通过靶向5-HT刺激健康组织再生_2B型慢性肝病中的受体

摘要

肝细胞再生减弱是肝病的一个特征，与导致肝硬化和癌症发展的纤维化有关^2-4肝细胞增殖的调节是复杂的，涉及驻留的非实质细胞和实质细胞之间的串扰，以及来自募集的造血细胞的额外影响⁵由于这种复杂性，目前尚不完全了解肝细胞增殖是如何调节的。例如，HSC的贡献尚未确定⁶在患病的肝脏中，HSC转分化为“激活的”肌成纤维细胞，然后通过促进细胞外基质的净沉积来驱动纤维化^2,6HSC还分泌许多可能影响肝细胞增殖的可溶性因子，包括肝细胞生长因子（HGF）、转化生长因子-β1和白细胞介素-6（IL-6）^2,6先前的研究表明HSC在肝细胞再生中具有刺激作用，但尚无定论体内已提供证据^7,8由于激活的HSC在病肝中不断生成，因此确定其对组织再生的影响至关重要。

胆道梗阻发生在多种临床情况下，可导致胆汁淤积性损伤，包括肝细胞死亡和纤维化⁹胆道结扎（BDL）是一种已建立的啮齿动物肝外胆汁淤积模型¹⁰。我们测定了选择性凋亡介导的HSC耗竭对预先建立和持续进行的BDL诱导肝损伤小鼠肝细胞增殖的影响，在这种情况下，纤维生成和实质组织再生是影响疾病进展的同步进行过程。我们使用与胶质毒素结合的单链抗体C1-3靶向HSC，胶质毒素是一种有效的促凋亡真菌代谢物^11-13C1-3识别突触素抗原，突触素在α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性的肌成纤维细胞上表达⁺肌成纤维细胞）来源于HSC的转分化。值得注意的是，之前的一项研究没有在任何其他类型的肝细胞或α-SMA中检测到突触素⁺疾病大鼠肝脏中任何其他细胞类型的肌成纤维细胞¹⁴. The体内因此，在BDL模型中施用C1-3–胶质毒素应选择性地消耗HSC衍生的肌成纤维细胞，并且不应影响门束成纤维细胞生成的肌成细胞数量。因此，我们观察到肝脏α-SMA大量但不完全耗竭⁺C1-3–胶质毒素处理的小鼠细胞(图1a). 对照单链抗体结合物（CSBD9-gliotoxin）对肝细胞增殖没有影响，跨膜蛋白F4/80和细胞角蛋白19（CK19）染色证实C1-3-gliotocin没有显著调节Kupffer细胞或胆管细胞的数量(图1b和补充图1a). 肝脏切片的增殖细胞核抗原（PCNA）染色显示，C1-3-胶质毒素治疗可刺激肝细胞增殖(图1c). HSC耗竭与刺猬靶基因表达的变化无关Gli2公司(补充图1a)，排除了hedgehog通路的激活作为HSC凋亡耗竭刺激肝细胞生长的机制¹⁵。

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图1

肝星状细胞选择性耗竭或5-HT拮抗_2B型刺激肝脏生长。(a–c)α-SMA的平均数量⁺肌成纤维细胞(一)，F4/80⁺库普弗细胞(b)和PCNA⁺肝细胞(c（c）)在接受BDL的小鼠肝组织样本中，每个字段或一组字段，然后腹腔（i.p.）注射C1-3–胶质毒素（C1-3–GT）、与胶质毒素结合的对照抗体（CSBD9-GT）或盐水载体（Cont），或在未经进一步治疗的情况下进行假手术的小鼠。(d日)接受BDL和静脉注射5-HT的小鼠肝组织样品中每个场的平均BrdU染色肝细胞_2B型拮抗剂SB-204741（2B）或载体（Cont）与假手术对照，无需进一步治疗。(e（电子）)左侧，PCNA的平均数量⁺腹腔注射CCl的小鼠肝组织样品中每场肝细胞数₄然后进行静脉注射给药（续），5-HT_2安培拮抗剂ketanserin（2A）或5-HT_2B型拮抗剂SB-204741（2B）。右，PCNA染色肝脏的代表性图像；箭头表示PCNA⁺肝细胞。误差线为平均值±标准误差。数据代表每组四只或五只小鼠*P（P）< 0.05, **P（P）使用方差分析（ANOVA）计算得出，与对照组相比，<0.01。比例尺，50μm。马力，高功率。

然后我们研究了HSC和肝细胞之间的旁分泌信号，这可能解释了HSC的抗生殖特性。血小板衍生血清素（5-HT）通过5-HT调节肝脏再生₂子类（包括5-HT_2安培，5-羟色胺_2B型和5-HT_2厘米)血清素受体¹⁶然而，最近研究表明，5-HT由胆管细胞产生，并以自分泌方式限制胆管细胞增殖¹⁷这一观察结果表明，血清素信号系统可以对实质细胞发挥增殖和抗增殖作用。我们最近确定了功能性5-HT_2B型疾病肝脏中活化HSC上的受体¹⁸因此，确定5-HT是否_2B型在肝损伤的情况下影响肝细胞再生，其中5-HT的存在_2B型HSC上可能特别相关。为了解决这个问题，我们使用了药物SB-204741，一种高度特异的5-HT分子拮抗剂_2B型对5-HT的影响可以忽略不计_2安培或5-HT_2厘米（参考。19). SB-204741在BDL诱导的进行性肝损伤和急性四氯化碳（CCl）诱导的肝损伤中刺激肝细胞增殖₄) (图1d，e). 我们观察到SB-204741对肝丝裂原肝细胞生长因子（HGF）的表达没有显著影响(补充图1b)胆管细胞增殖或刺猬信号(补充图1c). 此外，选择性5-HT_2安培和5-HT_2厘米拮抗剂酮肝素对CCl肝细胞增殖无影响₄-损伤的肝脏，表明5-HT具有特定的调节作用_2B型在这个模型中(图1e)²⁰。

确认5-HT的抗生殖影响_2B型信号，我们比较了Htr2b型^−/−（5-羟色胺_2B型基因敲除）和部分肝切除（PHX）后的野生型小鼠。未受伤的5-HT_2B型基因敲除小鼠没有肝脏缺陷的结构或生化证据(补充图2a). 通过三种独立方案测量的肝细胞增殖在5-HT中升高_2B型–PHX后36小时和72小时出现缺陷的小鼠(图2a-c). IL-6和TNF-α是肝细胞再生的引物，在术后数小时内瞬时表达^5,21; 在5-HT中，这两种因子的表达都适度增加_2B型手术后4h敲除小鼠(图2d，e). TGF-β1在肝再生终止阶段被诱导，并作为肝细胞增殖的阻遏物发挥作用^5,21我们发现，在野生型小鼠的肝脏中，TGF-β1的表达在手术后36小时诱导，并在手术后72小时保持升高。然而，在5-HT的肝脏中没有诱导TGF-β1_2B型基因敲除小鼠，但与假损伤小鼠相比，在这些时间点表达减少(图2f). 为了证实这些数据，我们在用SB-204741或ketanserin治疗的野生型小鼠中重复了PHX²⁰我们观察到，在手术后7天内，SB-204741治疗组小鼠的肝-体重量比比载体或酮肝素治疗组小鼠有所增加(图2g). 这一结果表明5-HT的选择性拮抗作用_2B型持续刺激肝脏再生。Ki67和PCNA染色显示，经SB-204741处理的肝脏中增生的肝细胞数量增加(图2h和补充图2b). 相反，用酮肝素治疗可减少Ki67的数量⁺细胞，证实了先前一份报告的结果，该报告显示血清素通过5-HT刺激肝脏再生_2安培（参考。16). 与对照组和酮肝素组相比，SB-204741治疗也抑制了肝脏TGF-β1的表达，而对照组和酮肝素组的TGF-(图2i).

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图2

5-HT基因缺失或阻断_2B型促进PHX后肝脏再生。(a–c)PCNA平均数⁺(一)，Ki67⁺(b)和BrdU⁺(c（c）)野生型（WT）或Htr2b型（5-羟色胺_2B型受体）-进行PHX或假手术的敲除小鼠。PCNA、Ki67和BrDU免疫染色的代表性图像；箭头表示阳性染色的肝细胞。(d–f日)全肝IL-6(d日)，肿瘤坏死因子-α(e（电子）)和TGF-β1(如果)WT和敲除小鼠PHX后指定时间点的mRNA水平表示为相对转录差异水平（RLTD）。(克)先接受PHX，然后腹腔注射溶媒（Cont）、酮肝素（2A）或SB-204741（2B）的小鼠的肝体比。(h、 我)Ki67的平均数量⁺每15 hp场的肝细胞数(小时)和全生命TGF-β1 mRNA水平(我)在接受PHX的小鼠中，随后腹腔注射溶媒（Cont）、酮肝素（2A）、SB-204741（2B）或假手术。Ki67染色肝脏的典型图像；箭头表示Ki67⁺肝细胞。所有图像均为放大倍率×200；比例尺，100μm。数据为平均值±标准偏差，代表每组至少四只小鼠。通过方差分析确定统计学显著性*P（P）< 0.05, **P（P）与对照组相比，0小时或36小时<0.01。

5-羟色胺_2B型在HSC的病肝中表达，在胆管细胞和Kupffer细胞中表达较低水平(补充图2c、d). 我们还发现了5-HT_2B型PHX后在HSC中诱导(图3a)，而5-HT的表达_2B型肝细胞减少(补充图2e). 用C1-3-胶质毒素治疗可以增强PHX后肝细胞的增殖，这种增强伴随着TGF-β1在肝脏的表达减少(图3b). 与BDL模型中一样，HSC的消耗并没有改变F4/80的数量⁺Kupffer细胞或CK19⁺胆管细胞，对祖细胞增殖或hedgehog信号无影响(补充图3). 鉴于HSC耗竭效应和5-HT拮抗效应之间的相似性_2B型在多发性损伤模型中，HSC可能控制5-HT的抗生殖作用_2B型然而，如果HSC耗竭和5-HT_2B型拮抗作用通过独立机制刺激肝细胞增殖，然后HSC耗竭和SB-204741治疗的联合作用有望产生额外的刺激效应(图3c). 我们在CCl后48小时在小鼠中测试了这一假设₄受伤，因为我们发现HSC在此时间点被最大程度激活(补充图4a). 我们再次观察到HSC耗竭和5-HT_2B型拮抗剂均能促进肝细胞增殖并抑制TGF-β1的表达(图3d)α胎蛋白（AFP）、CK19、Gli2或F4/80的表达没有明显变化(补充图4b)或肝损伤程度(补充图4c). 值得注意的是，将HSC耗竭与5-HT结合后，没有附加效应_2B型对抗。

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图3

5-羟色胺_2B型阻断通过抑制依赖5-HT、ERK和JunD的HSC诱导TGF-β1表达来促进肝再生。(一)5-HT的表达_2B型通过免疫细胞化学和qRT-PCR（RLTD）检测从对照小鼠或36 h PHX小鼠肝脏分离的HSC；n个=3个细胞制剂。比例尺，10μm。(b)PCNA平均数⁺和BrDU⁺PHX后72小时C1-3或C1-3-胶质毒素处理小鼠每15 hp场的肝细胞数和TGF-β1 mRNA水平。(c（c）)确定HSC是否介导5-HT再生效应的实验_2B型对抗。如果其他细胞表达5-HT_2B型则C1-3-GT诱导的HSC凋亡与SB-204741联合治疗与单独C1-3-GT-治疗相比应产生附加（++）效应。(d日)BrdU平均数量⁺腹腔注射CCl小鼠每15 hp场肝细胞数和肝脏TGF-β1 mRNA水平₄然后腹腔注射C1-3或C1-3–胶质毒素±SB-204741或载体。(e、 （f）)小鼠HSC中TGF-β1mRNA水平(e（电子）)或Kupffer细胞（KC）(如果)用5-HT±SB-204741刺激。(克)5-HT刺激大鼠HSC 4h±SB-204741（2B）或ERK抑制剂PD98059（ERK）后JunD向TGF-β1启动子募集的ChIP分析_我). (小时)在5-HT刺激之前，用PD98059或1-100μM SB-204741预处理30分钟的大鼠HSC中ERK、磷酸化ERK（p-ERK）、JunD、磷酸化JunD（p-JunD）和p38或磷酸化p38（p-p38）的Western blot检测(我)5-HT与5-HT结合后HSC中TGF-β1启动子JunD依赖ERK的募集示意图_2B型受体。(j)PCNA平均数⁺CCl 8周后，WT和JunD基因敲除小鼠在损伤高峰和恢复期（最后注射后第1-7天）肝切片中的肝细胞₄受伤。数据为每组至少四只小鼠的平均值±标准偏差*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）与ANOVA计算的对照组相比<0.001。

肝TGF-β1主要由HSC和Kupffer细胞表达。培养的原代小鼠HSC的血清素治疗增加了TGF-β1的表达，而SB-204741的治疗抑制了这种增加(图3e). 相反，培养的小鼠库普弗细胞中TGF-β1的表达受到5-HT处理的抑制，SB-204741处理阻止了这种抑制，但没有直接的刺激作用(图3f). 因此，鉴于C1-3对HSC-衍生α-SMA的特异性⁺肌成纤维细胞，我们的数据强烈表明HSC是5-HT的主要细胞类型_2B型对肝细胞增殖产生负面影响。然而，由于目前还没有成熟的基因靶向系统来实现编码5-HT基因的HSC特异性缺失_2B型，我们不能明确排除其他表达5-HT的细胞类型的微小贡献_2B型。

接下来我们研究了血清素和5-HT通过的细胞内信号通路_2B型调节它们的抗生殖作用。的转录TGFB1型受AP-1转录因子（Jun和Fos家族蛋白的异二聚体）控制。在活化的HSC中，主要的Jun亚型是JunD，其在该细胞类型中的活性由ERK介导的磷酸化控制^22-24使用染色质免疫沉淀（ChIP）分析，我们发现5-羟色胺刺激JunD与AP-1结合位点的募集Tgfb1型在大鼠和小鼠HSC中(图3g和补充图5a、b). 5-HT的拮抗作用_2B型抑制5-羟色胺诱导的JunD募集，用ERK抑制剂PD98059治疗HSC也是如此。5-羟色胺刺激大鼠ERK1和ERK2磷酸化(图3h)、小鼠和人类HSC(补充图5c、d)PD98059或SB-204741均可抑制这种反应。血清素还可诱导JunD的磷酸化，而PD98059或SB-204741可抑制JunD磷酸化(图3h). 基于这些数据，我们认为ERK对JunD的磷酸化和激活介导了5-羟色胺和5-HT对TGF-β1转录的刺激_2B型HSC中(图3i). 如果该途径在受损肝脏的背景下运作，那么JunD将被预测为肝细胞增殖的转录阻遏物。肝组织切片PCNA染色分析勇得^−/−小鼠从CCl中恢复₄与野生型小鼠相比，损伤显示有丝分裂的肝细胞数量更多(图3j)与TGF-β1表达减少相关(补充图5e). JunD在部分肾切除模型中也有类似的抑制上皮细胞增殖的作用，这归因于抑制肾小管上皮细胞中的TGF-α和表皮生长因子受体（EGFR）信号²⁵。

最近对肾脏的研究表明，生长抑制的上皮细胞通过分泌TGF-β1刺激纤维生成，在这种情况下，TGF-²⁶因此，我们确定5-HT的拮抗作用_2B型在进展性肝病模型中发挥抗纤维化作用，其中纤维生成和再生积极重塑肝脏结构。我们给老鼠注射CCl₄在继续CCl之前，每周注射两次，持续3周，以确定纤维化疾病₄使用或不使用SB-204741继续受伤5周(图4a). SB-204741治疗显著减少肝脏α-SMA的数量⁺纤维生成细胞(图4b)，纤维基质(图4c)，TGF-β1在肝脏的表达(图4d)以及编码TIMP-1和前胶原I的纤维生成基因的表达，从分子水平证实了抗纤维生成作用(图4e、f). 为了证实这些发现，我们还测定了SB-204741在进展性BDL诱导的肝病模型中的治疗效果，并观察到抗纤维化的保护作用(图4g)以及通过降低血清转氨酶ALT和AST的浓度来评估肝功能的改善(图4h). 此外，CCl中caspase 3活性的免疫组织化学分析₄模型显示，SB-204741治疗与纤维基质中细胞凋亡率较高相关，这表明组织重塑增强(补充图5f). 激活的人类HSC表达5-HT_2B型而人类肝细胞则没有(补充图5g); 因此，我们描述的机制有可能在患病的人类肝脏中发挥作用。

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图4

封锁5-HT_2B型受体可减轻肝纤维化。(一)显示治疗模型中给药方案的图表；给小鼠注射CCl₄每两周进行一次静脉注射，持续3周，然后每三周注射SB-204741（2B）或载体（Cont），以及每两周注射一次CCl₄持续5周。(b)α-SMA平均数⁺该模型中每个hp场的细胞数和α-SMA免疫染色肝脏切片的代表性图像。(c（c）)在该模型中，使用改良的Metavir量表和天狼星红（胶原沉积）染色的肝脏代表性图像进行纤维化病理学评分。(d–f日)该模型中的全肝TGF-β1、金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP1）和I型胶原mRNA水平（RLTD）。(克)小鼠接受BDL，然后从BDL后第7天开始每天腹腔注射SB-204741或载体（Cont），持续7天。使用形态分析计算每个场的平均天狼星红阳性面积。(小时)在BDL±SB-204741后14天或假手术后评估肝功能标志物血清转氨酶、丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶。显微照片放大100倍。比例尺，100μm。数据为平均值±标准误差。n个=每组5只小鼠*P（P）< 0.05, **P（P）与ANOVA计算的对照组相比，<0.01。

我们对肝脏再生的分子调控的理解主要来源于对健康肝脏的研究。在这里，我们已经解决了可能与患病肝脏再生相关的额外调节复杂性，特别是5-HT建立的信号网络_2B型-表达活化的HSC，在慢性肝病中大量存在。最初有报道称，在健康的肝脏中，血小板衍生的5-羟色胺促进肝脏再生，并且这种功能需要5-HT的活性₂受体亚类，特别是5-HT_2年在肝细胞中表达¹⁶然而，5-HT的表达_2B型与疾病肝脏相比，健康肝脏中该受体相对较低，在与纤维化组织相关的活化HSC中该受体高度表达¹⁸我们发现HSC是肝细胞增殖的关键抑制因子，这种功能是由5-羟色胺诱导的TGF-β1表达提供的，依赖于5-HT_2B型受体(补充图6). 因此，在持续纤维生成的病理生理学背景下，5-羟色胺通过5-HT作用对再生的影响_2安培肝细胞上的受体受到5-羟色胺通过5-HT作用产生的抗生殖作用的影响_2B型HSC受体。此外，我们认为这种旁分泌信号通路可以向HSC提供反馈，进一步激发其成纤维活性。在正常肝创伤修复的背景下，5-HT_2B型-活化的HSC介导TGF-β的表达可能有助于终止实质细胞增殖，这与限制再生反应以防止过度生长有关。随着肝脏损伤时间的延长，在伤口修复的分解阶段发生的活化HSC的凋亡清除将有利于通过5-HT进行再生血清素信号传导_2安培肝细胞上的受体。只有当激活的HSC持续存在并在进行性纤维生成中增殖时，抗再生血清素信号才会通过5-HT传递_2B型产生病理影响。

5-羟色胺_2B型被激活的人类HSC选择性表达，我们在这里描述的信号通路在人类HSC中是保守的。5-羟色胺的有效和选择性拮抗剂_2B型已经可供使用，并已被报告为对人类临床使用安全²⁷因此，这类药物可能在肝脏疾病中具有治疗潜力，既可以作为肝细胞再生的刺激剂，也可以作为抗纤维化剂。

方法

方法和任何相关参考可在论文的在线版本中找到，网址为http://www.nature.com/naturemedicine网站/。

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致谢

脚注

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