GroEL伴侣(1,2)通过排列在七元环中央空腔入口的疏水残基环捕获非天然蛋白质() (三). 当GroEL结合三磷酸腺苷（ATP）和GroES耳蜗蛋白时，巨大的结构改变使GroEL腔体积加倍，并封闭其疏水结合表面(4,5). 光谱证据(6,7)，蛋白酶保护实验(6,8)，和电子显微镜(4,9)毫无疑问，底物蛋白暂时被包裹在GroES盖下的中央空腔中。然而，尽管有许多额外的结构和生物化学研究(1,2)GroEL结构改变促进蛋白质折叠的方式尚待证明。
(顶部)非对称GroEL的晶体结构14-格罗斯7徐解决的复杂问题等. (5). GroEL的两个相对的七面环以白色和黄色显示。GroES和底物蛋白的结合位点位于每个绿色和红色螺旋对之间的顶端区域(三–5,33). 在捕获底物蛋白的膨胀较小的环（左）中，结合位点彼此相距25º。添加ATP和GroES后，每个GroEL亚单位的顶端域向上和向外扭曲，使结合位点彼此分开到33°的位置，如右侧的开放构象所示，为清晰起见，去掉了结合的GroES。相邻的结合位点以8º的距离移动，而非相邻位点以更大的增量移动，最多可达20º。与这些位点相连的底物蛋白将被强制拉伸并部分展开。[图由Z.Xu和P.B.Sigler提供；另请参见(32).] (底部)拉伸诱导T-H交换机制的示意图。在静息状态下（左侧），底物蛋白的一段被栓系在GroEL顶端结构域中七个肽结合位点中的两个之间。在底物蛋白中，有一个二级结构元素，例如打开箭头所示的β片，可以保护放射性标记的酰胺氢（T）不被交换。在包封过程中，顶端结构域的刚体运动导致肽结合位点进一步分开（右），产生底物蛋白的拉伸诱导展开和酰胺氢（H）的快速交换。
目前正在考虑两种并非相互排斥的模式。安芬森笼式模型(10)基于这样一种观点，即蛋白质折叠受到产生聚集的分子间反应的限制。该模型提出，GroEL腔提供了一个隔离的微环境，在这里可以折叠到自然状态，同时保护底物蛋白质免受聚集。然而，大量实验表明，无论底物蛋白是否达到天然状态，每一轮ATP水解都会将其从空腔中排出(11). 迭代退火模型(12)基于这样一种观点，即蛋白质慢折叠中的速率限制步骤是错误折叠和捕获的蛋白质片段的分子内重组，依赖于某种程度的蛋白质去折叠(13–15). 该模型提出，ATP水解与错误折叠的底物蛋白的强力展开及其释放耦合，无论是进入受保护的中央腔还是外部，以便错误折叠得到缓解，正向折叠可以恢复。不完全折叠的蛋白质经过进一步的迭代，在生物学上相当于通过退火进行优化(16)，直到达到本机状态。然而，没有证据表明在GroEL–腺苷三磷酸酶循环的13s时间尺度上存在依赖于GroES和ATP的去折叠反应。
我们使用未折叠核糖-1,5-二磷酸羧化酶-加氧酶（RuBisCO，来自红色红螺菌)用氢-氚交换标记。通过其对受保护RuBisCO氢交换的影响，研究了单个系统组件和参数的作用。GroEL之前的研究(17–21)使用了各种氢交换方法(22). 氚交换具有灵敏度、准确性、快速性和在复合物中聚焦于一种蛋白质的能力等优点，使我们能够在秒的生物相关时间尺度上测试整个活性伴侣蛋白系统及其单个成分。
在非许可条件下，RuBisCO折叠被阻止。它无法自发折叠(23)并且只有在完整的GroEL GroES ATP系统的帮助下才能达到原生状态(24). 当展开的RuBisCO以这种方式被捕获时，它的大多数酰胺氢与未标记的水质子迅速交换，正如预期的那样，但12个高度保护的氢的核心表现出30分钟甚至更长的交换半衰期（通过氚标签检测到）(). 发现的缓慢交换氢的数量及其保护程度确保了它们代表酰胺基团而不是侧链(22). 缓慢交换的氢提供了对结构稳定性和变化敏感的多个探针位点，可能代表也可能不代表不同RuBisCO分子中的相同位点。
未折叠RuBisCO的氢-氚交换。实验结果(36)当Rb从变性尿素稀释到自然条件（pH 8，22°±2°C）时，监测未折叠RuBisCO（Rb）保护良好的酰胺氢的交换行为，其中Rb在没有整个GroEL系统的情况下无法折叠。(A类)至(C类)显示了当阻断的Rb与GroEL（EL）结合时，无论有无GroES（ES）、二磷酸腺苷（ADP）和三磷酸核苷[ATP或β，α-亚胺基腺苷5′-三磷酸（AMP-PNP）]对保护良好的氢的影响。
所使用的条件（pH 8，22°±2°C），用于促进酰胺氢的快速交换，这些酰胺氢可能被伴侣作用暂时暴露[交换半衰期~10 ms(22)]要求捕获的氢必须在非天然蛋白质中得到高度保护，以便它们的交换速度足够慢，可以测量。测试的其他一些蛋白质提供了类似数量的慢氢，但氢的保护作用较弱（麦芽糖结合蛋白、苹果酸脱氢酶、硫丹酸盐）[另见(19)]. 受保护的RuBisCO氢很可能被隔离在部分折叠的区域中。然而，展开的RuBisCO保留了足够的非本地结构，可能在其他领域(25)，以便GroEL能够有效地捕获。通过在这些条件下未能检测到RuBisCO缔合的交联实验以及比较立即添加和延迟添加GroEL的实验，排除了缓慢氢受RuBisCO-缔合或与GroEL形成络合物保护的可能性。
对于溶液中游离的RuBisCO和与GroEL结合时，受保护氢的交换时间过程是相同的(). 对于未折叠的二硫还原α-乳清蛋白，也发现了类似的结果(18). 为了关注缓慢交换的氢，我们在少量过量的GroEL中培养标记的RuBisCO 10分钟，以便在快速交换位点用H替换T。然后将二元复合物与GroES和各种核苷酸混合(). 仅添加两倍摩尔过量的GroES对高度保护氢的交换率没有影响，镁也没有影响2+-ADP，镁2+-ATP或Mg2+-在没有GroES的情况下，AMP-PNP。类似地，β-内酰胺酶实验(20)和二氢叶酸还原酶(21)当ATP添加到不含GroES的GroEL复合物中时，未发现任何影响。
相反，添加GroES和Mg2+-ATP共同导致了除2.5个受保护氢外的所有氢的快速交换，预示着一些正在发生的事件(). 非水解AMP-PNP与ATP一样有效()这表明底物蛋白去折叠的能量来自三磷酸核苷的结合，而不是水解，并且观察到的去折叠不需要重复的系统翻转。事实上，2.5个缓慢的氢仍然存在，这表明GroEL并没有完全展开底物分子。预计即使保护结构的部分展开也会使受保护的氢发生不稳定的交换(22).
当GroEL、GroES和标记RuBisCO的化学计量混合物通过凝胶过滤柱时，所有标记都出现在络合物的位置。当加入ATP时，与GroEL结合的RuBisCO失去了除大约两个外的所有受保护的氢，而加入ADP没有影响，就像之前的实验一样。因此，此处观察到的行为涉及GroEL与单体RuBisCO的相互作用，这与二聚体RuBisCO不适合于GroEL-GroES腔的事实一致。
当添加ATP诱导蛋白质去折叠时，保护氢的交换发生在从游离氚标签分离蛋白质所需的~45秒内。为了获得更高的时间分辨率，我们将ATP添加到完全反应混合物中，并在5到12秒后添加EDTA以熄灭反应。这允许正在进行的GroEL循环继续，但排除了进一步循环(11).表明系统致力于在添加ATP后5 s内，以及在13 s周转时间内，导致快速氚损失的展开事件(26)进行一轮ATP水解。AMP-PNP的有效性也暗示了同样的结论().
单翻转实验。RuBisCO氢交换10分钟后添加ATP。上一行显示了当时保留的、未改变的氚的数量（从). 然后，在完成一次周转之前，在所示时间添加EDTA，使系统致力于完成一轮ATP水解，但禁止继续进行。
为了研究RuBisCO从复合物中的释放，我们用亚化学计量的GroEL进行了实验，GroEL:RuBisCO:1:20(). 当添加ATP时，氚损失会在10分钟内发生，因为每个GroEL复合体需要多次周转才能处理多余的RuBisCO（每次周转13秒）。中的上预测曲线假设每个RuBisCO分子仍然与GroEL结合，直到其达到自然状态（平均24次翻转），在此过程中失去氚标签。与数据相匹配的较低预测曲线假设，每个GroEL周转都会诱导敏感氢的交换，然后释放非Y活性蛋白，与所有剩余的未折叠RuBisCO分子平等竞争以重新结合（无论标记还是未标记）。使用亚化学计量GroES进行了类似实验(; RuBisCO:GroEL:GroES比率为1:1.2:0.04）。预测曲线与数据相匹配，假设GroES循环通过RuBisCO-GroEL复合物，在每次就诊时释放敏感氚标签（13 s）。
底物蛋白释放动力学。(A类)存在限制GroEL（RuBisCO:GroEL:GroES比为1:0.05:1.2）时的时间依赖性氢交换。实线来自上预测曲线（虚线）假设RuBisCO只有在平均24次移交后达到原生形态时才从综合体中释放(10)在第一个周转周期（13s），它失去了携带的氚（除了2.5个仍受保护的位点），然后不再竞争重新结合。较低的预测曲线（虚线）假设每个RuBisCO分子在一次翻转中经历了完全的氚损失（2.5个受保护的位点除外），然后在仍处于展开状态时从GroEL复合体中喷出，从而与所有其他展开的分子竞争重新结合。(B类)与限制性GroES的时间相关氢交换（RuBisCO:GroEL:GroES=1:1.2:0.04）。预测曲线假设GroES循环通过RuBisCO-GroEL复合物，并在第一次RuBisCO转换时诱导敏感氚标记的交换。氢交换（HX）与每次周转中非天然蛋白质释放的拟合方程为H=A经验[−k个b(t吨−t吨o个)]经验[−k个猫(t吨−t吨o个)] +C类.初始10分钟时间点的可交换氢总量(t吨o个)是11，由8.5个敏感氢给出(A类)和2.5个不敏感的(C类). 相关时间段（10至30分钟）内的背景非催化HX率为k个b（0.033分钟−1). 伴侣催化的HX比率(k个猫)in（A）为0.23分钟−1由1/20化学计量比和13s处理时间得出。在（B）中，k个猫为0.18分钟−1由1/25化学计量比和13s处理时间得出。（A）中天然蛋白质释放曲线的方程式近似为H（H）=[A类−N个(t吨−t吨o个)]经验[−k个b(t吨−t吨o个)] +C.A,C类、和k个b和以前一样。N个取决于天然蛋白质的线性回收率，用可交换氢标签的损失率表示（0.01分钟−1)由1/20化学计量比、13s周转时间和每次成功RuBisCO折叠24次周转得出。
这些结果表明，RuBisCO在每次系统转换时都会展开并释放，这与底物蛋白必须留在空腔中直到其达到自然状态的观点不一致。在这些亚化学计量实验中，添加AMP-PNP代替ATP不会产生可检测到的交换加速。因此，AMP-PNP支持蛋白质去折叠，但不支持释放和持续处理，而ADP不支持这两种功能。冷冻电子显微镜显示，AMP-PNP在GroEL复合物中诱导的结构变化比ATP小，而ADP没有引起可检测到的变化(4).
我们的结果与RuBisCO封装和折叠的荧光研究结果类似。黑麦等. (7)发现ATP或AMP-PNP而非ADP导致GroEL-GroES复合体内RuBisCO荧光强度和各向异性（~1s）快速下降。在ATP的情况下，这两个荧光参数的上升速度较慢，约为天然RuBisCO形成的预期速度（~5分钟）。荧光检测到的快速变化似乎与氚交换检测到的展开事件相同。黑麦等还发现，当弹射机构被禁用时，ATP的添加允许RuBisCO在GroEL腔中折叠。然而，有人认为，正常射血后，能够折叠在腔外的蛋白质。
GroEL可以在没有ATP和GroES的情况下，以被动的大规模动作感觉来展开蛋白质(27
28). 这种功能依赖于蛋白质自发展开的可逆平衡混合物中更未展开的蛋白质形式的选择性结合。即使起始材料是天然蛋白质，也可能发生这种情况(17,18,28,29)因为蛋白质分子即使在自然条件下也会自发展开和折叠(30). 部分未折叠蛋白质的结合可能有助于将其隔离，同时它们在伴侣蛋白表面折叠成天然状态。被动协助蛋白质折叠的伴侣分子可能以这种方式发挥作用。GroEL似乎不太可能处于活动状态大肠杆菌其中，ATP:GroES:GroEL的比率约为5000:2:1。
在我们的实验中，仅阻断的RuBisCO与GroEL的被动结合没有展开效应，即使在1小时的时间范围内(). 此处和Rye观察到的诱导结构变化等. (7)需要完整的能量依赖型伴侣蛋白系统，并以秒为生物相关时间尺度发生。ATP依赖性去折叠的观察似乎与GroEL功能明显相关，尤其是考虑到去折叠依赖性重组过程中蛋白质折叠受阻的速率限制性质(13).
结合在GroEL-GroES复合物中的RuBisCO分子经历了依赖能量的去折叠反应，这一证明与可用的结构信息非常吻合。分子事件的序列包括一个戏剧性的结构变化，如(2,4,5,31). 当ATP和GroES结合时，七元环中每个GroEL亚基的赤道域保持紧密接触，但顶端结合域向上向外扭曲，导致GroEL结合位点彼此远离(32). GroEL的多位点环状结构非常适合在多个点结合未折叠底物蛋白。其稳定的赤道平台及其结合位点之间距离的扩大()似乎很适合利用ATP结合的自由能产生非特异性拉伸力(33). 此外，顶端结构域的运动和GroES的结合封闭了疏水性蛋白结合表面，并有望将底物蛋白置换到空腔中。然后，折叠可以在空腔内进行，或者在移除GroES帽和蛋白质逃逸后进行。
拉伸力展现蛋白质结构的能力已经被证明(34). 部分去折叠的要求以前被认为是封闭蛋白质折叠的速率限制步骤(13). 我们在这里设想的那种机械展开装置可以在各种不同的底物蛋白质上同样良好地工作，因此解释了GroEL缺乏特异性的原因。已知其他类似结构的分子伴侣和蛋白质系统(35)可以利用相同的操作原理来展开它们的底物蛋白质。
