为了研究活性氧在细胞转化和肿瘤发生中的作用，我们利用内源性和条件致癌的LSL-K-RasG12D系列等位基因7.K-Ras公司G12D系列/+和K-Ras液化石油气/+将MEF与转导K-Ras4B的MEF和NIH3T3成纤维细胞（NIH3T3s）进行比较G12D系列和H-RasV12版本()，因为之前有报道称异位引入Ras会增加ROS的生成8与致癌Ras的异位过度表达相反，K-RasG12D系列/+与K-Ras相比，MEF显示过氧化氢、超氧化物和线粒体ROS水平较低LSL公司/+MEF公司(,补充图2a、b). 因此，在表达内源性K-Ras的MEF中，DNA氧化的主要产物之一7,8-二氢-8-oxo-2′-脱氧鸟苷（8-oxo-dGuo）的水平降低G12D系列/+，但因异位致癌Ras而增加(). p53中ROS和8-oxo-dGuo的水平也较低-/-; K-Ras公司第12天/+MEF与p53的比较-/-; K-Ras公司LSL公司/+MEF公司(补充图2c、d)，支持这些差异不是由于衰老程序的差异激活，并证明完全转化不需要增加ROS生成7,9.
致癌基因的生理表达降低ROS用逆转录病毒载体转导NIH3T3和MEFs，并在6天后进行评估：对照载体（pBabe）、pBabe-H-RasG12伏（p-Babe-H-Ras）或pBabe-K-RasG12D系列（p-Babe-K-Ras）。或者，LSL-K-RasG12D系列MEF感染了Ad-mock（K-RasLSL公司/+)或Ad-cre（K-RasG12D系列/+)4天后进行评估。野生型MEF感染Ad-mock（WT-Ad-mock）或Ad-cre（WT-Ad-Core）作为对照。a、，（左）表达内源性和异位Ras的MEF中总Ras和GTP-结合Ras的Western blot，Rac用作负荷控制。（右）通过2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCF）染色测定致癌Ras表达后的ROS水平。b、，K-Ras异位和内源性表达后8-oxo-dGuo的水平G12D系列.c-f、，异位K-Ras过度表达细胞中GSH/GSSG比值和细胞总谷胱甘肽的测定G12D系列(c、 d日)，或表达内源性K-RasG12D系列(e、 （f）).克，Myc激活后的ROS水平ERT2系统.R26型市场汇率/市场汇率用二甲基亚砜或100nM 4-OHT处理MEF，24小时后进行分析。数据代表3个或更多独立实验*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，误差线代表此处和所有数字的±SEM。
因为活性氧的改变可以影响细胞内氧化还原状态10在表达异位和内源性K-Ras的细胞中检测还原/氧化谷胱甘肽（GSH/GSSG）的比率G12D系列而两者都提高了总谷胱甘肽的水平(和参考文献11)，只有K-Ras的内源性表达G12D系列提高GSH/GSSG比率以促进细胞内环境的进一步降低(). 异位致癌Ras产生ROS主要受NADPH氧化酶（Nox）的调节12只有致癌Ras的异位过度表达增加了Nox活性和mRNA，为这些不同结果提供了一种机制解释(补充图3). 与致癌Ras类似，Myc的异位表达也能增加NIH3T3成纤维细胞中ROS的生成13因此，我们试图确定该癌基因的近生理表达是否具有类似的效果。R26的处理市场汇率/市场汇率MEF，表达纯合MycERT2系统Rosa26启动子控制下的等位基因14，4-OHT导致ROS显著减少(). 然而，这并不是所有致癌刺激的特征，因为激活的Notch1和β-catenin的表达并没有降低ROS(补充图4). 因此，致癌K-Ras或Myc的内源性表达ERT2系统与这些癌基因的异位过度表达相比，降低细胞ROS水平。
由于细胞内氧化还原状态主要由Nrf2调节，我们检测了K-Ras中Nrf2蛋白的水平和活性LSL公司/+和K-RasG12D系列/+Nrf2靶基因的western blot、报告分析和染色质免疫沉淀分析MEFHmox1型和编号1.K-Ras的表达G12D系列与对照MEF相比，Nrf2蛋白和结合活性大约增加了两倍(,补充图5a)这不是因为Keap1的调节发生了改变2(补充图6). K-Ras公司G12D系列/+MEF显示Nrf2 mRNA增加Hmox1型,编号1,Gclc公司,Gclm公司和总成1mRNA和蛋白质(,补充图5b). K-Ras后还观察到Nrf2及其靶基因的表达增加G12D系列p53的表达-/-MEFs和K-Ras异位表达G12D系列和H-RasV12版本在原发性MEF中，但不在激活的Notch1或β-catenin表达后(补充图5c-g). 然而，K-Ras的表达G12D系列在Nrf2中，缺乏MEF未能提高总谷胱甘肽，导致细胞内环境氧化程度更高(). 用于表达K-Ras的细胞培养条件G12D系列野生型K-Ras的基因剂量也不影响Nrf2靶基因的表达(补充图7a、b). 此外，野生型MEF中的ROS代谢对Keap1和Nrf2水平的急性变化敏感，进一步支持Nrf2和ROS之间的因果关系(补充图7c-e). 此外，Nrf2的急性敲除减弱了K-Ras对活性氧的减少G12D系列()Nrf2缺失对活性氧的影响具有剂量依赖性，支持Nrf2 mRNA水平对活性氧控制的重要性(补充图7f，g). 类似于K-RasG12D系列，c-Myc的激活ERT2系统（4-OHT）促进了Nrf2及其靶基因的mRNA和蛋白质水平的增加(,补充图7h). 此外，来自ENCODE联盟的ChIP-seq数据证明Myc与Nrf2位点直接结合(补充图8a)15因此，K-Ras和Myc癌基因可以组成性地增加Nrf2的转录，从而提高抗氧化和细胞解毒程序的基本活性。
致癌基因的生理表达激活Nrf2抗氧化程序a、，Western blot显示内源性K-Ras表达后Nrf2蛋白增加60%G12D系列.使用Nrf2确认抗体特异性-/-MEF公司。b、，Hmox1和Nqo1启动子的Nrf2 ChIP和q-PCR。控制来自Hmox1和Nqo1启动子的50Kb DNA的非特异性引物扩增区域。c、，Nrf2和Nrf2靶基因的表达Nqo1、Hmox1、Gclm、Gclc和总成1K-Ras上G12D系列Nrf2中的表达+/+和Nrf2-/-MEF公司。Nrf2 mRNA相对不稳定，但在Nrf2中仍能检测到低水平-/-MEF公司。d-e、，GSH/GSSG比率的测定(d日)和总谷胱甘肽(e（电子）)K-Ras上G12D系列Nrf2中的表达-/-MEF公司。f、，siRNA.LSL-K-Ras缺失Nrf2后的活性氧水平G12D系列MEF转染非靶向（NT）或Nrf2 siRNA，感染Ad-mock或Ad-cre，48小时后检测DCF氧化。克，Myc诱导后Nrf2蛋白水平的Western blotERT2系统4-OHT。密度测定显示增加了2.3倍。小时，Myc激活后Nrf2抗氧化程序基因表达分析ERT2系统.R26市场汇率/市场汇率MEF用二甲基亚砜或100nM 4-OHT处理24小时，并检测抗氧化基因表达。数据是3个独立实验的代表。
研究K-Ras激活Nrf2的机制G12D系列研究了Raf/MEK/ERK和p38alpha-MAPK通路的作用。首先，用一种有效且特异的MEK抑制剂AZD6244（ARRY-142886）处理细胞(补充图9a-c)，恢复了K-Ras的ROS水平G12D系列/+细胞接近K-Ras水平LSL公司/+单元格(). 此外，AZD6244处理导致Nrf2及其靶基因的诱导减少(). 此外，B-Raf的内源性表达V619E型（对应人类B-RafV600E型)16导致磷酸化ERK水平升高，ROS降低，Nrf2 mRNA和抗氧化基因表达增加(补充图9d-f). 如前所述17，我们发现p38alpha MAPK激酶没有激活Nrf2(补充图9g-i). 为了确定Nrf2表达增加的机制，我们检测了MAPK信号下游的转录因子。因此，敲除Jun、Fra1和Myc，而不是JunD或Elk1，会降低K-Ras中的Nrf2 mRNA第12天/+细胞，与Jun一起几乎完成救援(). 实时PCR和western blot证实了siRNA的有效性(补充图10a、b). 重要的是，K-RasG12D系列/+MEF和B-RafV619E型与对照MEF相比，MEF中Jun蛋白水平升高，K-Ras中Jun水平升高G12D系列/+MEF通过AZD6244治疗获救(). 此外，用siRNA耗尽Jun可阻止K-Ras表达后活性氧的减少G12D系列(,补充图10c). 我们的结果加强了先前的发现，与AP-1位点相似的抗氧化反应元件有助于调节Nrf2启动子18最后，ChIP-seq揭示了Nrf2基因座的转录起始位点是Jun的直接结合靶标(补充图8b)15因此，K-RasG12D系列和B-RafV619E型通过Jun和Myc刺激Nrf2的转录。
K-Ras激活Nrf2G12D系列通过Raf-MEK-ERK-Jun途径发生a、，K-Ras治疗后的ROS水平G12D系列/+配备AZD6244的MEF。LSL-K-Ras公司G12D系列MEF用DMSO或0.1uM AZD6244治疗，感染Ad-mock（K-Ras）LSL公司/+)或Ad-cre（K-RasG12D系列/+)72小时后进行分析。b、，K-Ras治疗后抗氧化基因表达分析LSL公司/+和K-RasG12D系列/+使用AZD6244进行24小时MEF。c、，AP-1家族成员对Nrf2转录的控制。K-Ras公司液化石油气/+和K-RasG12D系列/+用siRNA转染MEF，48小时后检测Nrf2的表达。日期：，LSL-K-Ras中Jun和肌动蛋白水平的Western blotG12D系列和LSL-B-RafV619E型MEF公司。K-Ras公司LSL公司/+和K-RasG12D系列/+MEF用DMSO或0.1uM AZD6244处理24小时。e、，6月siRNA.LSL-K-Ras缺失后的ROS水平G12D系列MEF转染非靶向（NT）或Jun siRNA，感染Ad-mock或Ad-cre，48小时后检测DCF氧化。数据代表了3个独立实验。
接下来，我们检查了这些致癌基因是否促进Nrf2抗氧化剂和细胞解毒程序的激活体内在K-Ras突变小鼠中，Nrf2靶基因Nqo1的蛋白表达升高，8-oxo-dGuo的免疫反应性降低19人类侵袭前胰腺上皮内瘤变（PanIN）和胰腺导管腺癌（PDA），以及表达B-Raf的小鼠肺腺瘤V619E型(,补充图11a、12、13、14a). PanIN还显示脂质过氧化加合物丙二醛（MDA）的免疫反应性降低(补充图11b). 此外，K-Ras第12天/+与K-Ras相比，胰腺上皮细胞表现出Nrf2激活和ROS降低LSL公司/+而用K-Ras siRNA治疗人类PDA肿瘤细胞株导致Nrf2和Nqo1 mRNA减少，ROS增加(补充图15). 人胰腺癌中Nrf2的激活不能用Nrf2或KEAP1的体细胞突变来解释；我们对100多个人类PDA样本进行了测序，仅发现一例伴随KEAP1和K-RAS突变的病例(补充材料和补充图14b). 重要的是，Nrf2缺乏的小鼠PanIN对Nqo1呈阴性，与邻近形态正常的导管细胞相比，PanIN中8-oxo-dGuo和MDA的水平相似，支持Nrf2在ROS解毒中的作用体内(,补充图11b，c). Nrf2缺乏的唾液腺没有显示8-oxo-dGuo免疫反应性升高，表明K-RasG12D系列-表达细胞更依赖Nrf2进行ROS解毒(补充图16a). 因此，抗氧化程序在肿瘤发生过程中起作用，这与我们的发现一致，即致癌K-Ras和B-Raf的表达与Nrf2的激活有关。
胰腺癌中Nrf2抗氧化程序的证据a、，与形态正常的导管相比，小鼠PanIN和PDA中Nqo1（棕色染色）和8-oxo-dGuo（紫色染色）的免疫组织化学检测（11/11例受检病例中观察到类似的模式）。PanIN（箭头）、PDA（黑色箭头）、正常管道（白色箭头）以及所有图形。比例尺=56μm。b、，Nrf2中Nqo1和8-oxo-dGuo的免疫组织化学检测-/-PanIN与Nrf2的比较+/+PanIN（在所检测的每个基因型的5/5中观察到类似的模式，用白色虚线勾勒出PanIN）。比例尺=56μm。c、，编号2-/-和Nrf2+/+PanIN-1a发病率。以100微米的间隔对整个胰腺进行切片，并计算PanIN-1a的总数。日期：，Nrf2中PanIN-1a细胞的增殖-/-和Nrf2+/+小鼠，通过Ki-67免疫染色测定。
研究Nrf2的激活是否促进K-RasG12D系列在建立的胰腺癌和肺癌小鼠模型中检测了Nrf2消融对诱发癌的影响。发现Nrf2缺乏的胰腺含有较少的PanIN(). 唾液腺的增殖没有改变(补充图16b)来自Nrf2缺陷小鼠的PanIN的增殖性显著降低，并显示出细胞含量增加，表现出衰老相关的β-半乳糖苷酶活性(,补充图17a). PanIN细胞凋亡或DNA损伤无显著差异(补充图17b，c). K-Ras中也观察到衰老G12D系列/+小干扰RNA急性耗尽Nrf2后的MEF依赖于p53的表达(补充图17d). 在MEF中也观察到PanIN中发现的Nrf2依赖性增殖缺陷，抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸可以挽救这两种缺陷(补充图18a、b). 此外，Nrf2的治疗+/+含有谷胱甘肽合成抑制剂的PanIN小鼠导致PanIN增殖显著降低，但不影响相邻腺泡细胞的增殖(补充图18c-e). 此外，还研究了Nrf2在肺癌发展中的作用。Nrf2缺乏导致疾病负担和增殖显著降低，中位生存率增加(补充图19). 虽然我们不能排除构成性Nrf2缺乏引起的非细胞自主效应的潜在参与，但主要影响似乎仅限于肿瘤的发生和新生癌前细胞的增殖。这些结果表明，Nrf2促进K-RasG12D系列-引发胰腺和肺肿瘤的发生和增殖。
活性氧可以通过DNA氧化和随后促进致癌的基因突变来刺激肿瘤发生。相反，我们发现激活ROS解毒程序有助于肿瘤的发生，尽管我们的研究并不排除其他Nrf2靶点的作用，如药物代谢酶和外排泵、热休克蛋白、26S蛋白酶体亚基、生长因子和受体6未来的研究将有必要确定这些Nrf2功能在Nrf2活化的肿瘤中的作用。Nrf2和Keap1的体细胞突变导致Nrf2靶基因表达增加和Nrf2稳定性增加，这在人类癌症中得到了很好的证明，为肿瘤发生过程中Nrf2活性增强提供了一种机制。我们的工作描述了致癌信号作为肿瘤发生过程中激活Nrf2转录的替代机制(补充图1)，并表明氧化还原状态的调节在癌症中同样重要，因此可能代表一个治疗机会。因此，癌症细胞中Nrf2活性的组成性升高通过两种不同的机制发生：Nrf2周转减少和Nrf2 mRNA水平增加。
方法
染色质免疫沉淀
按说明进行染色质免疫沉淀25. 5×106细胞在37°C的DMEM+1%甲醛中固定10分钟，然后在1%SDS、10mM EDTA、50 mM Tris-HCl pH 8.1+蛋白酶抑制剂中溶解，并在冷水浴中超声20分钟，直到DNA的平均大小为1Kb。保存输入，将裂解液稀释在IP缓冲液中（1%Triton，2mM EDTA，150mM NaCl，20mM Tris-HCl pH 8.1），并与预先与Nrf2抗体（H-300，Santa Cruz）结合过夜的小球（Dynal Protein A，Invitrogen）混合。染色质免疫沉淀过夜，用RIPA缓冲液（50mM HEPES pH 7.6，1mM EDTA，0.7%脱氧胆酸钠，1%NP-40，0.5M LiCl）洗涤珠子6次，用TE洗涤两次。用1%十二烷基硫酸钠和0.1M NaHCO孵育珠子三在室温下保持30分钟，然后通过在65°C水浴中加热过夜，在输入和IP上反转交联。使用QIAquick自旋试剂盒（Qiagen）纯化DNA，并使用以下引物在Applied Biosystems 7900HT上使用power sybr mastermix（Applied biosystem）进行Q-PCR，共进行三次26,27：Nqo1-F 5′-GCGTTTCTAAGCGAGAAAC-3′，Nqo1-R 5′-GTAGATTAGTCCTCACTCAGCCG-3′，Nqo1非特异性-F 5′-GAGAGATGGAGAGAGAGAGAGAGAGAG-3′，Nqo1非特异性-R 5′-GGGGCACTATTGTCATT-3′，Hmox-1F 5′-GGCTAGCATGCGAAGTGAG-3′，Hmox-R 5′-AGACTCCCTTAAGGGTTC-3′，Hmox-1非特异性-R 5-AAAGGAGTCAGGGAG-3′。
ChIP-seq（编码）
这些数据由耶鲁大学的迈克尔·斯奈德、马克·格斯坦和谢尔曼·魏斯曼实验室生成并分析；加州大学戴维斯分校的Peggy Farnham；和哈佛大学的Kevin Struhl使用K562细胞系。使用以下抗体：c-Jun（sc-1694，圣克鲁斯）、c-Myc（sc-764，圣克鲁兹）。可以在以下位置访问数据http://genome.ucsc.edu/ENCODE/
人胰腺癌细胞培养
MiaPaCa2和Hs766T细胞来自CRUK克莱尔霍尔实验室。两株系均在DMEM+10%FBS中生长。用DharmaFECT 1进行siRNA转染。
免疫组织化学
在三级肝胆转诊中心（Addenbrookes Teaching Hospitals NHS Trust，Cambridge，UK）接受胰腺手术的患者捐赠人体组织用于研究目的。当地研究和道德委员会授予了道德批准（LREC编号：08/H0306/32）。将石蜡包埋的小鼠和人类标本脱蜡并重新水化，然后在煮沸的柠檬酸盐缓冲液中提取抗原。使用了以下主要抗体：Ki-67（SP-6，Neocarkers）、Nqo1（Abcam，Sigma-Aldrich）、8-oxo-dGuo（[N45.1]，Abcam）、γ-H2AX（Millipore）、Cleaved caspase 3（Cell Signaling）、抗丙二醛（Abcam）。除8-oxo-dGuo外，所有IHC均使用基于HRP的检测试剂，8-oxo-d Guo使用基于AP的试剂。8-oxo-dGuo特异性通过在37°C下用1U/ml DNA酶处理切片1小时来验证。为了定量8-oxo-dGuo，使用Adobe Photoshop CS计算平均信号强度。将免疫组织化学图像转换为灰度图像，进行倒置和平均像素8-oxo-dGuo强度分析。对于小鼠Nqo1 IHC，使用了Sigma-Aldrich抗Nqol抗体，并确认染色模式可与Abcam抗体重复（未显示）。Abcam Nqo1抗体用于人体组织。
荧光素酶检测
LSL-K-Ras公司G12D系列和Nrf2-/-; K-Ras公司G12D系列将MEF以5×10的密度电镀在12孔培养皿中4细胞/孔，感染了Cignal Lenti ARE Reporter（Qiagen），MOI为10。6小时后，细胞以1:2的比例分裂，第二天用Ad-mock和Ad-cre感染。4天后，将细胞在70%的汇合处进行电镀，并使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）和光度计分析荧光素酶活性。对裂解液进行重复分析，并将缺乏ARE报告者的细胞作为对照。
线粒体活性氧
细胞在含有5uM MitoSOX或100nM Mitotracker Green FM（均为Invitrogen）的无血清和苯酚红DMEM中培养30分钟，并通过流式细胞术进行分析。线粒体ROS被标绘为线粒体ROS信号（MitoSOX）归一化为线粒体质量（Mitotracker Green FM）。
氮氧化物活性测定
细胞用冷PBS洗涤两次，在PBS中刮取，然后离心得到细胞颗粒。将颗粒在PBS+1mM MgCl2+1mM EGTA+蛋白酶抑制剂中均匀化，并将100ul匀浆添加到100ul的2×反应缓冲液中（PBS+lmM MgCl2+1mM EGTA+300mM蔗糖+10uM亮氨酸[Sigma-Aldrich]+200uM NADPH[Sigma Aldrich]]），每分钟用光度计测量相对光单位，持续10分钟。通过添加特定的氮氧化物抑制剂二苯碘铵（10uM，Sigma-Aldrich）来确认特异性。图表显示了线性范围内（2-3分钟）的一个代表性测量值，并以每μg蛋白质的相对光单位表示。
Nrf2稳定性
将MEFs用25ug/ml环己酰亚胺（Acros Organics）处理指定的时间点，并通过SDS-PAGE提取和分离总细胞裂解物。将凝胶转移到硝化纤维素（Biorad）上，用抗-Nrf2抗体探测膜，按所述纯化亲和力。28
增殖和肿瘤的量化
通过对大于50个细胞的至少5个区域进行计数，获得增殖值。对于PanIN研究，分析中只包括PanIN-1a中包含的细胞（周围的基质细胞、腺泡细胞或免疫细胞均被排除在外）。增殖以百分比表示，因此代表Ki-67阳性PanIN-1a细胞/总PanIN-1b细胞的数量。为了量化肺部疾病负担，使用图像J计算肺部总面积和肿瘤面积29疾病负担以总面积的百分比表示。对于单个肿瘤的特征，数据表示为肿瘤/肺面积。为了定量每只小鼠的PanIN，石蜡包埋的胰腺以100微米的间隔进行切片，并对单个PanIN进行计数。
Ras-GTP活性分析
Ras-GTP水平根据制造商的说明确定（Millipore）。膜上还印有抗Rac抗体（Millipore）作为负荷控制。
试剂
4-羟基-三甲氧基苯（4-OHT）从Sigma-Aldrich获得。AZD6244（ARRY-142886）来自Symansis。
衰老相关b-半乳糖苷酶染色
将细胞固定在PBS中2%甲醛/0.2%戊二醛中5分钟，并在37°C的染色溶液（柠檬酸/磷酸盐缓冲液pH 6.0、150mM NaCl、2mM MgCl、5mM铁氰化钾、5mM亚铁氰化氢钾和1mg/ml X-gal）中染色过夜。计算至少50个细胞的字段，一式三份。对于组织，将含有PanIN的小鼠新鲜胰腺切成小块（约1-3mm立方块），在冰上PBS中的4%PFA中固定2小时，并在37°C的染色溶液中培养过夜。然后将碎片在福尔马林中固定过夜，然后快速处理并嵌入石蜡中。切片的厚度为10微米，脱蜡后尽量避免接触二甲苯，并用核固红进行复染。每只小鼠计数五个区域，每个区域至少有50个细胞。
患者样本中KEAP1和NRF2的测序
如前所述，产生了富含异种移植的胰腺癌30细胞系来自ATCC（Aspc-1、CAPAN1、CFPAC1、Hs766T、MiaPACA2、Panc-1和Su86.86）或其他来源。PK8和PK9由A.Horii博士提供31PL11、PL19、PL23（由E.Jaffee博士提供）和XPA1（由A.Maitra博士提供）也被使用。29例家族性胰腺癌患者永生化外周血淋巴细胞的基因组DNA来自国家家族性胰腺肿瘤登记处（NFPTR）。约翰霍普金斯医院的机构审查委员会批准了从切除标本或NFPTR中获取人体组织。外显子2-6的编码序列（包括KEAP1的整个编码序列）和NRF2的外显子2（官方当前基因名称，NFE2L2）（包括KEAP 1结合域）是使用每个外显子两侧的内含子引物从基因组DNA中扩增出来的。底漆是使用Primer3在线软件设计的(http://frodo.wi.mit.edu/primer3). 使用嵌套引物和ABI Prism模型3700 Applied Biosystems，Foster City，CA）对PCR-扩增产物进行测序。序列分析采用Sequencer™4.8版软件（基因编码，密歇根州安阿伯）。通过独立PCR扩增和扩增产物的反向测序验证已识别的变体。每种变体的体细胞或生殖系性质是通过将其各自的序列与来自相同患者的匹配正常DNA进行比较来确定的。使用了以下引物：
| 位置 | 福沃德 | 反向 |
|---|
| Keap1外显子2 | ATCAGGTCGGGGAAGTTTG公司 | agcccagaaccccttttc |
| Keap1外显子3 | GTCAGCGCAGTGATAAGTAC公司 | TGACAGTCCCCCTAAGCATTTC公司 |
| Keap1外显子4 | TCCACGAAGGTCAGCTAATAATG公司 | TCCAGGGCTTCTTGTGGTTAC公司 |
| Keap1外显子5 | TCTCTCCCCGCTTCATTTC | GCAAAAGCAGTCCACAAAAG |
| Keap1外显子6 | GACCATCCTTCTGTTCTTC公司 | GCTTTGGACTTCTTTTGAGATG公司 |
| Nrf2外显子2 | CCACACTCAACAGTGGCATA公司 | AAGGCAAGCATGTGAACTCAA公司 |
统计分析
所有数据均表示为平均值±SEM。结果是三个或更多单独实验的代表性示例。采用Mann-Whitney U检验或Student T检验进行统计分析（*p<0.05；**p<0.01；**p<0.001；ns，不显著）。两种分析都使用了图形板棱镜。
转染
用Fugene 6（Roche）或Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行DNA转染。用ON-TARGET进行siRNA转染加根据制造商的说明，使用DharmaFECT 1试剂（均为Dharmacon）的SMARTpool siRNA。使用了以下siRNA序列：
| 基因 | 目标序列（感测链），共4个 |
|---|
| 非目标 | 5′-UGUUUACAUGUCGACAA-3′；5′-UGUUUACAUGUGUGA-3′ |
| 5′-UGUUUACAUGUUUCUGA-3′；5′-UGUUUACAUGUUUCCUA-3′ |
| 麋鹿1 | 5′-GGAAUGAUACAUGCGCUC-3′；5′-CCAAGUGGCUUAGCACGA-3′ |
| 5′-GGGAUGGGGUGGAUUCAA-3′；5′-ACCAAAGGGUGCAGGAAUG-3′ |
| 第1帧 | 5′-GAACCGGAGCACUGCAUA-3′；5′-AGGCGGACCGACAAAUU-3′ |
| 5′-gaaccuugccuccgccuc-3′；5′-GCUAGUGCAGAAACCGAA-3′ |
| 六月 | 5′-CAAGAACGUGACCGACGA-3′；5′-GCAGAGAGGAAGCAGCAUGA-3′ |
| 5′-GAACGACUUCUACGACG-3′；5′-GAACAGGGGGCACAGCUA-3′ |
| 6月 | 5′-GAACACGUUGGUGGUCGU-3′；5′-AGCGCAAGCUGGAGCGUAU-3′ |
| 5′-卡考乌古瓜-3′；5′-AAGUCUUCGUUACGCCAAA-3′ |
| 基亚1 | 5′-GCGGCCAAUGUUGACACGGA-3′；5′-GAUAGCCAGAGGGGA-3′ |
| 5′-GGAUGAUCACACCGAUGAA-3′；5′-GUUCGAGCCUGCAGCGACU-3′ |
| K-Ras（鼠标） | 5′-GAACAGUAGACACAAACA-3′；5′-AGCAAGGAGUUACGGGAUU-3′ |
| 5′-GGUUGGAGCUGGGGCGUA-3′；5′-GGUGUACAGUUGUGAAU-3′ |
| K-Ras（人类） | 5′-GGAGGCUUUCUUUGUGUA-3′；5′-UCAAAAGACAAAGUGUGUAA-3′ |
| 5′-GAAGUUAUGGAAUUCCUUU-3′；5′-GAGUAACACGAUGCGUAU-3′ |
| Myc公司 | 5′-gaaacgagagaacagug-3′；5′-CCACUCACACACACAACUA-3′ |
| 5′-GGACACACACACGUCUGGA-3′；5′-UCGAAAACUCUGGGUGCAUAA-3′ |
| 编号2 | （1） 5′-ACUCAAAAUCCCACCUAAA-3′；（2） 5′-UGGAGUAAGUCGAGAAGUG-3′ |
| （3） 5′-CAUGUUACGUGAGGAGGAU-3′（4）5′-GGACAGCAAUUACCAUUU-3′ |
