活细胞中蛋白质相互作用（PPI）的研究方法1对于动态和短寿命的酶-底物相互作用的分析来说是次优的。因此，目前PPI数据库中大多没有关于激酶-底物和磷酸酶-底物相互作用的数据2为了克服一些局限性，我们开发了M-Track（用于“甲基跟踪”），这是一种使用特定底物赖氨酸的酶促甲基化来检测酵母中PPI的检测方法(). 描述了一种用于哺乳动物细胞的基于生物素化的酶底物方法三但由于其高生物素化背景，不适合酵母研究。此外，这种方法似乎不适合检测短期PPI(补充图1和补充说明1). 在M-Track中，诱饵蛋白作为与人组蛋白赖氨酸（K）甲基转移酶（HKMT）SUV39H1的H320R突变体的融合蛋白表达，该突变体具有比野生型酶高20倍以上的催化活性4并且，尽管缺乏用于底物募集的色域，但足以实现组蛋白H3 Lys 9（K9）三甲基化4猎物蛋白是一种融合蛋白，具有组蛋白H3（H3标签）的氨基酸1–21的三个或四个串联拷贝，然后是血凝素（HA）表位标签。作为一个读出系统，我们使用全细胞裂解物的western blot分析，为其生成对不同H3K9甲基化状态具有高度特异性的单克隆抗体(补充图2).
用于检测HOG途径中稳定和瞬态PPI的M-轨道分析(一)M-Track分析的卡通描述。诱饵蛋白“Y”融合到人类组蛋白赖氨酸（K）甲基转移酶（HKMT）的催化结构域，猎物蛋白“X”融合到组蛋白H3的N末端和血凝素表位标签（HA）。在与诱饵相互作用后，猎物被稳定地标记为甲基化（M，甲基）。(b条)雷帕霉素诱导FKBP12-雷帕霉素结合蛋白（FRB）-HKMT和FK506结合蛋白（FKBP）-H3-HA二聚体的M-Track分析TOR1-1 fpr1型Δ酵母菌株。所示为检测示意图和带有所示抗体的免疫印迹。该图显示了归一化为HA水平的三甲基化信号的倍数变化；标绘值为平均值±标准差(n个= 3). 基本信号位于t吨雷帕霉素治疗后0分钟设置为1。CEN=着丝粒，低拷贝数酵母载体。(c（c）)Pbs2-HKMT和Sho1-H3-HA突变体的M-Track分析。体外指出了相互作用的离解常数。带有指示抗体的免疫印迹显示来自ssk2型Δ/ssk22型Δ（底部）或ssk2型Δ/ssk22型Δ/鞋类1Δ/pbs2型Δ（顶部）应变。漫画（右侧）描述了在缺乏内源性Sho1（顶部）或存在内源性Sho2（底部）的情况下，Pbs2和Sho1ΔSH3突变体之间的相互作用。(d日)Pbs2-HKMT和Ste11-H3-HA的M-Track分析。描述来自钢11Δ/pbs2型显示了在没有或存在NaCl诱导的渗透胁迫时的Δ应变。三甲化信号的折叠变化如所示b条;n个= 3.
为了评估M-Track的性能，我们首先分析了雷帕霉素诱导的FK506结合蛋白（FKBP）和FKBP12-雷帕霉素结合蛋白（FRB）的二聚化5在没有雷帕霉素的情况下，我们几乎没有检测到猎物FKBP-H3-HA的甲基化(). 加入雷帕霉素后，甲基化水平增加，单甲基化在5分钟后达到峰值，三甲基化在5分钟至15分钟之间稳定增加。接下来，我们确定了压力条件对我们的分析系统的影响(补充图3). 甲基化率随着温度的升高而显著升高，但不受渗透或氧化应激的影响。
由于我们对检测应激诱导的PPI感兴趣，我们研究了高渗压甘油反应（HOG）途径，其中跨膜蛋白Sho1通过SH3结构域与上游MAPKKK Ste11激活的MAPKK Pbs2稳定相互作用6.确定标记的蛋白质具有功能后体内(补充图4)，我们使用M-Track监测Sho1-SH3突变体与Pbs2的结合，已知该突变体的离解常数增加7我们在缺乏或表达内源性蛋白的菌株中表达了H3标记的Sho1和HKMT标记的Pbs2，这些内源性蛋白还缺乏通过Sln1分支的信号(ssk2型Δ/ssk22型Δ) (). 在鞋类1Δ/pbs2型Δ菌株，甲基化信号随着突变体解离率的增加而降低，ΔSH3突变等位基因无法检测到(). 与野生型Sho1相比，我们观察到Sho1的Y8A和Y54M突变体的甲基化信号分别减少了70%和92%。此外，我们观察到SH3突变体的Hog1磷酸化较少，表明M-Track甲基化检测的结果与生物学结果相关。
当存在内源性未标记Sho1和Pbs2时()然而，我们无法再观察到Kd日-Sho1突变体甲基化的依赖性差异，尽管野生型Sho1的甲基化程度仍高于突变体。当内源性Sho1存在时，即使ΔSH3突变体也被HKMT-Pbs2甲基化，这一观察结果可以用假设的Sho1在质膜上的同质异构化来解释()8我们得出结论，M-Track中的甲基化水平可以揭示结合亲和力，但膜或复合体中蛋白质的紧密接近也可以产生甲基化信号。我们还可以使用M-Track检测短寿命Ste11-Pbs2相互作用，并跟踪这种MAPKKK-MAPKK相互作用在渗透胁迫下的变化体内，如甲基化信号增加三倍所示().
其他众所周知难以检测的短寿命相互作用是蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（如PP2A）与其底物之间的相互作用。在酵母中，PP2A的两个调节性B亚单位Cdc55和Rts1发挥非冗余功能，可能是通过靶向不同的底物9,10尽管这些底物的身份仍然难以捉摸。一种可能的PP2A–Cdc55特异性底物是核仁蛋白Net111，但没有证据表明这些蛋白质之间存在直接相互作用12。我们使用M-Track来调查这个问题(). 经过测试，融合蛋白具有功能(和补充图5a、b)，我们探讨了Myc-HKMT-Cdc55和H3-HA-Net1之间的相互作用1-600（Net1氨基酸1-600）(). 尽管它们过度表达，但这些蛋白并没有在实质水平上协同免疫沉淀(补充图6). 在半乳糖诱导的诱饵表达后，Myc-HKMT-Cdc55在2小时后达到稳定水平，而猎物水平在整个时间过程中保持不变。随着Myc-HKMT-Cdc55水平的增加，我们观察到单甲基、二甲基和三甲基化猎物物种的时移曲线进展。这表明反应机制可能是非过程性的，并表明Myc-HKMT-Cdc55靶向H3-HA-Net11-600几次，可能在几个地点。
M-Track检测PP2A-Cdc55及其衬底Net1之间的短寿命PPI。(一)分析的卡通描述（GL，甘氨酸键；P，磷酸盐组）。(b条)显示诺康唑治疗后指示菌株相对于未治疗细胞的存活细胞±s.d.百分比的图表(t吨=0小时；n个= 3). (c（c）)Myc-HKMT-Cdc55和H3-HA-Net1的M-Track分析1-600在一个cdc55Δ/网络1Δ应变。免疫印迹显示半乳糖（Gal）诱导HKMT-Cdc55表达后，随着时间的推移Myc、甲基化和HA信号。曲线图显示甲基化信号归一化为HA水平，并以最高归一化甲基化信号（100%）±标准差的百分比绘制(n个= 3). 2μ=复制源为2μ的高拷贝数酵母载体(d日)免疫印迹显示Myc-HKMT-Cdc55和H3-HA-Net1的M-Track分析1-600（左）或H3-HA-Net11-600（3Cdk）（右）在cdc55Δ/网络1Δ应变。图（如下）的生成如下所示c（c）(n个= 3). (e（电子）)免疫印迹显示H3-HA-Net1的M-Track分析1-600和Myc-HKMT-Cdc55cdc55Δ菌株（左）、BY4741菌株中的Myc-HKMT（中）或第1部分Δ应变（右）。生成的绘图如下所示c（c）;n个= 3.
与这一发现一致，Net1在几个位点被细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk）磷酸化；这些代表了潜在的PP2A-Cdc55靶点13我们用一个Net1突变体3Cdk进行了M-Track分析，该突变体缺乏三个映射的Cdk磷酸化位点13.Myc-HKMT-Cdc55无法将3Cdk-Net1突变体三甲基化()表明有效的甲基化依赖于可磷酸化Cdk位点的存在。这些结果强烈表明Net1是一个体内PP2A-Cdc55全酶底物。单独的HKMT结构域或与PP2A第二调节亚单位Rts1的HKMT融合蛋白显示H3-HA-Net1的很少三甲基化1-600()与Myc-HKMT-Cdc55的结果相反。Rts1无法瞄准Net1并非由于HKMT融合导致其功能普遍受损(补充图5). 此外，我们可以检测到Myc-HKMT-Rts1与其假定底物Kin4之间的相互作用14(补充图7). 这些发现表明，M-Track检测PP2A和Net1之间的杂交蛋白相互作用依赖于特定B亚单位而非HKMT提供的底物特异性。
为了M-Track有效检测快速催化PPI，甲基转移酶反应需要一个具有高催化活性的HKMT突变体，该突变体也缺乏底物募集域，从而降低HKMT对其内源性底物的亲和力，并将假阳性结果降到最低。值得注意的是，甲基化水平反映了多个瞬态或稳定相互作用事件的综合总和减去蛋白质周转率，因为酵母中不存在去甲基化，这限制了M-Track在解离动力学分析中的使用。此外，甲基化率不仅取决于蛋白质相互作用的结合亲和力和持续时间，还取决于空间参数。HKMT和H3标签的位置以及连接器的设计和灵活性可能会影响系统的读数，必须进行经验评估。
高通量发现和磷酸蛋白质组筛选已经确定了大量假定的酶-底物相互作用，需要通过M-Track等方法进行验证。区分直接和间接酶靶点的能力将有助于确定现有数据集中信号级联的层次结构，并有助于更好地理解信号网络。此外，在相互作用的蛋白质上留下的甲基化特征可用于定义新合成蛋白质或不同蛋白质复合体参与者之间的生化特征差异（例如，存在翻译后修饰）。此外，HKMT催化的三步酶反应可以作为PPI持续时间的指示物。通过在蛋白质和酶结构域之间使用不同大小的间隔物，该系统可以作为稳定复合物的结构标尺。最后，我们展望了该系统的一些未来发展，例如使用质谱法进行基质识别筛选或使用微西方阵列定量分析PPI动态变化15.
方法
酵母菌株
酿酒酵母本研究中使用的菌株总结如下补充表1。突变菌株是通过基于PCR的基因靶向产生的。
质粒
本研究中使用的质粒总结如下补充表2DNA构建物是使用常规PCR、限制性内切酶和连接方法生成的。可以根据要求获得详细的克隆策略和关于单个构建体的信息。
序列。
HKMT SET结构域突变体H320R（氨基酸82–412）和H3标签的序列如所示补充说明2.
M-Track时间进程和酵母细胞提取物
对于FKBP-FRB和HOG途径研究，在选择性培养基中隔夜培养物被稀释，并在30°C下生长至指数阶段。对于雷帕霉素实验，零时间点(t吨=0）样品，其余培养物用100μg l处理1雷帕霉素（LC-实验室）。对于所有实验，细胞等同于OD600将×ml=10制成丸，通过碱后提取方法获得蛋白质提取物16.
对于PP2A时间进程研究，在含有棉子糖的选择性培养基中隔夜培养物被稀释，并在30°C下生长至早期指数阶段。然后t吨取=0的样品，用2%半乳糖培养剩余的培养物()或将培养物分离并与2%葡萄糖孵育2h(和补充图7)或2%半乳糖。将细胞制成颗粒，再悬浮在50μl/OD中600冷裂解缓冲液（1.95 M NaOH，7.5%β-巯基乙醇，H2O） 在冰上孵育10分钟；50微升/外径600然后加入冷的50%三氯乙酸，将裂解物在冰上培养10分钟。将样品离心，将颗粒重新悬浮在Laemmli蛋白样品缓冲液中，并通过SDS-PAGE进行分析。
免疫印迹法
蛋白质样品通过SDS-PAGE分离，转移至硝化纤维素膜（Amersham Pharmacia用于FKBP-FRB和Hog1通路实验，或Whatman®Protran®用于PP2A实验），并与总结于补充表3.
用于检测雷帕霉素诱导的FKBP和FRB二聚体，样品在不同的印迹上进行单（抗me1K9H3，克隆7E7-H12）或三甲基化（抗me3K9H4，克隆6F12-H4）分析。用于检测HOG途径中的蛋白质相互作用，用1%脱脂奶粉（NFDM）在磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）和0.1%吐温20（PBS-T 0.1%）中在25°C下封闭膜1小时，并在4°C下与一抗（抗me1K9H3或抗me3K9H4）孵育1.5小时以及将二级抗体（抗鼠-HRP，Jackson ImmunoResearch，目录号：115-035-008）以1:10000的比例稀释在酵母提取物溶液中（使用冷冻机/磨粉机机械破碎的1 g酵母，稀释至10 ml PBS-T 0.1%中，并补充一片完整的无EDTA蛋白酶抑制剂（Roche））。然后，在使用ECL（西皮科化学发光试剂盒，Thermo Scientific）显影之前，在0.1%的PBS-T中洗涤印迹物三次20分钟（3×20分钟）。用甲基化抗体检测后，在25°C的剥离缓冲液（2 M MgCl）中剥离印迹10分钟2，0.1 M乙酸），并用HA抗体重复。为此目的，在25°C下用5%NFDM在PBS-T中0.1%封闭印迹1小时，然后在25°C下用1:10000稀释初级（抗HA克隆12CA5或16B12，Covance，目录号MMS-101R）和次级（抗鼠-HRP，Jackson ImmunoResearch，目录号：115-035-008）培养1小时0.5%NFDM PBS-T中的抗体为0.1%。在0.1%PBS-T中清洗膜3×10min后，用ECL检测蛋白带。
用于检测Pbs2和Sho1突变体之间的不同相互作用亲和力，在甲基化检测后剥离印迹，并用含有4%BSA的Tris缓冲盐水–0.1%吐温（TBS-T 0.1%）封闭。为了检测磷酸化-Hog1，将印迹与1:4000抗P-p38 MAPK T180/Y182（细胞信号9211S）和1:6000抗兔HRP（GE Healthcare，目录号NA934V）在4°C下孵育过夜在含有2%BSA的0.1%的TBS-T中。然后在0.1%的PBS-T中短暂洗涤印迹，并如上所述重新培养HA（抗HA克隆12CA5或16B12），ECL检测到两个蛋白带（phospho-Hog1和Sho1-H3-HA）。
用于检测Cdc55和Net1之间的交互1-600在里面，样品在单独的凝胶上通过SDS-PAGE进行分析，免疫印迹并与图中所示的不同抗体单独孵育。对于中的实验对每个生物复制进行初始的10%SDS-PAGE蛋白质印迹分析，以评估三种菌株（TKY103、YBB19、YBB26）中猎物的表达水平，并使用ImageQuant定量HA水平。随后，在10%SDS-PAGE凝胶上分离归一化为HA水平的裂解物量，并在两个膜上进行印迹。其中一个先用抗三甲化抗体（抗me3K9H3）孵育，然后用Myc标记特异性抗体（克隆4A6，Millipore）再进行再蛋白表达，另一个用HA标记特异抗体孵育（克隆16B12）。在图中的实验中，分析了全细胞蛋白质的两倍量第1部分Δ应变与其他两种应变相同。
对于中的两个实验在同一凝胶上分离来自具有不同相互作用伙伴的M-Track分析的样品，并在同一膜上进行印迹。因此，在这些图中，面板源自相同膜的相同暴露。
在所有PP2A实验中，在25℃下用3%NFDM（PBS-T 0.05%）和叠氮化钠（0.002%）（封闭溶液1）封闭细胞膜1小时，并在4℃下用0.5%NFDM/PBS-T0.05%的一级抗体与硫柳汞（0.001%）（封闭液2）孵育过夜。然后用PBS-T 0.05%清洗膜3×5 min，并用HRP-结合的抗小鼠二级抗体（AffiniPure Goat anti-mouse IgG[Fcγfragment]特异性抗体，Jackson ImmunoResearch，目录号：115-035-008）1:10000在25°C的封闭溶液2中孵育1 h，然后用PBS-T 0.05%冲洗3×10 min。蛋白质带由Western Lightning ECL溶液（PerkinElmer）检测。
在用第二种一级抗体重新培养斑点的情况下(和补充图5a和6)，在0.05%的PBS-T中清洗，并按照之前所述进行处理，但将叠氮化钠（0.005%）添加到封闭溶液1和初级抗体混合物中。
免疫沉淀和蛋白磷酸酶测定。
对于免疫沉淀分析，酵母全细胞提取物的制备如前所述17除了使用Fastprep（MP生物医学，1×40 s，6 m s-1)，用于中的实验补充图6，在TBS清洗步骤之前执行额外的清洗步骤（使用0.5 M LiCl、50 mM Tris、pH 7.5）。用抗HA（克隆12CA5）或抗Myc（克隆4A6）抗体免疫沉淀HA或Myc标记蛋白，交联到BSA包被蛋白A–Sepharose珠（GE Healthcare）。免疫沉淀物用7.5%或10%的SDS-PAGE进行分析，免疫印迹并与针对Myc标签（克隆4A6）、HA标签（克隆16B12）、me3K9H3（克隆6F12-H4）、Pph21（兔pAb）、Cdc55（克隆9D3-H6）、Rts1（兔pAb）或Tpd3（克隆5G2）的特异性抗体孵育。
PP2A免疫沉淀物的磷酸酶活性测定32如前所述的P标记磷酸化酶a17将含有PP2A复合物的Myc-Cdc55/Rts1的免疫沉淀物进行两倍连续稀释，并根据免疫印迹分析和ImageQuant定量测定的共免疫沉淀PP2A催化亚单位Pph21（活性图）的相应数量绘制其磷酸酶活性。该标准曲线用于计算与Myc-Cdc55/Rts1共免疫沉淀的Pph21的比活性。由Myc-HKMT-Cdc55/Rts1共同免疫沉淀的Pph21的特异性活性表示为相对于Myc-Cdc55/Rts1相关Pph21特异性活性的百分比，该百分比设置为100%。
图像采集
对于FKBP-FRB和HOG通路研究，在Canon CanoScan N640P扫描仪上使用Scancraft（Canocraft）CS-P（3.8.2）以600 d.P.i.的分辨率在灰度模式下扫描富士医用X射线胶片。对于PP2A和生物素连接酶的研究，在佳能CanoScan 4200F扫描仪上使用Adobe Photoshop CS3以600 d.p.i.的分辨率在彩色模式下扫描开发的富士医用X射线胶片。裁剪后，图像被更改为灰度，以TIFF格式（16位）保存，并导入到Microsoft Office PowerPoint 2007中，在其中组合不同扫描的面板并添加标签。然后将所有图形导出为Adobe Acrobat PDF，并再次导入Adobe Photoshop CS3。将子图合并为最终图形，并以TIFF格式导出（600 d.p.i.，8位，CMYK，LZW-压缩）。
western blots定量。
使用ImageQuant对来自三个生物复制品的特异性抗体（Lys9甲基化特异性抗体，克隆7E7-H12，锥5E5-G5和克隆6F12-H4），抗-HA-（克隆16B12）和抗Myc-表位标签（克隆4A6）抗体）检测到的蛋白带的信号强度进行量化。甲基化信号被归一化为猎物表达水平（抗HA信号强度）。归一化值以图形方式显示在当甲基化信号在t吨= 0. 在，值表示为相对于最高甲基化信号的相对甲基化信号百分比，其被标准化为100%。结果显示为平均值±标准差。
诺卡唑试验。
该试验基于诺康唑敏感性的快速死亡试验。酿酒酵母菌株接种在Glu-CM或Glu-CM-L中−培养基，在30°C下培养过夜。我们接种了1×108细胞放入50 ml含有1%二甲基亚砜的新鲜培养基中，并在30°C下生长3小时，直至指数生长阶段。我们在YPD板上镀了300个细胞(t吨=0），然后将诺卡唑（Acros Organics）添加到剩余培养物中，使最终浓度达到15μg/ml。在2、4和6小时后，我们再次将300个细胞接种在YPD上。将平板在30°C下培养2天后，我们测定了克隆形成单位的数量，并根据在t吨= 0.
苯甲酰试验。
该试验基于苯诺明敏感性平板试验。酿酒酵母菌株接种在Glu-CM或Glu-CM-L中−培养基，在30°C下培养过夜。然后将酵母培养物稀释至OD6000.5，并在30°C下生长3 h。将对数生长培养物稀释至OD6000.8，并在含有0、20和25μg/ml苯诺明（Sigma）的YPD板上发现十倍系列稀释系列。将平板在30°C下培养2-3天，并对酵母细胞生长进行评分，以测量其对苯诺明的敏感性。
肽斑点杂交。
在点图程序中，在PVDF膜（Amersham）上发现50 pmol和10 pmol的肽，这些肽对应组蛋白H3的氨基酸1–20，并且含有未修饰的Lys9或单、二或三甲基Lys9（piCHEM和Thomas Jenuwein lab），并且通过Ponceau S染色确认等负荷。然后根据PP2A实验的免疫印迹协议处理膜（参见“免疫印迹”）。
Lys9甲基化特异性抗体的产生。
用组蛋白H3（[QTARKSTGGKA]2KC）氨基酸5-15对应的钥匙孔帽贝血蓝蛋白（KLH）偶联支链肽免疫雌性Balb/c小鼠18，其中包含单甲基、二甲基或三甲基Lys9。最后一次增强后三天，处死小鼠，通过聚乙二醇细胞融合将脾细胞与X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞融合，并在次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷（HAT）选择下生长杂交瘤细胞19融合一周后，通过ELISA对杂交瘤上清进行筛选，以对抗组蛋白H3的1–20氨基酸对应的线性肽，并携带未修饰或单、二或三甲基Lys9，以检测所需抗体的存在。将阳性克隆亚克隆并从HAT选择中分离出来，获得稳定的抗体分泌单克隆，即抗me1K9H3克隆7E7-H12、抗me2K9H2克隆5E5-G5和抗me3K9H4克隆6F12-H4。为了检测甲基化的猎物蛋白，使用了粗细胞培养上清液。
道德声明
根据奥地利动物实验法并经奥地利联邦科学研究部批准（GZ-66.009/0101-BrGT/2005和BMWF-66.009/0091-II/3b/2011），对小鼠进行维护，以及生成各种抗甲基-K9H3和PP2A抗体所涉及的所有实验程序以及维也纳医科大学动物实验伦理委员会。
