肝病学。作者手稿；PMC 2013年11月1日提供。
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PMCID公司：项目经理3407311
美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院368649
斑马鱼bHLH转录因子Hand2标记肝星状细胞：星状细胞进入发育中肝脏的分析
,1,4 ,1,2,4 ,三和1
尹春月
1美国加州大学旧金山分校再生医学研究所肝脏中心和糖尿病中心，生物化学和生物物理系，发育和干细胞生物学、遗传学和人类遗传学项目。
金伯利·埃瓦森
1美国加州大学旧金山分校再生医学研究所肝脏中心和糖尿病中心，生物化学和生物物理系，发育和干细胞生物学、遗传学和人类遗传学项目。
2美国加州大学旧金山分校病理学系，邮编：94143。
杰奎琳·马赫
三美国加州大学旧金山分校医学系和肝脏中心，邮编：94110。
Didier Y.R.Stainier先生
1美国加州大学旧金山分校再生医学研究所肝脏中心和糖尿病中心，生物化学和生物物理系，发育和干细胞生物学、遗传学和人类遗传学项目。
1美国加州大学旧金山分校再生医学研究所肝脏中心和糖尿病中心，生物化学和生物物理系，发育和干细胞生物学、遗传学和人类遗传学项目。
2美国加州大学旧金山分校病理学系，邮编：94143。
三美国加州大学旧金山分校医学系和肝脏中心，邮编：94110。
4这些作者对这项工作贡献均等。
- 补充资料
补充图S1-S2。
GUID:2525C607-5AEF-4A09-9021-878D0A3C1C61
补充材料。
制导：67D5B548-4AC7-4E3F-8495-1635B7D5B7DD
补充表S1-S2。
GUID:CB71EA96-4B48-4E03-BFCC-F91AAA4F4CC4
摘要
肝星状细胞（HSC）是肝脏特异性间充质细胞，在肝脏发育和损伤中起着重要作用。我们对HSC生物学的了解因缺乏体内数据。HSC和窦状内皮细胞（SEC）非常接近，这两种细胞类型之间的相互作用对其发育和功能至关重要。这里我们介绍一种转基因斑马鱼系，Tg（手2:EGFP）标记HSC。我们发现斑马鱼HSC与哺乳动物HSC有许多相似之处，包括形态、位置、脂质储存、基因表达谱，以及急性肝损伤后增殖和基质生成增加。使用Tg（手柄2:EGFP）我们在发育过程中进行了时间进程分析，以揭示HSC在SECs之后侵入肝脏。然而，HSC仍以缺乏大多数内皮细胞（包括SECs）的突变形式进入肝脏，这表明HSC分化或进入肝脏并不需要SECs。在缺乏SEC的情况下，HSC与肝胆管细胞异常相关，这表明SEC影响肝发育过程中HSC的定位。我们分析了调节HSC发育的因素，并表明抑制血管内皮生长因子信号传导可显著减少进入肝脏的HSC数量。我们还进行了初步的化学筛选，并确定了两种在开发过程中影响HSC数的化合物。
结论
我们的工作首次全面描述了斑马鱼HSC的发展，并揭示了SEC在HSC本地化方面的要求。这个Tg（手柄2:EGFP）线条代表一种独特的工具体内HSC行为的分析和分子解剖。
关键词：窦内皮细胞、肝脏发育、，钟表、VEGF、胆道细胞、急性酒精暴露
肝星状细胞（HSC）是一种多功能间充质细胞类型，在肝功能和损伤反应中发挥着重要作用。在健康肝脏中，HSC是主要的维生素A储存细胞。肝损伤后，这些静止的细胞转化为活化的、增殖的肌纤维母细胞样细胞，生成瘢痕组织（由1). HSC持续激活是肝纤维化的中心事件，与肝炎和脂肪性肝炎的进展有关（由2).
尽管HSC在肝脏生理学和疾病中具有重要意义，但我们对HSC生物学的认识还远远不够完整。HSC发育的特征可以为了解肝损伤过程中HSC的激活提供线索。然而，在发育过程中追踪HSC在哺乳动物模型中尚不可行。HSC的胚胎起源尚不明确，因为它们表达所有三个胚层的标记基因(三,4). 使用CreERT2公司转基因进入Wilms肿瘤抑制因子（Wt1）该位点表明HSC来源于横隔衍生的间皮(5). 有趣的是，鸡的间皮不仅对HSC有贡献，而且对窦状内皮细胞（SEC）也有贡献(6). HSC和SEC表现出密切的物理联系和血管生成因子的共同表达(7). 这些观察结果导致了HSC和SECs起源于一种常见的胚胎前体的假设。然而，没有任何研究专门讨论过这个问题。
在HSC中找到选择性驱动转基因表达的启动子可以促进体内观察和基因操作。先前的研究使用中胚层相关α的启动子-平滑肌肌动蛋白基因与神经嵴相关胶质纤维酸性蛋白/GFAP转基因小鼠HSC中的基因直接表达(8-10). 然而，鉴定HSC特异性启动子仍然具有挑战性。bHLH转录因子基因心脏和神经嵴衍生物表达转录物2/手动2在侧板中胚层和神经嵴中表达(11)，可能引起HSC的组织。我们之前报告了Tg（手柄2:EGFP）在控制下表达EGFP的斑马鱼系手动2调控序列(12). 在肝脏发育过程中，Tg（手柄2：EGFP）表达于肝原基周围的侧板中胚层。然而，Tg（手柄2：EGFP）在肝脏发育后期的表达没有特征。
硬骨斑马鱼(达尼奥雷里奥)已成为研究肝脏发育和疾病的有价值的脊椎动物模型系统。斑马鱼肝脏包含与哺乳动物肝脏相同的主要细胞类型，包括肝细胞、胆道细胞和内皮细胞(13). 虽然鱼类肝脏的基本结构不同于哺乳动物肝脏，但肝脏发育和疾病的机制是保守的（由14). 此外，斑马鱼模型具有补充其他动物模型的重要优势。胚胎和幼虫的快速外部发育和半透明性使它们非常适合体内成像分析。通过转基因方法，研究人员培育出了在不同肝细胞类型中表达荧光蛋白的斑马鱼，使动物肝细胞行为易于可视化，并大大促进了基因和化学筛选，以确定肝脏发育和疾病发病机制的调节器（由14). 尽管已经对斑马鱼肝脏的实质细胞进行了深入的研究，但还没有关于HSC的报告。
在这项研究中，我们报告说Tg（手柄2:EGFP）线标记胚胎和成年阶段的HSC。斑马鱼HSC与哺乳动物HSC在形态、定位、脂质储存和基因表达方面有着显著的相似性。它们通过改变形态、上调细胞外基质蛋白的生成和增加增殖来应对急性酒精暴露。通过跟踪HSC在整个发育过程中的变化，我们发现斑马鱼HSC在SECs进入肝脏后进入肝脏木屐缺乏SEC的突变体表明，尽管HSC分化或进入肝脏并不需要SEC，但它们影响HSC在肝脏内的定位。我们还发现，抑制血管内皮生长因子（VEGF）信号传导会损害HSC进入发育中的肝脏。总之，我们的工作呈现出一种新的体内该模型用于研究HSC生物学，并为HSC发展的分子和细胞机制提供了新的见解。
材料和方法
斑马鱼菌株
野生型，clo第5节+/-，Tg（手2:EGFP）第24页，Tg（kdrl:ras-mCherry）第896页，Tg（fabp10a:dsRed）gz15（gz15）菌株按规定保存(15). 基因型clo（克隆）第5节-/-胚胎是由血细胞缺乏和严重水肿决定的(16). 加州大学旧金山动物保护和使用机构委员会批准了所有方案。
免疫组织化学、原位杂交和氯化金染色
这些实验的方法在支持信息.
急性乙醇处理和EdU细胞周期分析
按照说明进行急性乙醇治疗(17). 为了监测HSC在乙醇处理后的行为，在处理后立即将幼虫转移回胚胎培养基，并进行常规的孵化仔鱼饲料喂养。
为了评估乙醇治疗期间HSC的增殖，Tg（手柄2:EGFP）幼虫在含有或不含2%乙醇的胚胎培养基中溶解的7μM 5-乙炔基-2'脱氧尿苷（EdU）中孵育24小时。为了评估处理后HSC的增殖情况，将对照组和乙醇处理过的幼虫从乙醇中取出，并在EdU溶液中孵育24小时。使用Click iT EdU成像试剂盒（Invitrogen）对动物进行处理。
SU5416治疗和微量注射反义吗啉寡核苷酸
Tg（hand2:EGFP；kdrl:ras-mCherry）在所示阶段，在胚胎培养基中用1或2μM SU5416（Sigma）处理动物。来自同一批次的对照动物被等量的二甲基亚砜处理。微量注射kdrl（kdrl）吗啉按说明进行(18). 为了量化肝内血管分支的数量，通过共焦叠加扫描获得整个肝脏的三维投影。使用ImageJ中的Paintbrush工具绘制每个血管分支的轮廓，并计算分支的数量。对于HSCTg（手柄2：对位于肝脏内的EGFP）表达细胞进行计数。排除那些仍与肝外周密切相关的细胞。使用学生的双尾模型进行统计分析t吨测试。
基因保护分析、定量实时PCR和化学筛选
这些实验的材料和方法在支持信息.
结果
斑马鱼中Tg（hand2:EGFP）表达标记HSC
与内源性手动2信使核糖核酸() (11),Tg（手柄2：EGFP）在发育过程中表达于神经嵴和侧板中胚层及其衍生物(). 有趣的是，我们检测到Tg（手柄2：EGFP）。确定这些人的身份Tg（手柄2：表达EGFP）的细胞，我们用共焦显微镜检查了它们的形态和分布。受精后4天（dpf），Tg（手柄2：EGFP）在与肝脏相关的两种不同细胞群中表达()：一个群体在肝脏表面形成一个单层细胞层（箭头），而另一个群体位于肝脏内（星号）。肝内细胞不表达肝细胞的分子标记(Tg（制造10a：dsRed））(19) ()、胆道细胞（Alcam）(13) ()或内皮细胞(Tg（kdrl:ras）-m樱桃）(20) (). 它们呈星形结构，形成复杂的细胞过程，似乎包裹着内皮细胞(，箭头），HSC的特征(1). 我们还检测到Tg（手柄2：成人肝脏中EGFP）表达细胞的形态相似，与SECs密切相关().
Tg（手柄2：EGFP）在斑马鱼肝脏内的新细胞群中表达。（A） 整体安装就地杂交显示内源性表达手动2受精后4天野生型幼虫。手动2表达于咽弓（Ph）、鳍芽（fin）、肝脏（Li）和肠周围的间质（Int）。（A'）Tg（手2：EGFP）表达类似于手动2.（B）4 dpf时，Tg（手柄2：EGFP）表达于肝脏内壁的单细胞层（箭头）以及肝脏内的星形细胞（星号）。（C-E）表达Tg（手柄2：EGFP）与肝细胞标记物的表达不重叠Tg（制造10a：dsRed）（C）、胆道细胞标记物Alcam（D）或内皮细胞标记物Tg（kdrl：ras-mCherry）（E）。尤其是，Tg（手柄2：表达EGFP的细胞似乎包裹在内皮细胞周围（E，箭头）。（F）Tg（手柄2：EGFP）在成年斑马鱼肝脏振动切片中的表达。与在幼虫肝脏中观察到的情况类似，Tg（手柄2：成人肝脏中EGFP）表达细胞与内皮细胞非常接近。（A，A'）整个斑马鱼幼体，背部视图，顶部前方。（B-F）斑马鱼肝脏的共焦单平面图像。（B-E）背视图，位于顶部前方。A、 前部；P、 后部；五十、 左；R、 对。比例尺：（A，A'）100μm；（B-F）20μm。
要确定Tg（手柄2：表达EGFP的细胞确实是HSC，我们用识别HSC标记物GFAP的抗体对动物进行染色(三) ()和结蛋白(4) (). 在受精后128小时（hpf），我们检测到平均55Tg（手柄2：肝脏中EGFP）表达细胞（分析了8个胚胎）。90%的细胞被结蛋白抗体标记，84%的细胞被GFAP抗体标记。因此Tg（手柄2：EGFP）的表达在很大程度上与HSC标记重叠。在哺乳动物中，HSC是体内主要的维生素A储存细胞。我们进行了氯化金染色，以标记维甲酸(21)发现成年斑马鱼的肝脏储存维生素A滴(). 我们还检测到Tg（手柄2：油红O染色法检测EGFP）表达细胞(22) (，星号）。这些数据强烈表明Tg（手柄2：EGFP）表达标记斑马鱼HSC。
Tg（手柄2：EGFP）的表达标志着斑马鱼肝脏中的HSC。（A-B）Tg（手柄2：EGFP）在肝脏中的表达。（A’-B’）与（A-B）视图相同，但显示GFAP和结蛋白的免疫染色。Tg（手柄2：EGFP）的表达在这个阶段与GFAP和结蛋白抗体标记有很大重叠（箭头）。（C） 成年斑马鱼肝脏的振动切片显示，氯化金染色显示存在维生素A。（D）Tg（手2：表达EGFP的细胞在成人肝脏的振动切片上沉积油红O染色所示的脂滴。（A-B，A'-B'，D）斑马鱼肝脏的共焦单平面图像。（A-B，A'-B'）背视图，位于顶部前方。比例尺，20μm。
我们隔离了Tg（手柄2：EGFP）-通过荧光激活细胞分选（FACS）从成年斑马鱼肝脏中表达细胞，并进行基因保护分析，以检测HSC中高表达水平的转录物，但在其他肝细胞中的基线表达水平(支撑图S1A). 在差异表达最为显著的转录物中，我们确定了之前与哺乳动物HSC生物学有关的基因(表S1;支撑图S1B-C). 因此，斑马鱼HSC表现出与哺乳动物HSC相似的基因表达谱。
斑马鱼HSC对急性酒精暴露表现出强大的细胞反应
为了确定斑马鱼和哺乳动物HSC之间的功能相关性，我们评估了斑马鱼细胞对肝脏损伤的反应。我们选择乙醇作为刺激物，因为酒精性肝病是HSC活化和肝纤维化的重要原因(23)因为斑马鱼是研究酒精对肝脏影响的极好模型(17). 我们暴露了Tg（手柄2:EGFP）幼虫在96-120hpf的范围内使用2%乙醇，并监测HSC在处理期间和处理后的行为。所有动物都能在急性乙醇暴露中存活下来，但表现出身体异常和不稳定的游泳行为（检查了来自六个离合器的300只幼虫）。60%的治疗动物出现脂肪变性，与之前的报告一致(17). 我们检测了未经处理的对照组和乙醇处理的肝脏中基质蛋白的沉积。而对照肝脏中几乎检测不到层粘连蛋白()，在乙醇处理的肝脏中其沉积显著升高()表明急性乙醇暴露刺激斑马鱼HSC的基质沉积。与层粘连蛋白类似，IV型胶原也在乙醇处理的肝脏中过度沉积（数据未显示）。此外，经乙醇处理后，HSC的形态发生了改变：它们失去了复杂的细胞质突起，细胞体变得更加细长().
急性乙醇处理导致细胞外基质蛋白沉积增加和HSC数量增加。（A，B）未经处理的对照组（A）和用2%乙醇处理的幼虫（96至120 hpf）HSC的共焦单平面图像（B）。治疗后立即收集动物并进行检查。（A'，B'）与（A，B）的视图相同，但显示层粘连蛋白沉积。乙醇处理动物中的HSC上调了层粘连蛋白的生成，并表现出形态变化。对来自六个离合器的30只对照动物和30只经乙醇处理的动物进行了检查，所有动物的层粘连蛋白沉积均增加。（C，D）共聚焦投影显示未经治疗的对照组和经乙醇处理的幼虫在治疗后三天（dpt）出现HSC。乙醇处理的幼虫中的HSC数量较多，细胞体更长，细胞质过程较不复杂。（E） 治疗后（0 dpt）以及治疗后1、2和3天，对照组和乙醇处理组动物的HSC数量（平均值±SEM）。在每个时间点，检查来自两个离合器的10个对照和10个乙醇处理的幼虫。对照组和治疗组动物在第1天、第2天和第3天的HSC细胞数差异具有统计学意义（p<0.05）。（F） 乙醇处理期间或处理后一天纳入EdU的HSC百分比（平均值±SEM）。在这两个时间点，对10只对照和10只经乙醇处理的幼虫进行了检查。星号表示统计显著性：*p<0.05。（A-D）背视图，位于顶部前方。比例尺，20μm。
当乙醇处理过的动物被转移回胚胎培养基时，它们的身体表型和异常游泳行为在一天内恢复，70%以上的动物存活至少一周。在乙醇去除后的随访期间，与对照组相比，经乙醇处理的动物HSC数量迅速增加(). 为了确定细胞增殖是否有助于HSC数量的增加，我们检测了这些细胞对增殖标记物EdU的掺入。在未经处理的动物中，20%的HSC显示EdU掺入，并且在乙醇处理期间这一百分比没有变化(). 然而，治疗一天后，乙醇处理的幼虫中约40%的HSC含有EdU，而对照组为28%(). 因此，在急性乙醇治疗后，HSC变得更加增殖，这至少在一定程度上是导致治疗肝脏中HSC细胞数量增加的原因。
综上所述，我们的观察结果表明，斑马鱼HSC在急性酒精暴露后表现出基质蛋白沉积增强、形态改变和增殖增加。他们支持斑马鱼HSC在肝脏损伤期间与哺乳动物HSC功能相似的概念。
斑马鱼HSC的发展
HSC开发的过程尚未完全理解。HSC和SEC之间的密切联系表明，SEC可能在HSC发展中发挥作用。我们进行了时间进程分析，以监测HSC和SECs在开发过程中的相互作用。为了可视化SEC，我们使用Tg（kdrl:ras-mCherry）系，其中VEGF受体基因的启动子kdrl（kdrl）驱动ras-mCherry表达式(20). 我们检测到强大Tg（kdrl：ras-mCherry）在SECs中表达，但在HSC中不表达，使我们能够区分这两种细胞群Tg（hand2:EGFP；kdrl:ras-mCherry）动物。
斑马鱼早期肝脏发育过程中没有SEC，这些SEC在55 hpf之前不会进入肝脏(13). 在62至64 hpf之间，SECs主要位于肝脏的背表面(，箭头），而Tg（手柄2：EGFP）表达细胞局限于肝脏和肠道之间的边界(，星号）。到66 hpf时，SEC开始侵入肝脏(，箭头）(13)，同时Tg（手2：表达EGFP）的细胞留在肝脏外围(，星号）。从68 hpf开始，HSC逐渐扩散到整个肝脏(). HSC和SEC似乎都是随机进入肝脏的。然而，一些SEC侵入肝脏而不伴有HSC(，箭头），所有HSC在进入肝脏后都与SEC保持密切联系(，箭头）。
斑马鱼HSC的发展。（A-F）HSC和SEC的时间进程分析Tg（手2:EGFP；kdrl:ras mCherry）幼虫。在62至76 hpf之间，每隔2小时固定8只幼虫，并对其进行GFP（绿色）和dsRed（红色）染色。（A-B）中的箭头和星号分别表示SEC和HSC的位置。（C-D）中的箭头指向未伴随HSC进入肝脏的SEC。（D）中的箭头指向与SEC相关的进入肝脏的HSC。（A-F）横向振动节的共焦投影，背向顶部。肝内（G-H）HSC增殖率低。五Tg（手2:EGFP）幼虫在65至81 hpf之间每隔2小时固定一次，并染色以标记增殖细胞的磷组蛋白3（蓝色）。100Tg（手柄2：EGFP）表达细胞被发现为磷酸组蛋白3阳性，但其中只有8个位于肝脏内部（G箭头）。剩余的细胞位于肝脏外围（H-J中的箭头所示）。在这些细胞中，39个位于肠道附近（H箭头），25个位于肠道后部（I箭头），11个位于肠道远端（J箭头）。（G-J）顶部前方的肝脏共焦单平面图像。虚线勾勒出肝脏轮廓。比例尺，20μm。D、 背侧；五、 腹部。
在跟踪HSC发展的同时，我们注意到HSC的数量在65至81 hpf之间从5±4增加到33±10（平均±标准偏差）。为了确定HSC的增殖是否导致HSC数量的增加，我们用抗磷组蛋白3抗体进行免疫组化，以标记M期细胞(24) (). 在所有受检动物中，我们检测到100个磷酸组蛋白3和Tg（手柄2：EGFP）肝内双阳性细胞。然而，这些细胞中只有八个位于肝脏内(，箭头），而其余的位于肝脏外围(，箭头）。这些结果表明Tg（手动2：EGFP）表达细胞在进入肝脏之前主要在肝脏外围增殖。
SECs影响HSC在发育中肝脏的定位
为了调查SEC在HSC发展中的作用，我们检查了Tg（手柄2：EGFP）在纯合胚胎中的表达clo（克隆）突变，缺乏大多数造血细胞和内皮细胞(16). 4 dpf时，野生型肝脏形成了一个基本的肝内血管网Tg（kdrl：ras-mCherry）表达()，我们没有检测到任何Tg（kdrl：ras-mCherry）表达clo（克隆）变异肝脏(). 研究表明，斑马鱼的肝芽分化或肝细胞分化不需要内皮细胞(25)，但它们似乎对肝脏的进一步生长至关重要(26). 与这些报告一致，clo（克隆）在4dpf时，突变肝脏中的Prox1+实质细胞数量仅为野生型肝脏的三分之二(). 然而Tg（手柄2：在野生型和突变型中，肝脏内表达EGFP的细胞相似()提供了直接证据，证明HSC并非来源于内皮细胞，也不依赖SEC进入肝脏。
clo（克隆）变异的肝脏仍然含有Tg（手柄2：EGFP）表达细胞。（A-B）野生型和clo（克隆）突变幼虫是从clo（克隆）杂合子鱼也是纯合子手柄2:EGFP和kdrl:ras-mCherry公司转基因。4 dpf时，野生型肝脏形成了清晰的血管网Tg（kdrl：ras-mCherry）表达（A），内皮细胞在clo（克隆）突变肝脏（B）。（A’-B’）共焦重建肝脏横截面，如（A-B）所示。白色虚线（A-B'）勾勒出肝脏的轮廓。（A-B）中的黄色虚线表示重建截面的标高。（C-D）表达Alcam（红色）和表达HSC的肝胆细胞的分布Tg（手柄2：EGFP）（绿色）。在野生型（C）中，大多数HSC（星号）由肝细胞（括号表示）与胆汁细胞（箭头）分离。相反，在clo（克隆）突变肝脏（D）、HSC与胆道细胞密切相关（箭头所示）。（E） 野生型和clo（克隆）突变幼虫。Prox1染色检测肝细胞(25). 4个野生型和4个clo（克隆）突变幼虫在4dpf下进行分析。星号表示统计显著性：*p<0.05***p<0.001。（A-B，C-D）共焦单平面图像，位于顶部前方。比例尺，20μm。
在哺乳动物中，HSC位于位于肝细胞基底外侧表面下方的Diss空间，而胆道细胞仅限于门区（由27). 我们发现，在野生型斑马鱼肝脏中，肝细胞将HSC的细胞体与胆汁细胞分离(). 引人注目的是，英寸clo（克隆）变异肝脏、HSC似乎与胆道细胞密切相关(，箭头），表明SEC的丢失改变了HSC、肝细胞和胆道细胞之间的关系。
抑制VEGF信号导致HSC数量减少
在肝损伤期间，血管生成因子VEGF及其受体在激活的HSC中诱导，并且VEGF信号已被证明可以调节SEC和HSC之间的相互作用（由1). 为了确定VEGF在发育过程中是否也参与SEC-HSC相互作用，我们对Tg（hand2:EGFP；kdrl:ras-mCherry）SU5416是Flk-1/KDR受体酪氨酸激酶的一种有效和选择性抑制剂的动物(28). SU5416已被证明能有效阻断斑马鱼的VEGF信号和血管生成(29,30). 与这些报告相一致，我们观察到SU5416治疗的动物肝内血管分支数量在55至80 hpf之间呈剂量依赖性减少(). SU5416治疗后HSC数量显著减少()尽管大多数剩余的HSC仍与SEC保持密切联系（数据未显示）。当我们用SU5416治疗72到96 hpf之间的动物时，在大量SEC和HSC进入肝脏后，我们观察到SEC和hsC的轻度缺乏().
在发育过程中抑制VEGF信号传导降低HSC数量。（A-C）抑制VEGF信号以剂量和时间依赖性的方式减少肝内血管分支和HSC的数量。（A） 肝脏的共焦投影Tg（hand2:EGFP；kdrl:ras-mCherry）用DMSO或VEGF受体抑制剂SU6415处理55至80 hpf或72至96 hpf的幼虫。背视图，位于顶部前方。（B） 用二甲基亚砜、1μM SU6415或2μM SU64 15处理的动物肝内血管分支的数量（平均值±SEM）。（C） 同一动物中HSC的数量（平均值±SEM）。（D） Kdrl水平的降低导致HSC数量减少。左侧面板显示未注射对照组和kdrl（kdrl）吗啉（MO）-在80 hpf时注射幼虫。右图显示了未注射对照中HSC的数量（平均值±SEM），以及kdrl（kdrl）-击倒动物。（E） HSC数量（平均值±SEM）clo（克隆）用二甲基亚砜或SU5416处理的突变体。VEGF信号传导抑制降低了HSC的数量clo（克隆）突变体。（A，D）白色虚线勾勒出肝脏的轮廓。比例尺，20μm。（B-E）分析的动物数量显示在图表底部。星号表示统计显著性：*p<0.05**p<0.01***p<0.001****p<0.0001。
为了测试HSC和SEC开发中Kdrl的特定需求，我们注入Tg（hand2:EGFP；kdrl:ras-mCherry）靶向反义吗啉（MO）的胚胎kdrl（kdrl）(18). 与以前的数据一致(18)，注射3 ngkdrl（kdrl）MO导致血管严重减少（数据未显示）。我们没有发现任何Tg（kdrl：ras-mCherry公司)在肝脏中的表达kdrl（kdrl）-击倒动物(). 与SU5416治疗引起的表型相似，我们观察到HSC在kdrl（kdrl）-击倒动物(). 这种减少不太可能是由于肝脏生长延迟，因为未注射的对照组和对照组之间Prox1+实质细胞的数量相似kdrl（kdrl）-击倒动物（p>0.11，对照组10和10kdrl（kdrl）-对击倒动物进行分析）。
VEGF信号的调节可能直接影响SEC和HSC。然而，也有可能是SEC主要受到影响，随后由于SEC和HSC之间的信号改变导致HSC减少。如果后一种情况是正确的，在没有SEC的情况下，VEGF信号的抑制不应影响HSC。因此，我们对clo（克隆）突变体，发现它们导致HSC细胞数量的剂量和阶段依赖性减少，类似于野生型的减少(). 这一结果表明，VEGF信号的抑制独立地损害HSC和SEC。
视黄醇受体激动剂改变HSC数量
鉴定影响HSC行为的生物活性化合物可以深入了解HSC生物学，并提供在肝损伤或疾病期间操纵HSC的方法。我们对338种化合物进行了初步筛选，寻找导致HSC数量减少或增加的因素。用55至80 hpf的化合物处理动物(;支持信息). 我们发现，AM580是一种视黄酸受体（RAR）α选择性激动剂(31)，HSC数量减少(). 相比之下，甲氧脯酸（MA），一种视黄醇X受体（RXR）激动剂(32)，增加HSC数量(). 这两种药物都不影响肝脏的大体形态或幼虫的存活。这些数据表明，维甲酸受体激动剂改变HSC数量体内这与之前的一篇报道一致，即维甲酸信号调节HSC的发展(33). 此外，在我们的初步筛选中，两种HSC改变化合物的鉴定证实了这种方法是发现影响HSC生物学的化合物的一种方法。
化学筛选可识别改变HSC编号的化合物。（A） 化学屏幕设置，用卡通说明感兴趣的表型，例如与对照组（左侧动物）相比HSC数量减少（中间动物）和HSC数量增加（右侧动物）。（B） 用二甲基亚砜、AM580或甲氧脯酸（MA）处理的动物中HSC的数量（平均值±SEM）。分析的动物数量显示在图表的底部。星号表示统计显著性：*p<0.05**p<0.01。（C） 肝脏的共焦投影Tg（手柄2:EGFP）用DMSO、AM580或MA处理55至80 hpf的幼虫。背视图，位于顶部前方。白色虚线勾勒出肝脏的轮廓。比例尺，20μm。
讨论
在这里，我们展示了斑马鱼的第一个HSC报告基因系，Tg（手柄2:EGFP）与哺乳动物HSC类似，斑马鱼HSC与SEC非常接近，呈星状形态，并储存脂滴。重要的是，它们对急性乙醇暴露表现出强大的细胞反应，因此在功能上与哺乳动物对这种肝脏损伤的反应相当。我们追踪了HSC的发展，发现它们在SECs进入肝脏后进入clo（克隆）突变体，我们发现SEC对HSC分化或进入肝脏并不需要。然而，在缺乏SEC的情况下，HSC反而与胆道细胞相关。我们还发现，即使在没有SEC的情况下，抑制VEGF信号也会显著减少进入肝脏的HSC数量。最后，我们展示了HSC报告基因系在基因保护分析和化学筛选中的应用，以确定HSC发展的新分子机制。我们的研究提供了斑马鱼HSC发育的详细特征，并验证了该模型生物在HSC研究中的有用性。
由于HSC的基因表达多样，其胚胎起源尚不明确。我们发现，在斑马鱼中，HSC表达手动2它标记了中胚层和神经嵴衍生物，并支持HSC的中胚层和神经元嵴起源。据推测，HSC和SEC共享一个共同的前体。HSC-SEC相互作用的研究有限，部分原因是内皮细胞缺陷的小鼠突变体表现出早期胚胎致死性(34). 与哺乳动物的肝脏不同，斑马鱼的肝脏不是造血器官，肝脏缺陷不会导致贫血或早期死亡(25). 我们在中检测到HSCclo（克隆）缺乏SECs的突变体，从而提供了HSC不是来源于斑马鱼中的SECs或其前体的直接证据。
我们的分析clo（克隆）突变体揭示了SEC在肝发育过程中HSC定位中的惊人作用。在正常肝脏中，SEC引导HSC到达适当的正弦位置。当SEC缺失时，HSC不会迁移到肝脏；相反，它们与胆道细胞异常相关。在正常肝脏中，SEC和胆道细胞都可能具有控制HSC迁移的能力，其中SEC占主导地位。或者，胆道细胞可能没有内在的能力吸引正常肝脏中的HSC，但在缺乏SEC的情况下，可能会获得具有这种能力的新表型。在胆道疾病中，胆管细胞被认为经历上皮-间充质转化（EMT），通过EMT获得间充质细胞的特征（由35). 确定胆道细胞的EMT是否有助于改变HSC在clo（克隆）突变体。胆汁-HSC相互作用在胆道疾病中起着重要作用，包括趋化因子、细胞因子、嘌呤能激动剂和形态因子（如刺猬）在内的旁分泌信号已被证明介导了这些相互作用（由35). 进一步研究clo（克隆）突变体可以识别额外的旁分泌信号，从而提高我们对正常和疾病肝脏中胆汁-HSC相互作用的理解。
我们发现通过化学抑制剂治疗或kdrl（kdrl）MO注射降低了HSC数量，并且在没有SEC的情况下，这种影响仍然存在。VEGF信号似乎对HSC的分化和存活并不重要，因为在后期阻断VEGF的信号只会导致HSC数量的轻微减少。相反，HSC进入肝脏的初始波可能需要VEGF信号。在以后的发育过程中，当肝脏中存在大量HSC和SEC时，不同的信号（可能来自现有HSC和Sec）可能在吸引更多HSC方面发挥更大的作用。同时，由于我们的两种方法都诱导了VEGF信号的全局抑制，因此它们可能也损害肝细胞和/或胆道细胞，这可能有助于HSC数量的减少。未来，有必要选择性地敲低HSC中的VEGF受体功能，以确定HSC对VEGF信号的特异性需求。
我们描述了一个初步的化学筛选，以确定影响HSC发展的药物。与在培养细胞中进行的化学筛选相比，使用斑马鱼进行化学筛选有几个优点(36,37). 首先，斑马鱼系统能够识别在HSC中引起特定表型的药物，而不会对其他器官造成实质性毒性。第二，体内该系统能够识别需要额外细胞类型、基质成分和/或生长因子来帮助调节其影响的化合物。最后，通过在体外筛检可能对活动物无效，可能是因为基因表达的关键差异(37). 我们的初步筛选结果表明，两种维甲酸受体激动剂AM580和MA对HSC数量产生了相反的影响。虽然HSC在维甲酸的储存和运输中有着公认的作用，但维甲酸在调节HSC增殖和纤维生成中的作用尚不完全清楚，并且关于维甲酸对HSC影响的研究报告一直存在矛盾（由1). 有趣的是，所有-反式-视黄酸（RA），9-顺式-RA和合成类视黄醇对培养中活化的HSC有不同的影响(38)支持RXR和RAR在HSC中至少具有一些非重叠效应的假设。我们很有兴趣进一步探讨维甲酸信号在发育和损伤过程中的作用Tg（手柄2:EGFP）以及扩展化学筛选，以识别对HSC生物学有影响的其他化合物。
我们的工作表明Tg（手柄2:EGFP）线条代表百搭体内补充细胞培养和哺乳动物系统的HSC研究模型。更重要的是，这表明该HSC报告系不仅可以用于HSC发育的研究，还可以用于研究其在肝损伤中的激活，因为急性酒精损伤会触发斑马鱼HSC的强大细胞反应，类似于在哺乳动物肝损伤中激活的HSC中观察到的细胞反应。斑马鱼和哺乳动物HSC的功能相似性，再加上斑马鱼模型的独特优势，为研究肝损伤中的HSC生物学开辟了许多令人兴奋的新途径。
确认
我们要感谢Scott Friedman博士和D.Montgomery Bissell博士的批判性评论和支持，感谢Stainier实验室成员的技术建议和讨论。我们感谢加州大学旧金山分校肝脏中心提供的技术支持，以及加州大学旧金山基因组中心进行定量实时PCR的核心设施。我们感谢Sarah Elmes为FACS提供的帮助，以及Ana Ayala、Milagritos Alva和Mark Sklar为鱼类护理提供的帮助。
财务支持：
尹春月获得美国国立卫生研究院批准号K99AA020514和加州大学旧金山分校肝脏中心飞行员/可行性奖（美国国立卫生院P30DK026743）的支持；Kimberley J.Evason是Damon Runyon癌症研究基金会（DRG-109-10）资助的Damon Runyon研究员；杰奎琳·马赫（Jacquelyn J.Maher）得到了国家卫生研究院（NIH）的资助（R01DK068450、R01DK088674和P30DK026743）；这项工作得到了NIH（R01DK060322）和Packard基金会对Didier Y.R.Stainier的部分资助。
缩写
| HSC公司 | 肝星状细胞 |
| 秒 | 肝窦内皮细胞 |
| 重量1 | 威尔姆斯肿瘤抑制基因 |
| GFAP公司 | 胶质纤维酸性蛋白 |
| 手动2 | 心脏和神经嵴衍生物表达转录本2 |
| clo（克隆） | 钟表 |
| 血管内皮生长因子 | 血管内皮细胞生长因子 |
| 数字功率因数 | 受精后天数 |
| 马力 | 受精后小时 |
| FACS公司 | 荧光激活细胞分选 |
| 卫生官员 | 吗啉 |
| 妈妈 | 甲氧丙烯酸 |
| 风险调整比率 | 维甲酸受体 |
| RXR公司 | 维甲酸X受体 |
| 电子病历 | 上皮-间充质转化 |
| 无线电高度表 | 维甲酸 |
| A类 | 先前的 |
| P（P） | 后面的 |
| 我 | 左边 |
| R（右） | 正确的 |
| D类 | 背部的 |
| V（V） | 腹侧的 |
| 国际 | 肠 |
| 锂 | 肝脏 |
| 酸碱度 | 咽弓 |
| 翅片 | 翅芽 |
| 前置器1 | 繁荣相关同源盒基因1 |
| 乙醇 | 乙醇 |
| dpt（dpt） | 治疗后天数 |
工具书类
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