蛋白激酶Cα磷酸化物——钙依赖性刺激血管内皮细胞内皮一氧化氮合酶过程中丝氨酸328处的新型精氨酸琥珀酸合酶位点^*♦

AS变异体的产生和瞬时转染

将AS cDNA克隆到pcDNA 3.1/V5-His，B表达载体（Invitrogen）中。然后根据制造商的说明，通过QuikChange试剂盒（Stratagene）对AS构建体进行定点诱变。简言之，Ser-328突变为丙氨酸以模拟非磷酸化状态，突变为天冬氨酸以模拟组成磷酸化状态。用于S328A突变的引物是有意义的：ACGGGTTTCTGGCACGCGCCCGAGTGAATTT和反义的：AAATTCACTCGGCGCTGCCAGAACCCGT。用于S328D突变的引物是有意义的：ACGGGTTTCTGGCACGACCGAGTGAATTT和反义的：AAATTCACTCGGGTCGTGCCAGAACCCGT。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）在无血清Opti-MEM I（Invit罗gen）中瞬时将实验质粒（6孔培养皿中每孔1μg DNA）转染到BAEC中。4 h后，用含10%血清的DMEM替换培养基，培养细胞6或24 h。用钙离子载体A23187和原钒酸钠刺激细胞4 h，然后通过2,3-二氨基萘（DAN）测定培养基中NO的生成。

质谱分析

瞬时转染AS的BAEC孵育24小时，血清饥饿16小时，并用10μ米缓激肽或50 n米冈田酸作用30分钟。过表达的AS通过其融合的His纯化₆使用镍-硝基三乙酸-海藻糖磁珠标记（Qiagen）。用SDS-PAGE分离蛋白质以鉴定AS带（51 kDa）。使用重复凝胶通过Western blot确认AS质粒的表达。将感兴趣的凝胶带切除并去除污渍。蛋白质二硫化物用三羧乙基膦还原，半胱氨酸用碘乙酰胺烷基化。采用凝胶胰蛋白酶消化法进行蛋白质水解。采用纳米流反相液相色谱法通过疏水性分离肽（LC Packings，Dionex，Sunnyvale，CA）。在线检测是用电喷雾线性离子阱质谱仪（LTQ，Thermo Scientific）完成的。使用Mascot和SEQUEST数据库搜索算法将串联质谱分配给肽序列。通过手动检查数据来验证序列分配。

精氨酸琥珀酸合成酶磷酸丝氨酸Ser-328特异性抗体

21世纪生物化学公司使用磷酸肽AS序列322–335:RR-Ahx-YGFWH[pS]PECEFVR-amide（其中pS表示磷酸）生成了针对Ser（P）-328 AS的磷酸特异性抗体。磷酸化AS抗体的特异性通过进行磷酸肽竞争和免疫沉淀，然后进行蛋白质印迹来确定。

Western Blot分析

在添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Pierce）的放射免疫沉淀分析缓冲液中裂解BAEC，然后刮取收集。澄清全细胞裂解物，并使用BCA蛋白分析（Pierce）定量总蛋白。等量（20μg）的蛋白质在4–15%Tris-HCl TGX预制凝胶（Bio-Rad）上溶解，并印在Immobilon-P聚偏氟乙烯膜上。如前所述进行蛋白质印迹(11). 在100%StartingBlock（Pierce）中封闭膜，并在20%StartingBlock1:2500抗AS（BD Transduction Laboratories）中与一级抗体孵育。使用的二级抗体是1:50000稀释度的过氧化物偶联山羊抗鼠或抗兔IgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories）。使用West Pico试剂（Pierce）通过化学发光对斑点进行可视化，并将其暴露于薄膜中。使用Quantity-One软件（Bio-Read）对谱带强度进行量化。

一氧化氮测定

如前所述，使用荧光DAN（Sigma）分析法测量培养基中的亚硝酸盐，作为细胞NO的指示剂(12). 在96 well黑板中进行反应，在BMG FLUOstar Galaxy荧光光谱仪板读卡器上读取荧光，在360 nm激发，在405 nm检测发射。数据描述为每微克蛋白质中亚硝酸盐的pmol。

PKCα敲除试验

将90%融合的BAEC与靶向PKCα第五外显子（集成DNA技术）的dicer底物siRNA（DsiRNA）转染48小时，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen），如前所述进行as构建。用于沉默基因表达的双链序列如下：5′-CGAGGAGCAAGCACAAGUUCAAGAT-3′和5′-ACUUGGAACUGUGCUUGCCUGGG-3′。然后用钙离子载体（A23187，Sigma）处理转染的BAEC，并在蛋白印迹后进行裂解。如上所述，对所示蛋白质的相对量进行定量。

钙依赖性刺激BAEC降低Ser-328的磷酸化

为了确定Ser-328的磷酸化是否具有生理意义，通过改变NO生成的生理线索来检查Ser-328磷酸化相对于治疗的变化。特别是，选择VEGF和胰岛素刺激NO生成有两个原因。首先，有证据表明，血管内皮生长因子（VEGF）治疗后AS磷酸化发生改变，而VEGF治疗是通过PKA信号介导的(8). 第二，已知VEGF和胰岛素通过促进eNOS的Ser-1179磷酸化来刺激内皮细胞NO的生成(13,14).

如所示图2，与文献一致(13)，我们发现胰岛素和VEGF促进了Ser-1179约50%eNOS的磷酸化增加（Western blot，图2,一个和C类; 密度测定，图2,B类和D类)NO生成相应增加(图2E类). Thr-497处eNOS的磷酸化也随之降低约40%（Western blot，图2,一个和C类; 密度测定，图2,B类和D类) (15–17). 令人惊讶的是，通过VEGF（85%）或胰岛素（40%）治疗，Ser-328的磷酸化显著降低（Western blot，图2,一个和C类; 密度测定，图2,B类和D类).

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图2。

钙诱导的NO生成依赖性刺激降低精氨琥珀酸合成酶Ser-328的磷酸化(328件). 一个和C类，BAEC接受胰岛素治疗(Ins公司)100 n时米(一个)或100 ng/ml时的VEGF(C类)20分钟。磷酸化(P（P）)使用磷酸特异性抗体通过蛋白质印迹进行测定，并用eNOS和AS特异性抗体重新处理。印迹是三个独立实验的代表。NT公司，未处理。B类和D类，密度值分别表示从非处理对照组归一化为总eNOS或AS的变化百分比。密度变化显著，S.E.表示为误差线(n个= 3,第页< 0.05).E类，从用胰岛素或血管内皮生长因子处理过的BAEC培养基中提取的亚硝酸盐，采用DAN分析法，以S.E.表示误差线(*,n个= 3,第页< 0.05).

钙依赖性刺激BAEC增加Ser-328的磷酸化

胰岛素和VEGF通过PI3K/Akt途径介导Ser-1179处的eNOS磷酸化，该途径在很大程度上与钙无关(18–20). 由于胰岛素或VEGF介导的钙非依赖性信号传导促进了AS Ser-328的明显去磷酸化，因此我们质疑Ser-328处的磷酸化是否与钙依赖性信号传递有关。为了初步探讨这个问题，进行了定点突变分析。使用了三种构建体，一种含有野生型（WT）AS，一种含有Ser-328的Ala取代（磷酸缺失），另一种含有Ser-328的Asp取代（磷酸模拟物）。如所示图3一个当用钙离子载体刺激时，磷酸型S328D AS的过度表达增强了NO的生成，类似于WT AS。相反，在相同的治疗中，过表达磷酸化全S328A AS未能提高NO的生成。Western blotting显示结构的一致表达(图3B类). 只有S328D过度表达将NO生成增加到WT水平的观察结果表明，Ser-328的磷酸化支持精氨酸在钙依赖性刺激条件下传递到eNOS。

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图3。

与WT或类磷酸化物（S328D）相比，过度表达的Ser-328磷酸化突变为丙氨酸产生的受刺激NO显著减少。 一个BAEC瞬时转染WT，将磷酸-全丝氨酸转染至丙氨酸328（S328A），或将磷酸-氨基酸丝氨酸转导至天冬氨酸（S328D）AS，然后用0.5μ米钙离子载体A23187和50μ米原钒酸钠。结果代表了S.E.的四个不同实验误差线. (*,第页<0.05相对于WT；†，第页<0.05（相对于S328D）。B类，代表性Western blot证实WT、S328A和S328D过度表达。

由于这些发现与钙依赖性一致，因此进行了实验，以确定Ser-328中的钙依赖性变化是否可用于内源性AS。在这些实验中，BAEC用钙离子载体A23187或内质网ATP酶抑制剂thapsigargin处理。已知这两种药物都能促进细胞内钙的增加(21)刺激NO生成。如所示图4,一个和B类，两种药物均可促进eNOS在Ser-1179的磷酸化近50%，随后在Thr-497的eNOS磷酸化降低40%，与报告值一致(21,22). 然而，在这种情况下，用钙离子载体或thapsigargin治疗显示AS Ser-328的磷酸化增加（～60%）(图4,一个和B类).

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图4。

钙依赖性刺激NO生成增加精氨酸琥珀酸合成酶Ser-328的磷酸化。 一个磷酸化变化的Western blot分析(P（P）)相对于用钙离子载体（A23187）和thapsigargin治疗20分钟(十)在存在或不存在细胞内钙螯合剂BAPTA-AM的情况下。斑点是五个独立实验的代表。B类，密度值表示未经处理的(NT公司)对照分别归一化为总eNOS或AS。密度变化显著，S.E.表示为错误栏。C类在BAPTA-AM存在或不存在的情况下，用钙离子载体（A23187）和thapsigargin处理BAEC的培养基，用DAN分析法检测亚硝酸盐。(n个=5，较未处理显著增加：*，第页<0.05，与A23187单独使用相比显著降低，第页<0.05，与单独使用thapsigargin相比显著降低；†，第页< 0.05).

为了进一步证实AS Ser-328磷酸化的钙依赖性，用细胞内钙螯合剂BAPTA-AM处理BAEC。正如预期的那样，钙离子载体和thapsigargin挽救了eNOS Ser（P）-1179处的磷酸化，而单独使用BAPTA-OM处理后磷酸化减弱。重要的是，如所示图4一个，用50μ米BAPTA-AM完全消除了Ser-328的磷酸化以及eNOS Ser-1179的磷酸化。因此，AS Ser-328的磷酸化似乎通过钙依赖信号与eNOS Ser-1179的磷酸化协调调节。

为了证明生理相关性，在用BAPTA-AM处理细胞30分钟，然后用钙离子载体A23187刺激20分钟后进行NO测量。A23187和thapsigargin与未处理或BAPTA-AM-处理的BAEC相比显著增加NO生成(图4C类). 此外，BAPTA-AM处理显著降低了A23187或thapsigargin刺激的NO生成，分别为2.5倍和2倍。

PKC参与调节BAEC中Ser-328磷酸化

为了进一步阐明参与Ser-328处AS钙依赖性磷酸化的信号通路，使用激酶抑制剂进行了一系列实验。因为经典的PKC同型是钙依赖性激酶，不参与胰岛素或VEGF信号传导(23,24)，我们假设PKC家族的一个成员可能参与AS Ser-328的钙依赖性磷酸化。为了验证这一假设，进行了非等型特异性PKC抑制研究。作为第一种方法，通过检测As Ser-328磷酸化直接测量PKC抑制的效果。如所示图5一个和B类与未经处理的对照组相比，用PKC抑制剂罗特列林或PKC抑制剂双吲哚甲基苯胺I治疗BAEC，然后用钙离子载体刺激，使AS Ser-328磷酸化降低了～60%。这些结果被认为是一致的，并且支持经典PKC同型在Ser-328促进AS磷酸化的作用。

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图5。

42μl非等型特异性PKC抑制米罗特林或2.5μ米双吲哚甲酰胺I降低磷酸化(P（P）)参见AS Ser-328。BAEC用42μ米鹿特林(Rott公司)或2.5μ米双吲哚甲酰亚胺I(比斯)在用钙离子载体（A23187）刺激前30分钟，持续20分钟。一个三个实验的代表性Western blot。B类，密度值表示未经处理的(NT公司)对照分别归一化为总eNOS或AS。密度变化显著，S.E.表示为误差线(n个= 3,第页< 0.05).C类用DAN法检测处理后BAEC培养基中的亚硝酸盐。A23187在添加或不添加双吲哚甲酰胺I的情况下显著增加NO的生成（相对于未处理组的显著性：*，n个= 3,第页< 0.05; 相对于A23187的显著性：，n个= 3,第页< 0.05).

有趣的是，无论钙刺激如何，经鹿特伦治疗后，eNOS的Thr-497或Ser-1179的磷酸化也降低了～60%。相反，当BAECS单独用双吲哚甲酰亚胺I处理时，eNOS的Ser-1179和Thr-497磷酸化仅降低了20%。然而，在钙刺激下，eNOS Ser-1179的磷酸化增加到类似于单独钙离子载体治疗的水平。然而，在双吲哚甲酰胺I存在下，Ser-328的磷酸化不受钙的影响(图5一个).

为了证明系统对抑制剂反应的生理相关性，我们测量了每种治疗的NO生成(图5C类). 用双吲哚甲酰胺I抑制PKC对BAEC产生NO的影响不大；然而，鹿特伦显著降低了钙离子载体刺激的NO生成2倍以上。这些结果表明，罗氏菌素可能影响几种激酶的活性，而双吲哚甲基苯胺I明显降低eNOS Thr-497的磷酸化，从而促进NO的生成，类似于单独钙离子载体。

为了进一步研究可能磷酸化Ser-328的其他钙依赖性激酶的潜在参与，进行了额外的激酶抑制研究。ERK1/2被PD98059抑制，Ca²⁺/用KN93抑制钙调素依赖性蛋白激酶II（CaMKII）。在这两种情况下，当BAEC与钙离子载体或thapsigargin联合处理时，未观察到对AS Ser-328磷酸化的抑制作用（数据未显示）。这些结果表明PKC，而不是ERK1/2或Ca²⁺/钙调素依赖性蛋白激酶II负责钙刺激的AS Ser-328磷酸化。

因为PKCα是一种钙依赖性激酶，在钙依赖性刺激eNOS期间被证明是活性的(25)，我们试图确定这是否是负责AS Ser-328磷酸化的同型。为了测试这一点，我们检测了用DsiRNA直接敲低PKCα的效果。DsiRNA不同于用于基因沉默的传统siRNA，因为用于沉默的RNA双链不仅模仿骰子产物，但也通过RNA诱导沉默复合物（RISC）对骰子处理进行了优化，以产生更有效的击倒(26). 如所示图6，PKCα被显著击倒。针对PKCα的DsiRNA在1和5 n时允许50%和75%的敲除米DsiRNA。敲除PKCα后，用钙离子载体进行处理，发现1或5 n时Ser-328的磷酸化降低了50%和60%米并防止钙离子载体处理引起的磷酸化增加。在这些条件下，eNOS在Ser-1179的磷酸化在很大程度上不受PKCα敲除的影响，而eNOS Thr-497在PKCα被敲除80%时下降～60%。这些结果表明PKCα是一种磷酸化AS的Ser-328的激酶。

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图6。

PKCα的敲除降低了磷酸化(P（P）)位于Ser-328，而不是eNOS Ser-1179。BAEC用1或5 n米DsiRNA针对PKCα的第五外显子，并允许表达24小时，然后用钙离子载体A23187刺激20分钟，并与未处理的BAEC进行比较。一个三个实验的代表性Western blot。B类，密度值表示未经处理的(NT公司)对照分别归一化为总eNOS或AS。密度变化显著（除了A2317对PKCα表达或1 n米用S.E.表示的pS1179 eNOS上的DsiRNA处理误差线(n个= 3,第页<0.05）（相对于未处理或仅DsiRNA的显著性：*，n个= 3,第页< 0.05).