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公共科学图书馆忽视奖杯。2012年7月；6（7）：e1736。
2012年7月31日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pntd.001736
预防性维修识别码：项目经理3409115
PMID：22860142

多种靶向抑制剂化学类型克氏锥虫密码51

沙米拉·古纳提列克,#1,2 克劳迪娅·卡尔维,#1,三 乔纳森·约翰斯顿,4 陈清光（Chiung-Kuang Chen）,1,4 格里戈里·埃伦伯格,5 吉里·古特,1,2,6 胡安·恩格尔,1,2 肯尼·K·H·昂,7 约瑟夫·穆尔瓦尼,7 陈士骏,7 米歇尔·阿尔金,7 詹姆斯·麦克罗,1,2和拉里萨·波杜斯特（Larissa M.Podust）1,2,*
Michael P.Pollastri，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

背景

恰加斯病是世卫组织和国家卫生研究院指定的一种被忽视的热带疾病，在拉丁美洲流行，在北美和欧洲由于人口流动而出现新的感染。尽管查加斯病是心力衰竭发病率和死亡率的主要原因，也给受影响地区带来了沉重的经济负担，但由于不利的经济刺激因素，该病很少引起制药行业的注意。发现和开发治疗恰加斯病的新的化疗途径显然是当务之急。

方法/主要发现

病原真菌与寄生原生动物膜固醇需求的相似性克氏锥虫Chagas人类心脏病的病原体，导致了甾醇14α-脱甲基酶（CYP51）的抗真菌唑类抑制剂被重新用于治疗Chagas病。为了使抗乍得药物候选药物的治疗渠道多样化，我们采用了一种方法，包括直接探测T.cruzi公司CYP51活性位点与合成小分子库。基于靶向的高通量筛选将约104000个小分子库减少到185个，估计K为纳米摩尔天值，同时对进行交叉验证T.cruzi公司-受感染的骨骼肌成肌细胞与EC产生57次活性碰撞50<10µM。两个点击池部分重叠。顶击被禁止T.cruzi公司带EC5017 nM，40 nM时杀锥虫。

结论/意义

这些结果在结构上是不同的，表明CYP51是一种对小分子来说相当宽容的酶靶点。化学信息学分析表明，CYP51药理学与其他细胞色素P450治疗靶点相似，包括血栓素合成酶（CYP5）、脂肪酸ω-羟化酶（CYP4）、17α-羟化酶/17,20-裂解酶（CYP17）和芳香化酶（PYP19）。令人惊讶的是，谷氨酰胺肽环转移酶与CYP51在序列或结构上无关，具有很强的相似性。制药公司针对这些靶点开发的先导化合物也可以用于克氏锥虫.

作者摘要

恰加斯病是拉丁美洲心脏病的主要病因，也是欧洲和北美新出现的感染。查加斯病的临床表现由原生动物寄生虫感染引起克氏锥虫导致进行性心肌病。没有疫苗可用，化疗选择仅限于苯硝唑和硝呋替莫，这两种药物在急性期使用，但可能引起严重的胃肠和神经副作用，在慢性期不常用。这两种药物均未经FDA批准在美国使用。迫切需要有效的新疗法。经验证的治疗靶点T.cruzi公司CYP51是甾醇生物合成途径中的一种必需酶。我们报告了直接针对CYP51的小分子高通量筛选结果，由在体外点击的中等吞吐量筛选T.cruzi公司-受感染的哺乳动物细胞。我们已经鉴定出一种强效克鲁兹霉抑制剂，以及对CYP51具有高亲和力的多种低分子量命中物。我们应用计算化学将CYP51与其他药理学靶点联系起来。这项分析使我们能够识别制药公司已经生产的分子，以便将来对其进行实验测试T.cruzi公司.

介绍

寄生原生动物克氏锥虫是恰加斯病的病原体，由该亚科的吸血昆虫自然传播三口目 [1]临床批准的用于该病急性和慢性阶段的药物范围有限，迫切需要新的药物[2]–[4]寄生虫细胞膜的完整性取决于特定的内源性合成的24-甲基化甾醇[5]在临床相关无鞭毛虫阶段，不能被从宿主中清除的胆固醇完全替代的膜构建块。甾醇生物合成途径T.cruzi公司因此，对受感染的人类宿主中复制性细胞内无鞭毛阶段的生存至关重要[5]–[7].膜固醇需求之间的相似性T.cruzi公司致病真菌的药物导致了将抗真菌的唑类和三唑类药物重新用于治疗恰加斯病的想法。例如，泊沙康唑和ravuconazole靶向固醇生物合成的关键酶固醇14α-去甲基酶（CYP51），因此具有治疗潜力[8]–[12]CYP51抑制剂在细胞内无鞭毛期耗尽内源性24-甲基化甾醇，导致细胞膜起泡，内膜恶化，最后T.cruzi公司细胞死亡[13],[14].

“康唑”家族的商业抗真菌药物来源于主要用于真菌感染局部治疗的咪康唑[15]Posaconazole是该家族最新上市的成员，被认为不仅是对抗系统性危及生命的真菌感染的治疗药物的宝贵补充[16],[17]，但也是恰加斯病的临床试验候选者。波沙康唑的抗乍得毒性已在一个动物模型中得到证实T.cruzi公司感染[9],[18],[19]在人类中[12]然而，潜在的耐药性、成本和安全性问题影响了唑类药物的预期用途。为了扩大可最有效地用于治疗恰加斯病患者的CYP51抑制剂的范围，我们采用了一种方法，该方法依赖于用不同化合物直接探测CYP51活性位点，以确定抑制剂可利用的化学和结构空间。该方法基于高通量筛选、药物化学、结构生物学和化学信息学的进展，并利用它确定了一系列有前景的分子支架。

作为P450家族的一员，CYP51具有P450酶的共同光谱特性，在这种酶中，铁Fe Soret带在水分子（弱轴向配体）被更强的配体（通常是含氮脂肪族或芳香族的配体）置换（I型移位）或替换（II型移位）后发生移位[20]光谱变化的浓度依赖性允许估计配体的结合亲和力。利用这些特性的光谱分析通常用于探索低通量形式的P450配体相互作用。该分析的三个主要优点使其对高通量应用具有吸引力，即其简单性、适用于特性较差的酶以及通用性，因为它可以很容易地用于分析任何以可溶性形式获得的CYP。然而，该分析的主要缺点是，UV-vis吸收光谱的吞吐量相对较低，且固有的灵敏度较低，这需要使用微摩尔蛋白质浓度进行筛选。这反过来可能会对测试化合物的光学特性或溶解度造成干扰，并增加假阳性和假阴性点击的数量[21]尽管存在这些缺点，但基于血红素铁Soret带对小分子结合反应的移位的高通量筛选（HTS）分析已成功应用于CYP51的对应物结核分枝杆菌 [22]，最终鉴定出一种强效T.cruzi公司抑制剂[14],[23]其治疗恰加斯病的药物性质目前正在优化中。

一种具有结构特征的高表达重组体的成功开发T.cruzi公司密码51[24]导致建立了一个实验平台，用于直接高通量探索CYP51活性位点，该活性位点能够容纳更大、更多样化的库。在这里，我们描述了一个约104000个小分子的文库是如何用估计的K减少到185个结构多样的正点击天纳米摩尔范围内的值。打击的交叉验证T.cruzi公司哺乳动物细胞中培养的寄生虫显示57次抗-T.cruzi公司EC定义的活动50值低于10µM。虽然高亲和力点击之间的结构相似性区域是由能够与血红素铁配位的芳香杂环的需求决定的，但分子的其他部分并不受限制，允许潜在打击中前所未有的结构多样性，并为CYP51的药物化学探索开辟新的视野。

材料和方法

CYP51靶向表达和纯化

先前构建的表达式向量[24]用于生成重组体T.cruzi公司本工作中描述了CYP51。HTS筛网中使用的CYP51将K22上游的前21个残基替换为片段MAKKKK，并且是His6-在C末端设计的标签。蛋白质按别处所述进行纯化[24]并通过12%SDS-PAGE观察到几乎是均匀的。将20 mM磷酸钾、pH 8.2、10%甘油、0.5 mM EDTA、1 mM DTT和200 mM NaCl中含有CYP51的色谱组分合并、浓缩并储存在−80°C下。正如预期的那样，酶溶液在420 nm处出现吸收峰，用连二亚硫酸钠还原并用CO起泡后出现449 nm峰[24]。功能性P450的浓度是使用消光系数ε从不同光谱中测定的450–490 = 91000万−1厘米−1 [25]纯化后的CYP51在室温下的筛选条件下可稳定4小时。

高通量分析概述

加州大学旧金山分校小分子发现中心（SMDC）的化合物库由103986种不同的小分子组成，这些小分子购自ChemBridge（加利福尼亚州圣地亚哥）、ChemDiv（加利福尼亚州圣迭戈）和SPECS（荷兰代尔夫特）T.cruzi公司384井格式的CYP51，使用为结核分枝杆菌CYP51和其他说明[21]协议中引入了以下修改，以提高测量的信噪比、吞吐量和再现性。首先，将工作蛋白浓度提高到2µM，并使用双波长检测在12.5µM下筛选化合物。在此主屏幕中，在425 nm和390 nm处进行平板读数，对应于CYP51活性位点中II型结合产生的差异光谱的最大值和最小值( 图1 ). II型抑制剂的特点是与血红素铁的配位键，这是有助于靶亲和力的单一最强的相互作用。接下来，为了考虑有机溶剂效应、蛋白质背景和测试化合物的光学特性，制备了两个平板，目标蛋白质仅装在一个平板上。分别读取和处理后，从蛋白-微量参考板中产生的值减去蛋白+测试板中的相应值，得出仅由蛋白复合物相互作用引起的吸光度贡献( 图1 ). 最后，为了验证两个波长的阳性点击，使用光谱检测模式测试了从2µM到12.5µM的四个系列稀释液的阳性点击子集，光谱记录在350 nm到500 nm之间。

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高通量分析概述。

T.cruzi公司CYP51靶被平面夹住，穿过基板结合通道(顶部,中心). 在参考化合物的饱和浓度下，记录1µM CYP51的II型差异光谱(顶部,正确的). 筛板一式两份，A和B，目标蛋白仅装在A组中(左边). HTS散点图显示了试验化合物的吸光度差异（ΔA=A425−A390)使用双波长检测模式测量；每个点代表一个测试化合物(底部,中心). 在四次连续稀释的光谱模式下，对亚微摩尔撞击进行了重新评估，显示了重叠光谱(底部,正确的).

图版设计、准备和阅读

所有测量均在100 mM磷酸钾溶液中进行，pH值为7.5，并添加10%甘油，根据 图1 、二甲基亚砜（DMSO）（第1列和第2列）、参考化合物（第23-24列）或个别受试化合物（第3~22列）的要求浓度。首先，使用Wellmate液体分配器（Thermo Fisher Matrix）将仅含缓冲液（参考板）或含有2µM CYP51的缓冲液（样品板）分配到80µl等分中。然后使用配备P20尖端的自动384孔吸移器（Biomek FXP，Beckman Coulter）将测试化合物、参比物或DMSO添加到1µl等分中（Fluetics Inc.）。化合物{α-[（4-甲基环己基）羰基氨基]-N-4-吡啶基-1H-吲哚-3-丙酰胺}购自ChemDiv（#C155-0123）（加利福尼亚州圣地亚哥），先前称为LP-10[14],[23],[26]，用作II型参考。在DMSO中以高于工作浓度80倍的浓度制备化合物和参考储备溶液。根据需要单独使用二甲基亚砜，以保持整个油井的二甲基亚磺酸盐浓度恒定在1.25%。准备好后，在滴定板摇床（德克萨斯州帕萨迪纳Labline Instrument，Inc.）中旋转平板3分钟，转速为800 rpm，脉冲离心10秒，转速为1000 rpm（250 g）（Marathon 3000R，Fisher Scientific），以去除气泡。使用多模平板读取器（SpectraMax M5，分子器件），在双波长模式下在425 nm和390 nm处记录吸光度，或在光谱模式下在350 nm至500 nm之间以10 nm增量（共16次测量/化合物）记录吸光度。

板读数分析

使用Microsoft Office Excel 2007对数据进行操作和分析。读取每对测试板和参考板的值，并将其导出到预先编程的Excel模板中，并使用中所示的算法进行处理表S1首先，对每个平板分别进行处理，以说明二甲基亚砜和蛋白质背景的影响。在这一步中，对第1列和第2列中所有32个孔的每个波长的吸光度值进行平均。从每个单独化合物（第3列至第22列）或参考物（第23列至第24列）在相同波长下测得的吸光度中减去所得值。接下来，参考板中校正的吸光度值(表S1B)从测试板上相应的孔中减去(表S1A)，仅由于蛋白质-化合物相互作用而产生在每个波长的吸光度贡献。在双波长模式下，ΔA=A425−A390对每个化合物进行计算，并根据相应的井绘制( 图1 ). 由于Soret带变红，ΔA是II型撞击的正值。在光谱模式下，校正的吸光度值直接绘制为波长。叠加并目视检查产生的差异结合光谱，以消除假阳性点击，并按照其与CYP51靶的亲和力顺序排列其余化合物( 图2 ).

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在光谱模式下获得正点击。

对每种测试化合物的四种系列稀释液的吸光度进行监测。(A类)缺少特征光谱-核心0；(B类)无光谱重叠的浓度依赖性-得分1；(C类)任意两个光谱重叠-核心2；(天)任何三个光谱重叠-核心3；(E类)三个最高浓度重叠核心4；(F类)所有四个光谱都与核心5重叠。

在频谱模式下对正点击进行排名

出于排名的目的，化合物根据其光谱的外观进行评分。分数为0的假阳性化合物点击未能显示特征II型光谱( 图2A ). 具有浓度依赖性且无重叠光谱的点击得分为1，而具有任何2或3个重叠光谱的命中得分分别为2和3( 图2B-D ). 三个最高浓度光谱重叠的化合物得分为4( 图2E ). 最后，所有四个光谱重叠的命中，包括最高和最低浓度的光谱，在该系统中获得了5分( 图2F ).

低通量UV-vis结合分析

低通量UV-vis结合分析中的命中验证是根据先前发布但有所修改的方案进行的[14]在Cary扫描分光光度计（Varian）上记录UV-vis吸收光谱，在23°C下，在100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.5，含10%甘油，CYP51浓度为0.5µM）中的1 cm路径长度石英试管中。在100µM的二甲基亚砜中制备用于滴定的复合溶液，并使用P2移液管（Gilson）将2-µl等分液添加到每个3 ml样品中。使用二次紧束缚方程估计了点击的结合亲和力[27]:

方程式图像
(1)

其中A光突发事件是在任何配体浓度下测定的吸收位移；A类最大值是饱和时获得的最大吸收位移；K（K）天是抑制剂-酶复合物的离解常数；S是配体浓度；E类吨是总酶浓度。

哺乳动物细胞培养和T.cruzi公司维修

牛胚胎骨骼肌细胞[28]或交叉验证试验中使用的小鼠C2C12成肌细胞（ATCC#CRL-1772）分别在添加5%马血清的RPMI 1640培养基和添加4.5 g/l葡萄糖的Dulbecco改良Eagle's培养基H-21（DMEM H-21）（细胞培养设施，UCSF）中培养，并添加5%胎牛血清（FBS）（Sigma Chemical Co.，St。路易斯，密苏里州，美国），25 mM HEPES，2 mM L-谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100µg/ml链霉素。克氏锥虫CAI-72类胰单胞菌[28]从感染后4～7天的感染培养上清液中获得。培养物保持在37°C、5%CO的气氛中2为了采集寄生虫，收集含有释放的锥虫的感染培养物上清液，并以600 rpm离心5分钟，以清除细胞碎片；然后丢弃小球，并通过以3300 rpm的转速旋转培养管15分钟来浓缩培养基中残留的胰头线虫。将寄生虫颗粒重新悬浮在2-5 ml新鲜培养基中。使用Neubauer血细胞仪测定胰蛋白酶抑制剂浓度。

在中点击交叉验证T.cruzi公司-受感染的哺乳动物细胞

复合交叉验证T.cruzi公司感染的骨骼肌成肌细胞（牛胚胎骨骼肌或C2C12谱系）是根据恩格尔和合著者的研究方案进行的[29]在使用前立即稀释储存在DMSO中的10 mM化合物。二甲基亚砜的最终浓度从未超过0.4%，这对寄生虫和哺乳动物细胞都是无毒的。为了准备测试板，在75–150 cm的培养基中培养骨骼肌成肌细胞三烧瓶用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤一次，然后与0.25%胰蛋白酶在PBS中孵育1-3分钟以分离。去除胰蛋白酶溶液，并从烧瓶底部释放成肌细胞。添加新鲜培养基，并使用Neubauer血细胞仪测定细胞浓度。将50µl培养基中的成肌细胞以1500个细胞/孔的密度转移到黑色96-well板（Greiner Bio-One，#655090）的清底孔中，并以7500个寄生虫/孔（1∶5比例）的50µl色氨酸菌培养物感染。在移除培养基之前，让细胞粘附并在培养箱中铺展24小时，并向每个孔中添加100µl含有0、0.04、0.12、0.37、1.10、3.30或10µM受试化合物的新鲜培养基，然后在37°C的5%CO气氛中培养72小时2使用与试验化合物浓度相同的泊沙康唑作为阳性对照。然后通过在PBS中添加100µl/孔的8%甲醛来固定细胞，使甲醛的工作浓度达到4%。为了染色寄主细胞的细胞核以及寄生虫的细胞核和动粒体，首先用100µl的0.1%Triton X-100在PBS中清洗一次，使细胞膜渗透，然后用0.2µg/ml的荧光DNA染料4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）处理1 h，然后用PBS清洗一次。将固定板保持在4°C，并在获取图像之前进行避光保护。

图像采集和数据分析

允许平板在室温下平衡，图像由IN Cell Analyzer 2000（GE Healthcare）采集，20倍物镜，每孔5个场，350/50 nm和460/40 nm荧光激发和发射过滤器。在没有药物细胞毒性的情况下，每个孔至少有800个细胞被成像和计数。图像通过IN Cell Analyzer Developer 1.6软件进行处理和分析。用于分割宿主和寄生虫细胞器的尺寸参数为125µm2对于宿主核，以及1–2µm2用于寄生细胞核/动粒体。由于DAPI也能强烈染色宿主异染色质区域，这些区域呈现出类似寄生虫的形状( 图3 )共定位于寄主细胞核的颗粒被排除在定量之外，而寄主细胞核附近的寄生虫聚集物被视为感染细胞。根据宿主细胞、寄生虫细胞核和寄生虫动粒定量测定宿主细胞和细胞内无鞭毛体的数量，提供感染后治疗前72小时内与未治疗对照组相比的生长抑制措施。

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细胞内hit化合物的交叉验证克氏锥虫无鞭毛虫。

基于DAPI的分割图像T.cruzi公司-图像处理软件处理的受感染成肌细胞显示了用化合物处理72小时后培养的细胞1(C类,E类,G公司)或13(天,F类,H（H）)在指定浓度下。寄主细胞的细胞核以蓝色突出显示，寄生虫的细胞核和动粒体以红色突出显示。插入物以蓝色显示原始DAPI染色。注意在0.123µM和10µM化合物中消除细胞内无鞭毛体1(E类,G公司)和10µM化合物13(H（H）). 在阴性对照组中，DMSO处理的成肌细胞显示大量寄生虫血症(A类). Posaconazole被用作阳性对照(B类). 棒材=20µM。

杀锥虫试验

低EC交叉验证化合物50反对T.cruzi公司根据Engel等人1998年制定的方案，进一步评估受感染细胞，以确定宿主细胞有效治愈的“致死”浓度[30]为了允许长期治疗并避免培养过度生长，将C2C12成肌细胞以低密度播种在96孔板（10三细胞/孔），并用补充有低FBS浓度（1%）、25mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100µg/ml链霉素的DMEM H-21培养基培养。这些细胞被感染了T.cruzi公司锥虫菌种CAI/72（5个寄生虫/细胞）24小时，并在100µl培养基中用0、0.04、0.12、0.37、1.10、3.30或10µM测试化合物处理14天。在治疗过程中，每隔72小时更换一次补充有试验化合物的培养基。14天后，撤回药物压力，在无化合物培养基中继续培养一周，在此期间，监测培养物的重现性克氏锥虫上清液中的锥虫。

脂肪分析T.cruzi公司无鞭毛体

为了生长用于脂质分析的细胞内无鞭毛虫，C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞（4×106细胞）培养于150 cm2上述烧瓶感染了80×106感染后72小时，用试验化合物处理培养物，浓度为5×致死浓度以下，以避免完全杀死寄生虫。以100 nM的泊沙康唑作为阳性对照。半胱氨酸蛋白酶cruzain抑制剂K777[31]以1.6µM作为阴性对照，以确保T.cruzi公司通过其他途径的抑制并不影响膜甾醇的组成。在感染后96小时和药物治疗24小时后采集细胞。用10 ml 0.25%胰蛋白酶在PBS中短暂处理，然后立即用10 ml含有FBS的新鲜培养基替换，从而开始细胞分离。用25 ml PBS清洗收集的细胞3×3，以去除FBS并释放胰蛋白酶。然后将感染细胞的悬浮液转移到玻璃管中，并以2000rpm离心5分钟。用PBS洗涤后，加入2ml氯仿-甲醇溶液（2∶1的比例）以重新悬浮细胞沉淀。然后在N下蒸发有机溶剂2流动，使颗粒干燥。

对于总脂提取，用2 ml氯仿处理干细胞颗粒24 h。通过用3 ml水洗涤3×有机相去除极性分子。含有甾醇的有机相随后在蒸发器上在N下干燥2流量。将脂质重新悬浮在2 ml氯仿-甲醇（9∶1比例）中，用3 ml水再次洗涤3×，在N2流动并在乙腈中重新悬浮。在用3 ml水额外冲洗3倍后，在N下干燥乙腈2流。提取的干甾醇在己烷中重新溶解并衍生N个,N个-双（三甲基硅基）-2,2,2-三氟乙酰胺（BSTFA）（Pierce）在37°C下培养至少2小时。采用气相色谱-质谱（GC-MS）分析甾醇及其三甲基硅基衍生物。如前所述进行GC-MS分析和脂质鉴定[14].

结果

双波长模式下的初级屏蔽

鉴于文库的规模较大，我们推断使用双波长检测模式将使分析的吞吐量潜力高于前面描述的多波长（光谱）模式[21],[22]因此，在主屏幕中，在425 nm和390 nm处进行检测，对应于II型差异结合光谱的最大值和最小值，吸光度差异ΔA=A425−A390作为判别标准( 图1 ). DMSO对照品的ΔA平均值为0.000±0.003（平均值±标准偏差），而对照品的△A为0.043±0.004，导致分析Z′因子值为0.58±0.04。计算了528次测量的标准偏差。吸光度差的幅度与结合到化合物的CYP51靶的分数成正比，最大值为～0.04，对应于活性位点饱和导致的铁轴向水配体的完全位移。374个化合物（占整个文库的0.35%）为异常值，ΔA>0.04。我们推测，这些化合物由于光谱或溶解度特征而属于异常类别。其中20个离群值被选择用于光谱模式下的重新评估，并被证实缺乏特征吸光度特征。

光谱屏蔽模式下双波长点击的重新评估

我们通过在光谱模式下重新评估选定的化合物来识别双波长池中的假阳性点击。首次使用Accelrys软件（加利福尼亚州圣地亚哥AccelrysInc.）分析了0.016<ΔA<0.04的2718个化合物的结构差异和相似性。简单地说，每种化合物的指纹都是使用专有的扩展连接性算法EFCP_6确定的，并折叠到256位以提高比较效率[32],[33].最大差异[34]分区算法[35]利用这些指纹之间的Tanimoto距离将化合物分为30组。同样，将ΔA>0.04的374个异常值分为10组。从每组中选择两个代表性化合物（一个具有最大ΔA，另一个具有中间ΔA），从而使80种化合物在全光谱模式下进行评估。对从2µM到12µM的四种系列稀释液进行评估，然后使用0-5评分系统对点击数进行排名( 图2 ). 从异常值池中选择的所有20种化合物都属于假阳性类别（得分为0）。在剩下的60种化合物中，有22种（36%）被确认为阳性点击，包括7种得分为4或5的化合物，只有一种四种光谱重叠（得分5）(表S2).

光谱模式下475个额外双波长点击的选择和重新评估

对前22个在双波长和光谱模式下均为阳性的点击进行目视检查，证实17个含有含氮芳香杂环，能够与CYP51活性位点中的血红素铁配位(表S2). 其余五个含有脂族胺基团。对整个104000个化合物库进行信息学分析，确定6643个化合物具有杂环药效团，其结构中含有可接近的氮原子；其中1274个在双波长主屏幕上被确定为显示阳性点击范围内的吸光度差异。严格执行利宾斯基的“五人制”[36]将化合物库缩小到1172种。命中支架由2个以上的环和3个以上的成员组成，通过结构相似性进行聚类，并使用SARvision Plus 3.1（圣地亚哥Altoris）软件组织成层次树。根据这些标准，确定了188个支架组和155个单胎。从支架组中选取320种化合物，并与155个单体化合物结合，得到475种化合物，在光谱模式下进行重新测试，并使用0-5评分系统进行排名，如 图2 在这些化合物中，只有21个化合物（4%）没有表现出II型光谱的特征，而其余454个化合物表现出正点击的光谱特征，包括134次得分为4的点击，以及44次得分为5的点击，这两个值都表明，根据方程近似，纳米摩尔结合亲和力较低(1)。结合之前确定的7个点击，它们构成了185个高亲和力点击，列在表S3。分析的敏感性决定了高靶浓度，因此无法通过HTS格式中的亲和力进一步区分阳性点击。

根据假定的血红素铁协调模块的结构，185次点击可分为六个人口分布不均的类别( 图4A ). 每类化合物的数量从1到92不等。这种分布反映了图书馆中每个类别的频率( 图4B )，表明缺乏对该分析评分的铁配位杂环的偏好。6个类别中的每一个都进一步细分为集群，在成员之间具有更广泛的结构相似性(图S1). 一些集群的克鲁兹锥虫-活动点击数（以绿色突出显示图S1)而不是其他人。

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含氮芳香杂环药效团。

185个结合评分为4或5的阳性点击中含氮芳香杂环药效团的分布(A类)在图书馆里回荡他们的频率(B类). R代表不同的化学结构，如表S3.

中点击的交叉验证T.cruzi公司-受感染的哺乳动物细胞

这组475种化合物加上之前在光谱模式下验证的80次点击，在T.cruzi公司-基于图像的介质吞吐量分析法检测受感染的成肌细胞[29]( 图3 ). Posaconazole被用作EC的阳性对照501 nM。欧盟委员会50被确定为对应于50%抑制寄生虫内吞和细胞内生长的化合物浓度，计算基于化合物诱导的抑制T.cruzi公司感染指数（即T.cruzi公司-培养物中的感染细胞乘以每个感染细胞的平均寄生虫数量）。

在497个交叉验证的化合物中，57个表现出抗-T.cruzi公司与EC的活动50低于10µM；该组的CYP51结合命中分数显著增加，分别为4分和5分（57次总命中中的36次）( 表1 ). 其余的点击数（57次总点击数中的21次，包括最高评级的点击数）的绑定分数从1到3不等。57人的完整列表T.cruzi公司-活动点击数如所示表S4。11次亚微米撞击的子集如所示 图5 .中化合物的编号 图5 和表S4是按照他们的降序排列的。185个复合谱池(http://zinc.docking.org/users/lpodust/carts/185CYP51光谱HTShits)和57个化合物T.cruzi公司-活动池(http://zinc.docking.org/users/lpodust/carts/57Tcruziactivehits网址)上传至免费在线资源ZINC并公开(http://zinc.docking.org)[37].

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亚微摩尔克鲁兹锥虫抑制剂。

一欧盟委员会50根据获得的值T.cruzi公司HTS分析中的寄生虫用于对点击进行排序。b条括号中为EC50从两个独立的交叉验证分析中对单个回购点击进行平均。

表1

与EC的57次点击分布50结合得分≤10µM。
查找：符号EC点击次数50≤10µM（总计57）
14
29
三8
421
515

光谱和光谱的对比分析T.cruzi公司-logP和MW分布的活性池显示出两个池之间的良好相关性( 图6 ). 中logP>3的点击数略有增加T.cruzi公司活动池（82.5%T.cruzi公司-活动池与。78.9%的光谱命中率）( 图6A )，分子量在200–400 g/mol范围内分布相当均匀，只有少数点击穿过400 g/mol屏障( 图6B ). 化合物5分子量为225，logP为2.6，是前五名中最小的分子T.cruzi公司-活动点击。

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光谱对比分析（蓝色）vs.T.cruzi-活动（红色）点击。

分配(A类)logP和(B类)分子量（MW）值。

化合物1[6-（2-溴苯氧基）己基]咪唑（MW为323，logP为4.2）以EC排名第一5070 nM，HTS结合分数为2。在低通量测定中经过更严格的验证后，化合物1结果表明，与靶分子的结合亲和力至少较低( 图7 )和EC5017±12 nMT.cruzi公司小鼠成肌细胞培养的无鞭毛虫( 图3 ). 化合物杀锥虫浓度1在三个独立实验中为40 nM，这与泊沙康唑（EC501 nM，0.6 nM时杀锥虫）。

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在结合分析中点击验证。

(A类)击中复合结构。化合物13与咪康唑结构相似。化学计量结合1(B类)和13(C类)通过UV-vis滴定法在0.5µM的浓度下与CYP51结合，表明二次紧密结合方程近似的低纳米摩尔结合亲和力(1).

亚微摩尔重测数据T.cruzi公司击打

使用高评级点击作为分子支架重新计算光谱筛选数据，模拟迷你SAR系列，提供点击的结构-活性关系。例如，化合物1在结构上与唑类抗真菌药物不同，在这些研究中发现大多数阳性结果。另外两种高级化合物，4和11，类似于化合物1( 图5 ). 总的来说，七个结构相关的点击的特征是绑定分数为4或5，两个点击，包括复合1，得分为2分( 图8 ). 此外，两个不属于筛选文库的商业类似物化合物1a个和1亿，进行了测试。化合物1a个溴在溴苯氧环中的位置不同，而1亿根据咪唑环和溴苯氧基环之间烷基连接物的长度，这两个参数似乎对抗-T.cruzi公司活动( 图8 ). 中显示的所有变化 图8 与EC降低有关50，可能是由于与目标的结合亲和力下降（例如化合物1亿或化合物11)，或可能与其他因素有关。因此，溴原子从间位迁移到溴苯氧基环的对位（化合物1a个)导致抗-T.cruzi公司K无可检测变化的活性天然而，0.5µM的酶浓度定义了该方法在K下的灵敏度下限天约5 nM，即目标浓度的百分之一，前提是滴定曲线在化学计量的酶-液比下达到平台( 图7 B、C ). 由于紧密结合配体之间亲和力的差异反映在滴定曲线的清晰度中，K天从拟合中恢复到实验数据的值由方程近似(1)对拐点附近数据点的错误非常敏感。因此，在比较紧密绑定常量时应谨慎。

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最高额定命中复合簇。

一欧盟委员会50根据获得的值T.cruzi公司HTS分析中的寄生虫用于对点击进行排序。b条括号中为EC50从两个独立的交叉验证分析中对单个回购点击进行平均。N/A–不适用；N/D–未确定。

化合物2,6和7在交叉验证中得到高度评价，属于他们自己的分子支架簇，其中包括21次点击(表S5). 在光谱模式（得分4或5）或T.cruzi公司分析总结于( 图9 ). 化合物6，2-氨基-6-[2-（3，4-二甲氧基苯基）乙基]-7-甲基-5-氧代-4-吡啶-3-基-5，6-二氢-4H-吡喃并[3，2-c]吡啶-3-羧酸甲酯，是该簇中唯一一种以低通量格式验证的化合物，包括经处理的无鞭毛体中甾醇组成的GC-MS分析（未显示）。基于此验证，化合物6是一系列单独测试的化合物中的亚军，估计K天76 nM和EC5080 nM。化合物2和该簇的其他代表的进一步验证尚待化合物的商业可用性。

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排名第二的命中复合簇。

一欧盟委员会50根据获得的值T.cruzi公司HTS分析中的寄生虫用于对点击进行排序。b条括号中是EC50在验证分析中获得的单个回购点击数。N/A-不适用；N/D-未确定。

手动验证的点击选择

两个标准–反-克氏锥虫活性和/或高筛选分数-用于选择商用化合物进行更严格的验证，包括对甾醇生物合成的影响T.cruzi公司在小鼠成肌细胞中培养的无鞭毛体。使用在线资源ZINC搜索化合物供应商[37]总共获得了32种命中化合物用于手动低通量测定的验证，其中包括8种T.cruzi公司-活动点击：复合1,三,5,6,9,11,13和15(表S6). 由于在分析条件下化合物沉淀，无法确认两种获得的化合物的结合。其他回购化合物以0.5µM蛋白质浓度的一对一化学计量比结合CYP51( 图7 )，表明从方程式推断出的纳米摩尔结合亲和力至少较低(1).低EC50所有测试值均得到确认T.cruzi公司–活动点击( 图5 ).

膜甾醇的GC-MS分析

通过GC-MS分析，确认所有单独获得的点击都会抑制甾醇生物合成。在未经治疗的无鞭毛虫中观察到的主要甾醇是表雄醇（峰值d日在里面 图10 )其次是大约等量的粪甾醇(e（电子）)和胆固醇-7,24-二烯-3β-醇（峰值一). 这种甾醇成分与我们之前发表的研究一致[14]但与Liendo和合著者不同[5]，其中24-methyl-7-en-cholesta-en-3β-ol（峰值c（c）在里面 图10 )被鉴定为细胞内无鞭毛菌的主要甾醇。对这些差异最直接的解释是本研究中使用的或在其他地方发表的脂质提取方案的差异[38]由于CYP51的抑制，两种14-甲基化前体，羊毛甾醇(（f）)和依布里科尔(小时)控制了最强CYP51抑制剂posaconazole和化合物的GC-MS痕量1、和的含量与低效化合物的14-脱甲基产物相当13( 图10 ). 有趣的是，粪甾醇(e（电子）)被低浓度泊沙康唑和化合物完全抑制1，而内酯(d日)坚持。鉴于T.cruzi公司其他地方报道的甾醇途径[5]在反应链中，粪甾醇先于表雄醇。

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气相色谱-质谱分析T.cruzi公司用CYP51抑制剂处理的脂质提取物。

DMSO和K777作为阴性对照；泊沙康唑作为阳性对照。未感染的宿主细胞面板（顶部）表明，用小写字母标记的色谱峰来自一到我属于T.cruzi公司原点，对应于一-胆甾-7,24-二烯-3β-醇，[M]•+ = m/z 454；b条-胆甾醇-8,24-二烯-3β-醇（发酵甾醇），[M]•+ = m/z 470；c（c）-24-methyl-7-en-cholesta-en-3β-ol，[M]•+ = m/z 472；d日-麦角甾-7,24-二烯-3β-醇（鼻甾醇），[M]•+ = m/z 470；e（电子）-麦角甾醇-8,24-二烯-3β-醇（粪甾醇），[M]•+ = m/z 470；（f）-羊毛甾醇[M]•+ = m/z 498；克-4-甲基内酯[M]•+ = m/z 484；小时-依布里科尔，[M]•+ = m/z 512；我-24-乙基-7,24（24′）-烯-壳聚糖-二烯-3β-醇，[M]•+ = m/z 484。胆固醇是唯一来源于宿主细胞的峰值。CYP51底物羊毛甾醇增加(（f）)和依布里科尔(小时)是由于抑制T.cruzi公司CYP51，以及下游主要产品episterol的下降(d日)，粪甾醇(e（电子）)，胆固醇-7,24-二烯-3β-醇(一)和次要产品4-甲基雌二醇(克)和24-乙基-7,24（24′）烯-胆固醇-3β-醇(我).

点击的化学信息分析

我们使用在线化学信息研究工具SEA（相似集合方法）中实现的算法，给出了出乎意料的大量结构不同的点击(http://sea.bkslab.org/)[39]通过配体拓扑将CYP51与其他药理靶点联系起来。在SEA中，蛋白质靶标的相似性是基于其配体的相似性来建立和评分的，使用随机匹配的概率或期望E值作为评分函数，将较低的E值与更具统计学意义的配体相似性联系起来。SEA中实施的分子数据库探测结果[39]使用57T.cruzi公司-无论是单独还是作为一个池，活性点击都表明CYP51与其他P450药物靶点相似，包括血栓素合成酶（CYP5）、脂肪酸ω-羟化酶（CYP4）、17α-羟基化酶/17,20-裂解酶（CYP17）和芳香化酶（PYP19）。这些酶已被制药业用于治疗心血管疾病[40]、脂代谢代谢紊乱和炎症[41]，前列腺癌[42]雌激素受体阳性乳腺癌[43]分别是。出乎意料的是，这些药理靶点的得分远远高于甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）本身，这就证明了这样一种观点，即针对这些靶点的分子，包括已经进入临床的药物，可以对其进行效力检测，以对抗T.cruzi公司CYP51（日历年51）。

SEA数据库中的化学信息学搜索揭示的另一个惊喜是，最高评级的命中与谷氨酰胺肽环转移酶抑制剂惊人相似，谷氨酰胺肽循环转移酶是一种在序列或结构上与CYP家族无关的酶。这种酶催化N-末端焦谷氨酸的形成，其生物功能要么是介导肽类激素与受体的相互作用，要么是稳定蛋白质和肽以抵抗N-末端降解[44]人谷氨酰胺酰环化酶催化淀粉样肽N末端的焦谷氨酸形成，可能参与神经退行性疾病的发展和进展[44].

讨论

我们设计了一种HTS分析，以鉴定能够与CYP51的血红素铁配合的化合物。以下是基于目标的筛选和进一步的验证步骤，总结于 图11 ，我们确定了185个高亲和力命中和57个部分重叠的命中-T.cruzi公司活性，包括十几种亚微摩尔抑制剂T.cruzi公司哺乳动物细胞感染。通过化学信息分析、光谱筛选和交叉验证对初级双波长筛选中确定的命中进行评估T.cruzi公司无鞭毛虫。信息学反馈有助于最大化支架多样性，并减少在更费力的光谱模式下需要重新评估的化合物数量。因此，这两个共185次点击和57次点击的组合，在环的数量、大小和排列方面，以及构成复合框架的链接器和替代组的性质方面，在结构上是不同的(表S3和S4系列). 总之，尽管双波长模式在吞吐量方面效率更高，但它产生的误报率大于60%。尽管阅读、分析和制表更加耗时，但光谱模式在有效过滤和排名真实正面点击方面比双波长模式更全面。总的来说，根据对代表性化合物的验证测试，我们预计本研究中确定的一组命中率将包含较高比例的真阳性命中率，并将成为进一步开发恰加斯病应用程序的宝贵资源。

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筛选和验证步骤的流程图。

在我们观察到的高命中率下，我们不太可能错过重要的化学类型，因为我们将102种违反Lipinski五法则的化合物排除在全光谱模式验证和T.cruzi公司化验。优化过程通常会产生更大、更疏水的化合物，因此行业惯例是将重点放在较小的“类铅”化合物上，以便在铅开发过程中增加MW和logP[45]另一方面，CYP51抑制剂伊曲康唑和泊沙康唑不符合这一规则，这一事实证明了更详细地研究疏水点击的理由。泊沙康唑治疗侵袭性真菌感染的疗效归因于药物在体内实体器官组织中的蓄积，而不是血浆中药物的游离水平[46],[47]在分离的细胞和实体组织中，泊沙康唑和伊曲康唑大多集中在细胞膜中，细胞膜也是其分子靶标CYP51的位点[48]鉴于此体内泊沙康唑和其他新型CYP51抑制剂的活性归因于其特殊的药代动力学特性，如分布量大和末端半衰期长[49],[50]，也许值得重温一下最初被利宾斯基标准排除在外的102首歌曲。

这个T.cruzi公司–活动池包含高亲和力点击（得分4或5）和低绑定得分( 表1 )这表明低得分化合物可能通过替代机制发挥作用。为了测试这种可能性，最高评级的命中组合的绑定和活动1，在手动分析中得到确认。化合物1，其活动程度高于这些研究中确定的任何其他打击( 图5 ). 在100 nM浓度下，化合物1抑制甾醇生物合成T.cruzi公司无鞭毛菌比泊沙康唑更有效( 图10 )从而成为进一步评估感染动物模型的候选对象。SEA数据库中的化学信息检索[39]揭示了与二十烷酸合成和脂肪酸代谢相关的P450药物靶点抑制剂的最受欢迎的相似性。例如，血栓素-A合酶在最高命中率和结构相关的亚微摩尔命中率方面排名很高4和11以及CYP4家族的脂肪酸ω-羟化酶。令人惊讶的是，谷氨酰胺肽环转移酶的E值最低，这与CYP家族的序列或结构无关。虽然药物与人类宿主中的非预期靶点结合的能力可能导致不良副作用，但与感染人类的病原体中的靶点结合同样可以治愈感染。在缺乏治疗被忽视疾病的药物的情况下，本研究中遇到的CYP51的意外混杂可用于“背负”策略[51],[52]用于确定抗寄生虫疗法开发的化学起点，而从寄生虫分析中得出的结构-活性关系可能导致疾病特异性临床候选[53]–[56].

抗真菌唑类药物队列中的结构基序在这两个库中都很明显。例如，点击1,2-（4-氯苯氧基）-1-（4-氯苯基）-2-（1H-1,2,4-三唑-1-基）乙酮（结合分数5）（化合物13)，在反-T.cruzi公司活性测定，类似咪康唑( 图7A )是首批广谱抗真菌药物之一，是酮康唑、伊曲康唑、波沙康唑、氟康唑和伏立康唑等口服活性抗真菌药物的康唑祖细胞[15].手动UV-vis滴定确认化合物13在等摩尔0.5µM浓度下结合CYP51并使其饱和，这表明至少具有较低的纳米摩尔结合亲和力( 图7C ). 根据SciFinder在线资源，与化合物结构相似的化合物13作为高效杀菌剂在20世纪70年代获得专利。为了确认这种结构基序与生物活性之间的关系，我们从T.cruzi公司从经复方治疗的感染小鼠成肌细胞中分离出无鞭毛体13与CYP51的抑制作用一致，GC-MS分析显示羊毛甾醇和依布里科尔前体增加，同时皮脂甾醇、粪甾醇和其他14-脱甲基中间体下降( 图10 ). 化合物13有效对抗克氏锥虫带有EC的无鞭毛菌501.3µM，2.5µM时可杀锥虫。

泊沙康唑分子的形状决定了其与CYP51的结合方式。它的长“尾巴”群延伸至底层绑定隧道[24],[57]在隧道口，泊沙康唑采用交替构象，与蛋白质表面的氨基酸残基进行多点接触[24]泊沙康唑与CYP51中催化非必需残基的广泛相互作用与真菌的耐药性模式显著一致。泊沙康唑接触点是病原真菌耐唑菌株的突变热点烟曲霉和白色念珠菌 [24]其中一些突变对所有唑类药物产生交叉耐药性[58]–[61]。治疗反应中靶点突变导致的耐药性传播可以避免T.cruzi公司如果以靶结构为指导，新抑制剂的结合性能得到改善。这一概念已成功用于一组9种FDA批准的HIV蛋白酶抑制剂，这些抑制剂是通过广泛使用基于结构的药物设计开发的[62]为了保持在衬底包络内，并将重点放在主链相互作用的直接优化化学上，我们正在寻求与CYP51共结晶的低分子量命中，以进行x射线结构分析。与较大的泊沙康唑（分子量700 g/mol）相比，抗击T.cruzi公司范围从215到480，大多数（57个中的39个）低于360；化合物1和13分别为323g/mol和348g/mol。此外，由于其“碎片状”特征[63]亚微摩尔中最低分子量和logPT.cruzi公司命中，复合5与最小的高亲和力光谱点击之一5,8-二溴异喹啉（化合物45在里面表S3; 分子量287 g/mol），仅由铁配位杂环模块组成。

总之CYP51抑制剂引线的多样化应为药物化学家在化学可及性和引线优化前景方面提供新的选择。在ADMET特性不良的情况下，多导程可降低药物磨损的风险，并覆盖无专利空间，这是未来成功抗Chagasic治疗的关键之一。在这项工作的过程中，我们(我)进一步开发了基于UV的P450酶高通量筛选方法；(ii（ii）)丰富CYP51抑制剂的化学支架空间；(三)确定了一个有效的T.cruzi公司抑制剂和一系列与CYP51高度亲和的低分子量点击，用于点击-引导优化；(四)通过计算配体化学将CYP51与其他药理靶点联系起来。这一努力使我们能够识别制药公司已经生产的分子，以便将来对其进行实验测试T.cruzi公司.

支持信息

图S1

185次点击的聚类以绑定分数4或5进行验证。

（PDF格式）

表S1

钢板读数分析。

（DOCX）

表S2

在双波长和光谱屏蔽模式下，前22次点击均为阳性。

（DOCX）

表S3

185次命中，绑定分数为4或5。

（DOCX）

表S4

57 T.cruzi公司 -按降序排列的活动命中数。

（DOCX）

表S5

排名第二的命中复合簇。

（DOCX）

表S6

32次单独验证的点击。

（DOCX）

替代语言摘要S1

葡萄牙语手稿摘要。

（文件）

鸣谢

我们感谢John Irwin的宝贵讨论和Potter Wickware对手稿的批判性阅读。

资金筹措表

这项工作得到了美国国立卫生研究院RO1拨款AI095437（给L.M.P.）和桑德勒基金会的支持。筛查得到了加州大学伯克利分校新兴和被忽视疾病中心（CEND）颁发的奖项的支持。C.M.C.得到了Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico（CNPq）和FIOCRUZ的支持；K.K.H.A.得到QB3-马来西亚项目的支持；J.B.J.得到NIH R01 Grant AI74824（加利福尼亚大学旧金山分校Ortiz de Montellano教授）的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

工具书类

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文章来自PLOS被忽视的热带疾病由以下人员提供普洛斯