CD4的给药⁺CD25型^高的CD127型^负极调节性T细胞在儿童1型糖尿病中保护β细胞功能

摘要

1型糖尿病在世界范围内是一个日益严重的问题。例如，据估计，波兰的发病率每10年翻一番(1). 这种情况是由浸润胰岛并破坏胰岛素分泌β细胞的自我激活T细胞的自身免疫攻击引起的(2,三). 糖尿病动物自身活性T细胞的转移会在先前健康的动物中诱发胰岛炎和糖尿病(4). 高度抑制性调节性T细胞（Tregs）可以阻止这种自身免疫过程(5,6). 在一些动物模型中发现CD4⁺CD25型⁺福克斯P3⁺Tregs可以阻止胰岛的破坏，并防止自身免疫性1型糖尿病(7,8). 在人类中foxp3（foxp3）基因导致免疫失调、多内分泌疾病、肠病、X连锁综合征（与功能性Tregs缺乏相关）以及随后的自身免疫性糖尿病(9).

Tregs可以调节正在进行的免疫反应，因此可以用来抑制它们。2009年，我们成功地对慢性移植物抗宿主病患者进行了扩大Tregs治疗(10). 最近，这种方法在预防移植物抗宿主病方面的效果已得到证实(11,12). 在这里，我们展示了过继转移Tregs对新近诊断为1型糖尿病的儿童的影响。

研究设计和方法

在当前的研究中，10名儿童（年龄8–16岁，6名女孩和4名男孩）被诊断为符合世界卫生组织标准的1型糖尿病(13)，用Tregs治疗(补充图1). 入选标准为5-18岁；自1型糖尿病确诊后2个月内；抗GAD65抗体、胰岛细胞抗体和胰岛素自身抗体的存在；连续两次测量的空腹C肽水平>0.4 ng/mL（伦理委员会不允许进行激发试验）；特定年龄段的BMI范围为25-75%；以及足够的静脉通路。采用以下排除标准：任何细胞减少或低血红蛋白水平；携带HLA-DQB1*0602等位基因；乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒、，苍白密螺旋体或其他活动性感染；肿瘤病史；与手术相关的过度焦虑；以及需要药物治疗的慢性病。在麻醉辅助下抽取高达250 mL的外周血。对于体重<50 kg的儿童，抽取的血容量等于体重的0.5%（见研究方案和患者同意书在线补充数据).

Tregs的制备如前所述(10,14). 简而言之，血细胞被分类为CD3⁺CD4细胞⁺CD25型^高的CD127型^负极林^负极双倍的^负极Tregs使用免疫磁性/荧光激活联合技术，纯度为～100%（中位数[最小值-最大值]98%[97-99]）。与我们之前的方案相比，细胞处理方面的重要改进是应用了适用于良好生产规范（GMP）的荧光激活细胞分选机（FACS），该分选机配备了一次性样品管线（Influx；BD Biosciences，San Jose，CA），消除了交叉污染的风险，以及GMP级CellGro培养基（CellGenix，Breisgau，Germany）的应用，该培养基补充有10%自体血清、白细胞介素-2（1000单位/mL；Proleukin；Chiron，San Diego，CA）和临床级抗CD3/抗CD28珠粒（Invitrogen，Carlsbad，CA），与细胞成1:1比例。培养Tregs，直到达到所需数量，但不超过2周（中位数[最小值-最大值]：10天[7-14]）。考虑到所有这些措施，我们在最终产品中显著提高了Tregs的稳定性和质量。Tregs制剂的释放标准为FoxP3表达>90%（93%[90-97]），通过干扰素（IFN）-γ抑制试验，微生物试验阴性（无乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或HIV的遗传物质，培养上清液中无微生物污染）。将输液用Tregs完全冲洗干净，悬浮在250 mL 0.9%NaCl中（波兰波尔法，Starogard Gd.），并在产品释放后1小时内，在麻醉协助下缓慢输注给患者。给药剂量为20×10⁶/kg车身重量(n个=6）或当方案要求在2周时停止Tregs扩张时，10×10⁶/kg车身重量(n个= 4). 作为对照，其他10名1型糖尿病患者及其各自的匹配特征被纳入随访，但未接受Tregs治疗。该试验既不是盲的，也不是随机的，对比组没有进行任何干预，例如细胞处理或模拟输血的初始抽血（对比中提供的各组的临床特征表1). 研究终点为空腹C肽、HbA_1c个水平和胰岛素需求，特别注意每日胰岛素剂量（DDI；0.5 UI/kg体重）作为我们方案中缓解的临界值。该研究是根据格但斯克医科大学伦理委员会批准的方案（NKEBN/8/2010）进行的。在开始手术之前，获得了书面知情同意。

表1

患者的临床特征

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结果

在整个随访期间，服用Tregs后未观察到严重感染、急性高血糖或低血糖发作或其他不良反应。在其中一名患者中，输液与流感巧合，在手术后第二天被诊断出流感（经鼻咽标本证实[法国马西·勒托利，bioNexia influenza；bioMérieux]）。服用Tregs后，外源性胰岛素的需求显著降低，HbA下降_1c个2周后所有患者的水平(图1和补充图2和3). 此外，自治疗当天以来，外周血中Tregs的百分比显著增加（Wilcoxon试验，P（P）= 0.04) (图2和补充图2和3).

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图1

C肽、DDI、HbA_1c个和1型糖尿病儿童的空腹血糖(n个=10）。未接受Tregs治疗的匹配对照患者的数值(n个=10）显示为灰色列。数值以中间值（最小值-最大值）表示*显著差异。

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图2

CD3水平⁺CD4细胞⁺CD25型^高的CD127型^负极福克斯P3⁺Tregs输注治疗1型糖尿病儿童的Tregs(n个=10）。−10天点的值是指Tregs分类的抽血日期。灰色列描述了未接受Tregs治疗的匹配对照患者的测量值（只有6名患者可用）。数据显示为中位数（最小值-最大值）*显著差异。

在诊断出1型糖尿病半年后（服用Tregs后4-5个月），研究组和对照组首次出现显著差异。在接受Tregs治疗的10名患者中，8名患者仍处于临床缓解期，定义为DDI<0.5 UI/kg体重（DDI中位数[最小值-最大值]0.22 UI/kg重量[0–0.60]），2名患者完全失去胰岛素。同时，未接受Tregs治疗的对照组10名患者中有6名患者病情缓解（DDI 0.52 UI/kg体重[0.18–0.69]；Mann-WhitneyU型测试，P（P）= 0.04). 此外，Tregs组患者的血浆C肽水平显著高于未治疗组（0.75[0.38–2.11]vs.0.48 ng/mL[0.15–0.56]；Mann-WhitneyU型测试，P（P）= 0.01) (图1). 使用的两种Tregs剂量之间没有差异，因此，患者被列为一个队列。

结论

如前所述，糖尿病患者的Tregs可以有效地扩大(15). 然而，人们怀疑自体Tregs能否有效治疗1型糖尿病。值得注意的是，IFN-γ的一部分⁺福克斯P3⁺糖尿病患者的Tregs抑制效率降低(16). 我们也可以检测到这种细胞，尽管在我们的1型糖尿病儿童中比例很低（～1%的Tregs；数据未显示），而且它们从未影响体外抑制试验的结果。因此，1型糖尿病的大多数缺陷可能与自我激活效应T细胞有关，这可能是Tregs难以控制的(17,18). 最近在人类中发现了这种对自我slet特异的活化效应T细胞(19). 幸运的是，在NOD小鼠中，转移Tregs可以抑制自我激活效应T细胞的活性并阻止糖尿病(20). 我们的研究证实了这种Tregs移植在人类环境中的类似效果。

我们研究中使用的Tregs剂量具有生物学意义，因为它能够显著增加FoxP3水平⁺外周血中的Tregs。有几个问题使我们的协议有效。在所有已发表的试验中，应用了Tregs的免疫磁性分离，导致FoxP3的最大值为～60%⁺产品中的T细胞，但该数字可能小于20%(11,12). 因此，给患者服用的产品中至少有40%的细胞从一开始就不是Tregs。这使得很难评估具有免疫抑制活性的给药细胞的确切水平。通过FACS分拣，我们可靠地实现了～100%CD3⁺CD4细胞⁺CD25型^高的CD127型^低的福克斯P3⁺T细胞，在儿童中>90%的这些细胞仍然是FoxP3⁺膨胀后的Tregs。尽管FACS分类被认为是一种非GMP程序，但其与新分类机的安全性可与临床级免疫磁选相媲美。事实上，新型的一次性射流管线可防止交叉污染，并在洁净室设施中执行该程序，再加上由此产生的纯度，使FACS分选优于免疫磁性分选。另一个与剂量评估有关的问题是对即将使用的扩展Tregs产品进行质量检查。文献中建议，抑制增殖试验不能包括在释放标准中，因为试验开始后5天可以获得结果。在这段时间内，对扩展Treg的抑制可能会发生巨大变化。我们的IFN-γ抑制试验可以包括在释放标准中，因为在数小时内可以获得结果，并且在将Tregs转移给患者之前，产品的抑制活性得到了确认。

该研究在患者数量和时间方面存在一些局限性。此外，很可能HbA水平的快速初始下降_1c个与患者临床状况的改善以及除Tregs输液外的医疗干预有很大关系。然而，即使在我们研究的早期4个月，当我们将患者与精心匹配的未治疗受试者进行比较时，我们已经看到了胰岛素剂量和C肽水平的差异。正在进行的进一步随访将证实这是一种持续缓解还是只是胰岛破坏的延迟。

在我们看来，增加Treg数量的操作是安全和可耐受的，有可能控制1型糖尿病。正如这项研究所表明的，在最近诊断为1型糖尿病的儿童中，输注扩增的自体Tregs后β细胞功能的一些改善就是这一概念的证明。这些结果应鼓励进一步研究我们的新方法。

致谢

脚注

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