胶质母细胞瘤肿瘤细胞释放含有mRNA、miRNA和血管生成蛋白的微泡（外泌体）。这些微泡被正常宿主细胞（如脑微血管内皮细胞）占据。通过将报告蛋白的mRNA整合到这些微泡中，我们证明微泡传递的信息是由受体细胞翻译的。这些微泡也富含血管生成蛋白，并通过内皮细胞诱导小管形成。因此，肿瘤衍生的微泡作为一种新的方式向肿瘤环境中的受体细胞传递遗传信息和蛋白质。胶质母细胞瘤微泡也刺激了人脑胶质瘤细胞系的增殖，表明其具有自我运动的特性。在胶质母细胞瘤患者的血清微泡中可以检测到胶质瘤的信使RNA突变/变体和微RNA特征。25例胶质母细胞瘤患者中有7例在血清微泡中检测到肿瘤特异性EGFRvIII。因此，肿瘤衍生的微泡可以通过血液检测为癌症患者提供诊断信息并帮助他们作出治疗决定。
胶质母细胞瘤是高度恶性的脑肿瘤，尽管进行了深入的研究和临床研究，但预后较差1这些肿瘤以及其他许多肿瘤都具有显著的能力，可以将基质环境塑造成自身的优势。肿瘤细胞改变周围正常细胞以促进肿瘤细胞生长、侵袭、化疗抵抗、免疫逃避和转移2–4肿瘤细胞还劫持正常的血管系统，刺激新血管的快速形成，为肿瘤提供营养5虽然免疫系统最初可以抑制肿瘤生长，但通常会因免疫抑制途径的肿瘤激活而逐渐减弱6最近的研究表明，肿瘤细胞通过脱落膜微泡与周围细胞融合，与周围环境进行沟通的重要性7.
小泡直径为30-100纳米，在正常和病理条件下从许多不同的细胞类型脱落8这些外泌体可以通过内胚层膜向内萌芽形成，产生胞内多泡体（MVB），随后与质膜融合，将外泌物释放到外部8,9如Jurkat T细胞所示，它们也可以通过质膜的向外萌芽直接脱落10.
果蝇中的微囊泡，称为argosomes，含有无翼蛋白等形态原，并在发育中的胚胎中穿过想象盘上皮移动11精液中的微泡称为前列体，可以促进精子运动，稳定顶体反应，促进免疫抑制，抑制血管生成12另一方面，恶性前列腺细胞释放的前列腺素促进血管生成。已经证明，微泡可以将其中的一些内容物转移到其他类型的细胞13–16.
微泡的含量及其生物功能取决于来源细胞。来源于B细胞和树突状细胞的微泡具有强大的免疫刺激和抗肿瘤作用体内并已被用作抗肿瘤疫苗17树突状细胞衍生的微泡含有T细胞活化所必需的共刺激蛋白，而大多数肿瘤细胞衍生的微泡则不含。相反，它们会抑制免疫反应，加速肿瘤生长和侵袭性18–21乳腺癌微泡刺激血管生成，血小板衍生微泡促进肺癌细胞的肿瘤进展和转移22,23.
从手术切除中获得人胶质母细胞瘤组织，并使用去除微泡的胎牛血清（FBS）将肿瘤细胞分离并在培养基中培养为单层。从三个胶质母细胞瘤肿瘤中获得的培养的原代细胞在早期和晚期（1-15代）都能产生微泡。肿瘤细胞上覆盖着大小不等的微泡，大小约为50-500 nm(). 微泡中RNA和蛋白质的比例约为1:80。为了评估RNA是否包含在微泡内，他们要么暴露于核糖核酸酶A，要么在提取RNA之前不进行处理(). RNase处理后，RNA含量始终下降不到7%。因此，似乎几乎所有的RNA都包含在囊泡中，因此被周围的膜保护免受外部RNases的影响。对来自微泡及其供体细胞的RNA的生物分析表明，微泡含有与多种mRNAs和miRNAs一致的大范围RNA大小，但缺乏细胞RNA特有的核糖体RNA峰().
胶质母细胞瘤细胞产生含有RNA的微泡原发性胶质母细胞瘤细胞的扫描电镜图像（bar=10μm）。（b） 高倍镜显示细胞表面的微泡。囊泡可以分为50 nm和500 nm左右的直径（bar=1μm）。（c） 在RNA分离和测定RNA水平之前，微囊泡暴露于RNase A或模拟处理（n=5）。（d） 生物分析仪数据显示了从原发性胶质母细胞瘤细胞提取的总RNA的大小分布以及从中分离的微泡。最小峰值代表内部标准。（d）（箭头）中的两个显著峰值代表18S（左）和28S（右）核糖体RNA，在微泡中不存在。
使用Agilent 44K全基因组微阵列对微泡及其供体胶质母细胞瘤细胞中的mRNA群体进行微阵列分析。在这两种阵列上，细胞中约有22000个基因转录本，微泡中约有27000个转录本（远远高于背景水平，99%置信区间）。两种阵列的微泡中均检测到约4700种不同的mRNA，表明微泡中存在选择性富集过程(补充表1). 与此相一致的是，与两种肿瘤制剂的微泡相比，细胞中的mRNA水平总体相关性较差()支持在微泡中选择性富集一些细胞mRNA。相反，供体细胞或微泡的不同制剂中特异性mRNA水平的比较显示出强烈的相关性，表明在这些不同的细胞区室中分布一致(). 我们发现3426个转录本的差异分布超过5倍（p值<0.01）。其中，2238个转录本被富集（高达380倍），1188个转录本的含量低于细胞中的转录本（高达90倍）(). 所有基因转录物的强度和比率如所示补充表2mRNA转录物的本体论丰富或减少了10倍以上，见补充表3.
微泡RNA的表征（a，b）与来自两个不同实验的供体细胞相比，微泡中mRNA水平的散点图。线性回归显示，细胞中的水平与微泡之间没有很好的相关性。（c，d）相反，两种不同细胞或两种不同微泡制剂中的mRNA强度密切相关。（e） 发现3426个基因在微泡中的分布差异是其来源细胞的5倍以上（p值<0.01）。（f） 显示了微泡中500种最丰富的信使核糖核酸物种的生物过程本体。（g） 属于肿瘤生长相关本体的微泡RNA的强度以x轴表示，x轴表示本体中存在的mRNA转录物的数量。阵列上的中位数强度水平为182。（h） 采用定量miRNA RT-PCR分析了来自两个不同患者（GBM1和GBM2）的微泡和胶质母细胞瘤细胞中成熟miRNA的水平。循环阈值（Ct）值表示为平均值±SEM（n=4）。
与细胞相比，微泡中高度富集的mRNA转录物并不总是微泡中最丰富的。最丰富的转录物更有可能在受体细胞中产生作用。微泡中500个最丰富的mRNA转录物根据它们的本体描述被划分为不同的生物过程，并显示在绘制了属于血管生成、细胞增殖、免疫反应、细胞迁移和组蛋白修饰等本体论的胶质母细胞瘤微泡mRNA，以比较其水平和对mRNA谱的贡献(). 选择这些本体是因为它们代表了可能参与重建肿瘤基质和促进肿瘤生长的功能。与阵列的中位数信号强度水平相比，所有五个本体都包含非常高表达水平的mRNA。
用定量miRNA逆转录PCR检测微泡和供体细胞中成熟的miRNA。在两种不同的原发性胶质母细胞瘤（GBM 1和GBM 2）的供体细胞和微泡中很容易检测到胶质瘤中丰富的11个miRNA亚群（Krichevsky等人，正在准备中）(). 每μg总RNA的微泡中的水平通常低于亲代细胞（10%，对应于约3个Ct值），但与肿瘤轮廓密切相关。
用荧光染料PKH67标记的胶质母细胞瘤微泡与培养的人脑微血管内皮细胞（HBMVEC）孵育。脑内皮细胞将PKH67标记的微泡内化为内吞体样结构(). 在原发性胶质母细胞瘤细胞中加入荧光标记的微泡时，也得到了类似的结果（数据未显示）。
胶质母细胞瘤微泡可向HBMVEC传递功能RNA（a） 纯化的微泡用膜染料PKH67（绿色）标记，并添加到HBMVEC中。微泡在一小时内内化为内胚体样结构。（b）从稳定表达Gluc的胶质母细胞瘤细胞中分离出微泡。对Gluc和GAPDH mRNA的RNA提取和RTPCR表明，两者都被纳入微泡。（c） 然后将微泡添加到HBMVEC中并培养24小时。在添加微泡后0、15和24小时在培养基中测量Gluc活性，并将其归一化为微泡中的Gluc活动。结果显示为平均值±SEM（n=4）。
为了确定胶质母细胞瘤衍生的微泡递送的mRNA是否可以在受体细胞中表达，首先用慢病毒载体转导胶质母细胞瘤细胞，该慢病毒载体编码来自高斯（Gaussia）（谷氨酸）24从条件培养基中纯化了它们产生的微泡。RT-PCR分析表明，Gluc（555 bp产物）和GAPDH（226 bp产物）的mRNA存在于微泡中(). 将含有Gluc mRNA的纯化微泡添加到HBMVEC细胞中，并随着时间的推移监测这些内皮细胞释放到培养基中的Gluc活性(). 受体细胞产生的Gluc活性在24小时内持续增加，支持Gluc mRNA的持续翻译。这一新方法表明，纳入肿瘤微泡的mRNA可以传递到受体正常细胞并生成功能蛋白。
核酸作为生物标志物具有很高的价值，因为它具有高度灵敏的PCR检测。我们评估了微泡中的RNA是否可以用作胶质母细胞瘤肿瘤的生物标记物。表皮生长因子受体（EGFR）mRNA特别有趣，因为EGFRvIII突变/变异体的表达对某些肿瘤具有特异性，并定义了胶质瘤的临床亚型25我们使用巢式RT-PCR确定是否在切除的胶质瘤组织中发现EGFRvIII mRNA，并将结果与从同一患者的冷冻血清样本中纯化的微泡进行比较。对样本进行编码，并以盲法进行聚合酶链式反应。30个肿瘤样本中有14个（47%）含有EGFRvIII转录物，这与其他研究中发现的胶质母细胞瘤含有这种突变信息的百分比一致26在手术前后抽取血清的25例患者中，有7例（28%）的微泡可扩增出EGFRvIII(;补充图1). 有趣的是，两名EGFRvIII阴性肿瘤样本患者的血清微泡呈阳性，支持胶质瘤中EGFRvII表达的异质性病灶。在肿瘤广泛切除两周后采集的五份血清样本中未检测到EGFRvIII信息，其中四份对应于EGFRvII阳性肿瘤，这与该肿瘤是微泡来源一致。此外，在30名正常对照者的血清外泌体中未发现EGFRvIII(补充图2). 我们还发现miRNA-21在胶质母细胞瘤肿瘤中过度表达27与对照组相比，这些患者的血清微泡升高(补充图3). 因此，血清微泡中肿瘤特异性RNA的鉴定为了解肿瘤细胞中的体细胞突变和基因表达变化提供了一个窗口。
表1
胶质母细胞瘤微泡中的RNA可作为敏感的生物标志物使用巢式RT-PCR监测胶质瘤组织和从同一患者的冷冻血清样本中纯化的外泌体中的EGFRvIII mRNA。对30名患者的样本进行盲法分析，每个样本重复至少三次PCR反应。30名正常人血清微泡中未发现EGFRvIII mRNA。
| 患者# | 血清采集时间* | 血清容量 | 活检EGFRvIII | 血清外泌体EGFRvIII |
|---|
| 1 | 0 | 3毫升 | 是的 | 是的 |
| 2 | 0 | 2毫升 | 不 | 不 |
| 三 | 0 | 2.5毫升 | 不 | 不 |
| 4 | 0 | 1毫升 | 是的 | 不 |
| 5 | 0 | 1毫升 | 是的 | 不 |
| 6 | 0 | 1毫升 | 不 | 不 |
| 7 | 0 | 0.6毫升 | 是的 | 是的 |
| 8 | 0 | 1毫升 | 不 | 不 |
| 9 | 0 | 1毫升 | 是的 | 是的 |
| 10 | 0 | 1毫升 | 不 | 是的 |
| 11 | 0 | 2毫升 | 是的 | 不 |
| 12 | 0 | 2毫升 | 是的 | 是的 |
| 13 | 0 | 2毫升 | 不 | 是的 |
| 14 | 0 | 2毫升 | 是的 | 是的 |
| 15 | 0 | 2毫升 | 不 | 不 |
| 16 | 0 | 2毫升 | 不 | 不 |
| 17 | 0 | 1毫升 | 是的 | 不 |
| 18 | 0 | 0.8毫升 | 是的 | 不 |
| 19 | 0 | 1毫升 | 不 | 不 |
| 20 | 0 | 1毫升 | 不 | 不 |
| 21 | 0 | 1毫升 | 不 | 不 |
| 22 | 0 | 1毫升 | 不 | 不 |
| 23 | 0 | 1毫升 | 不 | 不 |
| 24 | 0 | 1毫升 | 不 | 不 |
| 25 | 0 | 1毫升 | 不 | 不 |
| 26 | 14 | 0.6毫升 | 是的 | 不 |
| 27 | 14 | 1.2毫升 | 不 | 不 |
| 28 | 14 | 0.8毫升 | 是的 | 不 |
| 29 | 14 | 0.9毫升 | 是的 | 不 |
| 30 | 14 | 0.6毫升 | 是的 | 不 |
为了研究胶质母细胞瘤微泡是否有助于血管生成，我们使用了在体外血管生成测定。HBMVEC在内皮基底培养基（EBM）、补充EBM的纯化胶质母细胞瘤微泡或EBM加血管生成生长因子（EGM）的基质涂层板中培养。在存在微泡的情况下，16小时内HBMVEC的小管长度增加了一倍，与暴露于血管生成因子时相比(). 这一发现支持了胶质母细胞瘤衍生微泡在启动脑内皮细胞血管生成中的作用。
胶质母细胞瘤微泡刺激血管生成在体外并含有血管生成蛋白a） HBMVEC在Matrigel上培养™单独在基础培养基（EBM）中，或补充GBM微泡（EBM+MV）或血管生成因子（EGM）。与在EBM中生长的细胞（n=6）相比，在16小时后测量小管形成（平均小管长度±SEM）。（b） 在人血管生成抗体阵列上分析来自原发性胶质母细胞瘤细胞和微泡（MV）的总蛋白（每个1mg）。（c） 对阵列进行扫描，并用ImageJ软件分析强度（n＝4）。
为了进一步表征微泡的血管生成能力，我们分析了微泡中血管生成蛋白的水平，并使用人类血管生成抗体阵列将其与胶质母细胞瘤供体细胞中的水平进行了比较(). 19种血管生成蛋白中有7种容易在微泡中检测到，其中6种（血管生成素、IL-6、IL-8、TIMP-1、VEGF和TIMP-2）的总蛋白水平高于胶质母细胞瘤细胞(). 三种最丰富的血管生成蛋白是血管生成素、IL-6和IL-8，它们都与胶质瘤血管生成和恶性程度增加有关28–30这表明微泡的血管生成作用至少部分由血管生成蛋白介导。
人U87胶质瘤细胞在正常生长培养基或补充了从原发性胶质母细胞瘤细胞分离的微泡的培养基中培养。三天后，未经处理的U87细胞的数量增加了5倍，而补充了微泡的细胞增加了8倍(补充图4). 因此，胶质母细胞瘤微泡似乎可以刺激其他胶质瘤细胞的增殖。
这些研究支持肿瘤细胞释放出的微泡作为一种手段的能力，肿瘤可以借此操纵其环境，使其更易于肿瘤生长和侵袭。在这项研究中，我们记录了人类原发性胶质母细胞瘤细胞大量脱落的微泡。我们对这些细胞和微泡中的mRNA和miRNA进行了表征，并表明与供体细胞相比，这些微泡中特别的mRNA高度富集。事实上，与细胞相比，在远高于背景的微泡中检测到更多的mRNA转录物。这种差异的部分原因可能是与微泡相比，细胞中有大量核糖体RNA，增加了微泡中mRNA/μg总RNA的相对数量。本体分析表明，微泡中存在大量与细胞迁移、血管生成、细胞增殖、免疫反应和组蛋白修饰相关的mRNA转录物。微泡中的miRNAs似乎平行分布于胶质母细胞瘤细胞中。
我们已经证明，胶质母细胞瘤微泡可以进入HMVEC并翻译微泡携带的报告基因mRNA。这表明肿瘤衍生的微泡可以通过改变其平移轮廓来改变周围的正常细胞。此外，我们已经证明，胶质母细胞瘤微泡可以刺激正常脑内皮细胞的血管生成表型，并可以刺激其他胶质瘤细胞的增殖。除了mRNA在这些过程中的潜在作用外，微泡还含有许多血管生成蛋白，如血管生成素、FGF、。，IL-6、IL-8、TIMP-1、VEGF和TIMP-2。其中大多数可能与内皮细胞表面的同源受体相互作用，以促进血管生成，可能需要微泡的细胞外溶解，释放其中包含的蛋白质。有人提出，已建立的肿瘤中的酸性环境可以促进一些微泡的溶解，使囊内蛋白具有生物利用性31另一方面，血管生成蛋白（如血管生成素）需要跨膜运输才能产生生物效应32这可以通过微泡来实现。因此，肿瘤微泡作为mRNA、miRNA和蛋白质的多组分递送载体，向周围细胞传递遗传信息和信号蛋白。
本研究对在微泡中富集的mRNA与供体细胞进行了彻底的分析，表明可能存在将这些信息定位到微泡的细胞机制，可能通过3′UTR中的邮政编码，如在特定细胞位置翻译的mRNA，如β肌动蛋白、肌动蛋白和肌动蛋白33微泡中mRNA的构象尚不清楚，但它们可能以核糖核颗粒（RNP）的形式存在34有证据表明，逆转录病毒，如HIV，可以利用内源性微泡机制来出芽和生成新的病毒颗粒10有趣的是，发现一些内源性逆转录病毒RNA序列在微泡中高度富集(补充表2).
在微泡中发现的RNA包含在任何给定时间的大量细胞转录组的“快照”。在胶质母细胞瘤衍生的微泡中发现的mRNA中，EGFR mRNA具有特殊的意义，因为EGFRvIII突变剪接变异体在许多胶质母细胞肿瘤中被特异性发现26使用巢式RT-PCR，我们能够在胶质母细胞瘤患者的肿瘤活检和血清微泡中检测到EGFRvIII信息，但在30份正常对照血清中没有检测到。我们发现，与其他需要侵入性脑手术的方法相比，脑肿瘤向血流中释放微泡，通过对从少量患者血清中分离的微泡RNA进行巢式RT-PCR，我们可以对胶质母细胞瘤的EGFRvIII状态进行基因分型。该检测的敏感性可能取决于肿瘤大小、肿瘤位置和血清体积等因素，以及RNA提取、cDNA转换和PCR所用的方法。有关胶质母细胞瘤患者EGFRvIII状态的信息可用于正在进行的EGFRvII疫苗和其他治疗性临床试验35一项研究表明，EGFRvIII阳性胶质瘤对EGFR-抑制剂如埃洛替尼（Tarceva®)或吉非替尼（易瑞沙®)36因此，我们提出了一种新的研究癌症分子决定因素的方法，包括但不限于EGFRvIII，方法是从血清中分离微泡并提取RNA，用于分析和检测突变、剪接变异体以及肿瘤形成、进展和治疗反应的mRNAs和miRNAs水平。
微泡可能提供了一种检测与肿瘤进展相关的进化遗传变化的方法，可以使用随时间推移提取的血清样本，推测无论是哪种类型的癌症或肿瘤病灶位于个体中的何处。此外，通过微泡分析获得的肿瘤基因型和表型知识可能有助于设计量身定制的治疗方法来抑制肿瘤生长。最后，微泡可能被证明是治疗性RNA和蛋白质的运载工具。
材料和方法
收集胶质母细胞瘤患者的肿瘤样本和血清
对于细胞培养，神经病学家诊断为多形性胶质母细胞瘤的患者的脑肿瘤标本直接从手术中取出，置于冷无菌的神经基底细胞培养基中（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。使用神经组织分离试剂盒（Miltenyi Biotech，Bergisch Gladbach，Germany）在手术后1小时内将标本分离成单个细胞，并将其置于DMEM 5%微泡缺失的dFBS中（通过110000×g超离心16小时制备以去除牛微泡）补充青霉素-链霉素（10 IU ml−1和10μg/ml−1分别位于美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）。从神经外科（美国波士顿马萨诸塞州总医院和荷兰阿姆斯特丹VU医学中心癌症研究中心）获得确认的胶质母细胞瘤患者的匹配未经鉴定的冷冻肿瘤和血清样本。这些样品在使用前保持在−80°C。
扫描EM
将人胶质母细胞瘤细胞置于鸟氨酸涂层盖玻片上，固定于0.5×Karnovskys固定剂中，然后用PBS冲洗2×5min，100%EtOH 4×10 min，然后转移至Tousimis SAMDRI-795半自动临界点干燥机，然后在GATAN 681型高分辨率离子束镀膜机中镀铬。
微泡分离
将第1-15代胶质母细胞瘤细胞培养在无微泡培养基（含5%dFBS的DMEM）中。48小时后从4000万个细胞中提取条件培养基。通过差速离心纯化微泡15简而言之，将胶质母细胞条件培养液以300×g离心10 min，以消除细胞污染。将上清液在16500×g下进一步离心20 min，并通过0.22μm过滤器过滤。以110000×g超速离心70 min制备微泡。微泡微丸在13 ml PBS中洗涤，再次造粒并在PBS中再次悬浮。使用DC蛋白质测定法（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）测量外泌体的蛋白质含量。健康对照组和胶质母细胞瘤患者的血清外泌体在PBS中稀释至13 ml，并在离心前进行无菌过滤。
RNA分离
为了评估微泡内是否存在RNA，将RNase A（Fermentas，Glen Burnie，MD，USA）以最终浓度100μg/ml添加到微泡悬浮液中，并在37°C下培养15分钟。然后根据制造商的协议，使用MirVana RNA分离试剂盒（Ambion，Austin TX，USA）纯化总RNA。使用纳米滴ND-1000对RNA进行定量（Thermo Fischer Scientific，Wilmington，DE，USA）。根据制造商的建议，在RNAlater ICE（Ambion，Austin TX，USA）上解冻快冻肿瘤活检组织，然后使用MirVana RNA分离试剂盒提取RNA。
微阵列分析
微阵列实验由Miltenyi Biotech（美国加利福尼亚州奥本市）使用安捷伦全人类基因组微阵列，4×44K，双色阵列进行。该阵列是在两种不同的来自原发性胶质母细胞瘤细胞及其微泡的RNA制剂上进行的。使用GeneSifter软件（美国华盛顿州西雅图Vizxlabs）对数据进行分析。Intersector软件（Vizxlabs）用于提取两个阵列上容易检测到的基因。
定量miRNA RT-PCR
使用mirVana RNA分离试剂盒分离总RNA。使用特定的miR-引物（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）将总RNA（30 ng）转化为cDNA，并根据制造商的方案进一步扩增。
HBMVEC体外血管生成试验
HBMVEC（30000）（Cell Systems，Catalogue#ACBRI-376，Kirkland，WA，USA）仅在基底培养基（Lonza Biologics Inc.，Portsmouth，NH，USA）的24孔板中的Matrigel涂层孔上培养，或补充胶质母细胞瘤微泡（7μg/孔）或血管生成因子混合物（EGM；氢化可的松、EGF、FGF、VEGF、IGF、抗坏血酸、FBS和肝素；来自Lonza的Singlequots）。16小时后测量小管形成，并使用ImageJ软件（NIH）进行分析。
Gluc mRNA翻译分析
在巨细胞病毒启动子下表达分泌型Gluc的自失活慢病毒载体感染原发性人类胶质母细胞瘤细胞37感染效率>95%。细胞被稳定转导，随后的传代（2-10）中产生的微泡被如上所述分离和纯化。将微泡（50μg）添加到50000 HBMVEC中并培养24小时。在添加微泡（0小时）后直接测量上清液中的Gluc活性，15小时和24小时后将其归一化为微泡中的Glug活性。结果显示为平均值±SEM（n=4）。
PKH67标记的微泡
如前所述，用PKH67绿色荧光标记试剂盒（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）标记纯化的胶质母细胞瘤微泡21标记的微泡在培养基（5μg/50000细胞）中与HBMVEC孵育。微囊泡在4°C下结合20分钟，然后清洗细胞并在37°C下培养1小时。
逆转录聚合酶链式反应和巢式聚合酶链式反应
使用MirVana RNA分离试剂盒提取RNA。根据制造商的建议，使用Omniscript RT试剂盒（如果起始材料>50 ng）或Sensisccript RT药盒（如果初始材料<50 ng）（Qiagen Inc.，Valencia，CA，USA），使用寡核苷酸和随机六聚体引物的混合物，将RNA转化为cDNA。使用了以下PCR引物：GAPDH引物；前5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3′，后5′-GAA-GAT GAT GGT GGT ATT TC-3′。EGFR/EGFRvIII PCR1；前5′-CAGATTGATCGGGAGC-3′，后5′-TCAGAATCCAGTCTGTG-3′，EGFR/EGFRvIII PCR2；前5′-ATG CGA CCC TCC GGG ACG-3′，后5′-GAGG TAT GTG TGA AGG AGT-3′。Gluc引物已在上文24中描述。PCR方案：94°C 3 min；94°C 45秒，60°C 45 s，72°C 2分钟×35次循环；72°C 7分钟。
血管生成抗体阵列
根据制造商的建议，在Promega裂解缓冲液（美国威斯康星州麦迪逊市Promega）中裂解来自原发性胶质母细胞瘤细胞或从同一细胞分离的纯化微泡的1 mg总蛋白，然后添加到人类血管生成抗体阵列（美国加利福尼亚州弗里蒙特市Panomics）中。使用ImageJ软件（NIH）对阵列进行扫描和分析。
