码HtrA1型内侧皮质区的（r和u）(n个=每组5）。在E17.5采集样本，用EdU脉冲处理1小时，只有前脑显示GFP⁺分析包括内侧皮质的细胞。切片进行GFP和EdU染色(q个和第页)GFP/EdU双阳性细胞的百分比（±S.D.）显示在面板中秒平行切片染色GFP和Tbr2（t和u），Tbr2/GFP双阳性细胞百分比（±S.D.）显示在面板中v（v）. *P（P）<0.05; ***P（P）<0.001;t吨测试。比例尺50μ米

Mir-30e和Mir-181d与HtrA1 mRNA的3′UTR相互作用

识别miRNAs调节HtrA1型在前脑表达，我们对小鼠的3′UTR进行IUEHtrA1型克隆到雷尼利亚E13.5大脑皮层荧光素酶载体（Rluc-HtrA1-3′UTR）(图6a). 为了测量皮质增殖细胞中正常化的Rluc-HtrA1-3′UTR活性，在IUE后8 h采集前脑。在接受Rluc-HtrA1-3′UTR质粒的皮层中，荧光素酶活性显著降低，表明存在调节性miRNAs作用于HtrA1型-3英尺UTR(图6a). 基于miRBase数据库中mirSVR评分的生物信息学策略被用于预测候选miRNA，靶向HtrA1型成绩单。扫描522个核苷酸后HtrA1型-3′UTR区共鉴定出16个推测的miRNAs，其中miR-149得分最高(图6b). 此外，我们对大脑皮层或海马中上调的转录靶点进行了miRNA富集分析Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}使用Genecodis的小鼠，分离出的118和353个miRNA分别显著丰富了皮层和海马数据集的miRNA。MiR-30e和MiR-181d出现在基于HtrA1型-3′UTR区域和Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}转录组。此外，11个miRNAs，包括高分miR-149，在mirSVR预测和海马数据集中很常见。我们证实miR-30e、-149和-181d在Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}皮层和海马微区(图6c–e). 证明miRNA与3′UTR结合HtrA1型，我们用Rluc-HtrA1-3′UTR质粒共同转染HeK-293T细胞，并模拟编码miR-30e、-149和-181d。通过使用与荧光染料偶联的非相关模拟物来评估编码非相关miRNA cel-miR-67的模拟物的对照组和转染效率(图6f). 编码miR-30e和-181d的模拟物已经在低剂量下诱导了荧光素酶表达的显著降低，而编码miR-149的模拟物主要在高剂量下降低了荧光素酶的表达(图6g). 我们证实，预测的miR-30e和-181d靶点HtrA1型-3′UTR对抑制HtrA1型通过将破坏两个预测靶位点碱基配对的点突变引入Rluc-HtrA1-3′UTR构建体来表达(图6g).

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图6

miR-30e和miR-181d与HtrA1的3′UTR相互作用。的整个3′UTRHtrA1型在雷尼拉萤光素酶（RLuc）的3′表达质粒（pCAG-RLuc-HtrA1-3′UTR载体）上克隆，并与pCAG-Fluc（萤火虫萤光素酶）和pCAG-mCherry一起在E13.5前脑中电穿孔。对照组大脑接受空RLuc质粒（pCAG-RLuc-empty）(n个=每组10只小鼠），pCAG-Fluc和pCAG-mCherry。8小时后收集胚胎并用于荧光素酶检测(一). 荧光素酶的标准化百分比（±S.D.）显示在面板直方图中一.面板b条显示了miRNA富集分析和预测的工作流程。使用Genecodis工具，使用皮层（140个基因）和海马（264个基因）中上调的基因进行miRNA富集分析P（P）-阈值<0.05。在皮层和海马体中分别有188和353个富集的miRNA。在底部，miRNA预测HtrA1型使用mirSVR评分（miRBase数据库）给出了该基因。据预测，有16个miRNAs能够在3′UTR区域（522个核苷酸）结合HtrA1型基因。维恩图显示了富集和预测miRNAs的重叠，它们在右侧虚线框中列出。两种miRNAs，即miR-30e和-181d，在所有三种比较中都很常见。此外，列出了mirSVR预测和海马体共有11个miRNAs的排名。值得注意的是，mir-149在mirSVR预测中排名最高。用红色边框突出显示的是实验验证的miRNAs。海马和皮质显微解剖Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^（f）/+和Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}小鼠(n个=每组4个前脑）用于测量miR-30e的相对表达(c（c）)，miR-149(d日)和miR-181d(e（电子）). 在293T细胞中转染编码miR-30e、-149和-181d的MiRNA双链模拟物（0.1、5和20 pmol/well）以及pCAG-Ruc-HtrA1-3′UTR和pcDNA3.1-luc-frefly质粒。作为对照，我们使用模拟物编码无关的miRNA cel-miR-67（它被称为cntr-miR）。我们包括pCAG-Ruc-HtrA1-3′UTR质粒，该质粒显示HtrA1的3′UTR中miR-30e和-181d靶位点的点突变。48小时后测量萤光素酶活性（在四个独立实验中计算的平均值±S.D.），并在面板中绘制克.通过用Dy547标记的miRIDIAN microRNA模拟转染对照物转染293T细胞来评估转染效率(（f）). **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001;t吨测试。比例尺10μ米

免疫荧光&就地杂交

十μm厚切片在PBS中清洗5 min，三次，然后在室温下在封闭混合物（PBS 1×/FBS 10%/BSA 1 mg/ml/Triton 100×0.1%）中培养1 h。按照制造商的说明，将抗体稀释在封闭混合物中，并在+4°C下培养过夜。第二天，将切片在PBS中清洗5分钟，共三次，并应用在封闭混合物中稀释的荧光二级抗体（制造商说明建议的浓度）。玻片在PBS中清洗三次，每次5分钟，然后在4′-6-二氨基-2-苯基吲哚（意大利米兰罗氏Dapi）溶液中孵育用于细胞核复染。必要时，将样品在10-mM柠檬酸钠（pH 6）中煮沸5分钟，以揭开抗原。如前所述进行免疫组织化学。⁴³简单地说，切片在H中孵化₂O（运行）₂加入阻塞混合物前，3%保持20分钟。按照制造商的说明，将抗体稀释在封闭混合物中，并在+4°C下培养过夜。第二天，在PBS中清洗切片三次，并应用生物素结合二级抗体（Vector labs，Milan，Italy）2 h。然后在添加亲和素-HRP试剂（Vectors）之前清洗切片。通过将切片与3-氨基-9-乙基咔唑（AEC，Sigma）溶液孵育来揭示信号。

使用了以下抗体：兔子α-GFAP（1:1500，意大利米兰达科），兔子α-pH3（1:200，意大利米兰Millipore），鸡肉α-GFP（1:1000，英国剑桥Abcam），兔子α-GFP（1:1000，分子探针，生命技术，意大利米兰），兔子α-pSmad1/5/8（1:500，细胞信号传导，丹弗斯，马萨诸塞州，美国），兔子α-CR（1/300，斯旺，马里，瑞士），大鼠α-BrdU（1:500，Abcam），鼠标α-BrdU（1:100，BD，意大利米兰），click-it EdU AlexaFluor 595和488成像试剂（Invitrogen），兔子α-Tbr2（1:500，Abcam），鼠标α-TuJ1（1:1500，密理博），兔子α-Ki67（英国纽卡斯尔新墨西哥1:100），山羊α-Dcx（1:100，Santa Cruz Biotechnology，Inc.，德国海德堡），小鼠α-RC2（1:100，杂交瘤银行系统，爱荷华州爱荷华市，IA，美国），山羊α-Prox1（1:400，研发系统，意大利米兰），兔子α-Casp3a（1:100，NEB，Hitchin，UK），兔子α-RFP（1:500，MBL，Cornaredo，意大利），兔子α-Blbp（1:700，密理博），小鼠α-NeuN（1:1000，Chemicon，米兰，意大利），兔子α-Olig2（1:500，免疫科学，意大利罗马）。使用适当的荧光结合二级抗体（Alexa-Fluro 488、546和633分子探针）或生物素化二级抗体。细胞核用Dapi（Roche）染色。使用Light（Olympus，Milan，Italy，BX51，4×和20×物镜）和共聚焦（Leica，Wetzlar，Germany，SP5，40×客观显微镜）分析组织和细胞染色。使用Leica LCS lite软件和Adobe Photoshop CS软件进行分析。

简单地说，十μm-tick脑切片在4%多聚甲醛中固定15分钟，然后在PBS中清洗三次。载玻片在100 mM Tris-HCl（pH 8）、50 mM EDTA中0.5 mg/ml蛋白酶K中孵育10分钟，30°C。然后在4%多聚甲醛中放置15分钟。切片在PBS中清洗三次，然后在H中清洗₂O.切片在0.1 M（pH 8）三乙醇胺中培养5分钟，然后400分钟μ将1升醋酸酐添加两次，每次5分钟。最后，用H冲洗切片₂O静置2分钟并风干。在60°C下与P杂交过夜³³浓度为10的核糖探针⁶到10⁷每分钟计数（cpm）。第二天，切片在SSC 5×中漂洗5分钟，然后在60°C下在50%SSC 2×甲酰胺中漂洗30分钟。然后将载玻片在核糖核酸酶-A（Roche）20中培养μg/ml溶于0.5 M NaCl、10 mM Tris-HCl（pH 8）、5 mM EDTA中，37°C下30分钟。切片在60°C下用50%甲酰胺SSC 2×洗涤30分钟，然后在SSC 2×中冲洗载玻片两次。最后，使用乙醇系列干燥载玻片。根据制造商的说明，在暗室中涂抹Lm1（GE Healthcare Life Sciences，Milan，Italy）乳液。1周后，在暗室中显影切片，用Dapi复染并用DPX（BDH）安装溶液安装。使用了以下探针：鼠标HtrA1型根据GenBank中可获得的信息（登录号NM_019564），通过克隆该基因的整个3′UTR区来产生探针。没有信号的传感探头被用作阴性对照。鼠标Msx1型根据GenBank（登录号NM_010835）提供的信息，通过克隆该基因的3′UTR区域生成探针。非放射性就地如前所述进行杂交。^41,44 α-原位结晶蛋白探针经PCR-扩增；GenBank登录号AF039391；核苷酸392–1192（来自日本东京N.Funatsu的礼物），福克斯G1核糖探针是根据GenBank（NM_001160112）中的可用数据生成的。⁴⁴

Tunel分析

十μ将E14.5、E16.5、E18.5和P15前脑的m厚切片后固定在4%多聚甲醛中，然后在室温下在蛋白酶K缓冲液中孵育5′，然后室温下暴露于10 mg/ml蛋白酶K中15°C。通过在PBS 1×中洗涤样品三次，停止反应。然后将切片与末端转移酶缓冲液培养15°C，然后添加以下试剂：10-μg/ml生物素16-dUTP，1-mm氯化钴₂和10 U/ml末端转移酶（罗氏）。反应在37°C下培养1小时，并用h停止₂O.通过在0.1%H中培养切片来实现内源性过氧化物酶淬火₂O（运行）₂适用于15°C。切片在封闭缓冲液（10%FBS，PBS 1×）中培养15°C，然后在链霉亲和素/生物素扩增试剂盒（载体）中培养2 h。用0.05%AEC和0.005%h观察反应产物₂O（运行）₂将切片放入3 U/ml DNA酶中在室温下培养15°C，获得阳性对照。

微阵列分析

对P0前脑进行显微解剖，获取皮层和海马mRNA。这个图3a和b描述了所采用的统计和生物信息工作流程。WT和WT大脑皮层和海马的总RNAGfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}根据制造商的说明，使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）提取小鼠。根据制造商的说明，使用Illumina全准备RNA扩增试剂盒（Ambion/Life Technologies，Milan，Italy）生成cRNAs探针。根据制造商的方案在Illumina MouseWG-6_V2阵列（Illumina，Eindhoven，Netherlands）上进行杂交，并使用Illumina Bead express扫描仪获取图像文件。经过数据归一化和过滤，LIMMA算法识别了在Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行} 与WT大脑通过显著性阈值<0.01，最小折叠变化为±1.7。样本的无监督层次聚类表明，转录特征正确地分类了来自WT和Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}小鼠的皮层和海马(图3). 该阵列包含45 281个探针，代表NCBI-Refseq、Riken和Meebo数据库中包含的转录物。使用Illumina GenomeStudio-GX软件对原始数据进行背景减除和立方脊柱归一化。根据以下标准筛选探针：检测P（P）-在至少50%的样品中，值<0.05。在主成分分析（PCA）和分层样本聚类中未发现异常样本。使用R-Bioconductor平台中实现的一个Channel GUI软件包，分别对皮层和海马数据进行差异基因表达分析。⁴⁵使用LIMMA算法计算线性模型拟合。⁴⁶然后使用Ingenuity软件的生物标志物过滤器模块获得与每个组织相关的特征中的基因优先顺序（标准：生物体=小鼠，表达组织=神经系统和具有2.5倍或更多变化的上调基因）。在Genecodis工具中进行miRNA富集分析。⁴⁷

体外和体内荧光素酶检测

Hek293T细胞（5×10⁴/well）接种在24孔板中，并用pCAG-Ruc-HtrA1-3′UTR（0.05）转染（DharmaFect Duo转染试剂，Dharmacon，Thermo Scientific，Lafayette，CO，USA）μg/孔），pcDNA3.1-luc-frefly（0.025μg/well），并增加miRIDIAN microRNA Mimics（Thermo Scientific，Lafayette，CO，USA）编码浓度：cel-miR-67（阴性对照miRNA）、miR-30e、miR-149和miR181d。在以下浓度下使用模拟物：0.1、5和20 pmol/孔。pCAG-Luc-HtrA1-3′UTR质粒在miR-30e（5′-AGTT）的靶位点包含点突变tttg型CAAATG3′）和miR-181d（5′-ugGTGGCTGcagc公司TTACTTACAa-3′）作为阴性对照纳入每个实验。（粗体字母表示pCAG-Luc-HtrA1-30UTR载体的3′UTR中抑制miR-30 e和miR-181d结合的突变序列）。通过使用Dy547标记的miRIDIAN microRNA模拟转染对照进行平行转染，以5 pmol/孔的浓度评估转染效率。在光度计（Globax 20/20光度计；Promega）上使用双荧光素酶系统（Promega，Milan，Italy）测量荧光素酶活性。相对雷尼利亚荧光素酶活性报告为雷尼利亚结束萤火虫萤光素酶读数。体内荧光素酶检测在子宫内用pCAG驱动的报告质粒（pCAG-Ruc-HtrA1-3′UTR或pCAG-Luc-empty，以及pCAG-Fluc和pCAG-mCherry，每种最终浓度为1μ克/μl） ●●●●。8小时后收获胚胎子宫内开发和处理用于所述的萤光素酶测定。

实时和标准RT-PCR

根据制造商的建议，使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）提取总RNA，包括DNase（Promega）消化。根据制造商的说明书，使用ThermoScript RT-PCR系统（Invitrogen）和随机六聚体（Invit罗gen）进行cDNA合成，最终体积为20μl.实时PCR使用LightCycler 480系统（Roche）和SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix for High Throughput Q-PCR（Sigma）。cDNA分析也通过标准RT-PCR进行，在Bio-Rad C-1000热循环器上进行（38个循环，95°C-1′，65°C-30′，72°C-30’）。每个样本通过使用持家基因进行标准化组蛋白H3使用以下引物：H3 F:5′-GGTGAGAAACCTCATCGTTACAGCCTGGTAC-3′H3 R:5′-CTGCAAGCACATGCTGGAAGC-3′。用特异性引物进行基因表达分析：HtrA1 F:5′-GGCCTCGGCACGAGACG-3′HtrA1 R:5′-GCGATCTCCACACATCAGC-3′Dicer F:5’-TTTTGGACTACCTCATAACCAAGCACC-3′，Dicer R:5’-CAGAGTCCATTCTGCATCGTTC-3′。FoxG1 F:5′-CACCCCATGCCCTACAGCTCCG-3′FoxG1R:5′-AGCAGGTTGACGGAGCGGG-3′。根据制造商的建议，使用miRNeasy Mini试剂盒（意大利米兰齐根）从组织中获取总miRNA和RNA提取物。根据制造商的建议，使用miScript逆转录试剂盒（Qiagen）进行RT，使用miScript引物分析和miScript Syber green试剂盒进行扩增。使用以下miScript引物：Mm_miR-30e、Mm_minR-149、Mm_miR-181d，使用Hs_RNU1a和Hs_RNU6b引物对每个实时PCR进行归一化。

In-utero公司电穿孔

如前所述进行IUE。⁴⁸简单地说，将以下质粒导入E13.5和E14.5前脑（CD1，Charles River）的祖细胞：pCAG-GFP（0.1μ克/μl） ，pcDNA5-HtrA1（1μ克/μl） ●●●●。质粒与0.01%固绿（Sigma）和1-2混合μ每种DNA混合物中的1种通过细玻璃毛细管注入心室。电极（Tweezertrodes，BTX Harvard Instructions，Holliston，MA，USA）放置在每个胚胎心室区域的侧面，由一滴PBS覆盖，并在40 V下脉冲4次，持续50 ms，间隔950 ms，使用方波电穿孔器（ECM 830，BTX哈佛仪器）隔开。然后，将子宫角放回充满1×PBS的腹腔。E13.5电穿孔的大脑在E15.5处收集，而E14.5电穿孔的胚胎在E17.5处收集。通过电穿孔pCAG-Cherry质粒（0.1）评估RG细胞形态μ克/μl） 处于控制中Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}胚胎在E16.5。在E18.5收集胚胎，并通过免疫荧光对樱桃蛋白进行可视化处理。如上所述，将组织固定在4%多聚甲醛中。只有表现出类似电穿孔斑块的胚胎被纳入分析。图14.5Gfap公司^Cre公司 Dicer公司^{飞行/飞行}胚胎用pCAG-切里电穿孔（0.1μ克/μl） 并在5 pmol浓度下模拟编码miR-30e、-181d或cel-miR-67（阴性对照miRNA）。3天后收集胚胎并按上述方法处理。通过电穿孔Dy547标记的miRIDIAN microRNA模拟转染对照来评估电穿孔效率。

我们感谢R.Furlan博士、B.Borgiani博士和P.Brown博士的有益讨论和建议。安娜玛丽亚·尼格罗（Annamaria Nigro）在意大利米兰圣拉斐尔大学（San Raffaele University，Milan，Italy）分子医学实验神经病学项目（Molecular Medicine，Program in Experimental Neurology）完成部分博士学位后，进行了这项研究。我们感谢B.Harfe博士提供Dicer转基因小鼠，V.Shridhar博士提供HtrA1型-表达质粒。

作者贡献

LM和GM设计了这项研究；AN、RM、AB进行实验；DPT和YMC进行荧光素酶实验；RM和CF进行了计算分析；ME和AB为体内表征HtrA1型; LM、DPT、AN和CF分析数据；GM和GC为研究提供了财务支持；LM撰写了这篇论文，所有列出的作者都对文章草稿进行了评论和更正。这项工作得到了PRIN的支持，授权号为R0467。