糖尿病。2012年8月；61(8): 2004–2015.
ChREBP介导葡萄糖刺激的胰腺β细胞增殖
,1,2 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,三 ,三 ,1 ,1 ,1 ,1和1
Mallikarjuna R.Metukuri公司
1宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学内分泌和代谢科医学系
2北卡罗来纳州三角研究公园国家环境健康科学研究所信号转导实验室
张培力（Pili Zhang）
1宾夕法尼亚州匹兹堡匹兹堡大学内分泌与代谢系医学系
马赫什·K·巴桑塔尼
1宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学内分泌和代谢科医学系
康妮·琴
1宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学内分泌和代谢科医学系
雷切尔·斯塔马特里斯
1宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学内分泌和代谢科医学系
劳拉·阿隆索
1宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学内分泌和代谢科医学系
卡伦·塔卡内
1宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学内分泌和代谢科医学系
罗伯托·格拉米诺利
三宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学病理学系
斯蒂芬·斯特罗姆
三宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学病理学系
罗伯特·奥多尔蒂
1宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学内分泌和代谢科医学系
安德鲁·斯图尔特
1宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学内分泌和代谢科医学系
Rupangi C.Vasavada公司
1宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学内分泌和代谢科医学系
阿道夫·加西亚-奥卡尼亚
1宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学内分泌和代谢科医学系
唐纳德·斯科特
1宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学内分泌和代谢科医学系
1宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学内分泌和代谢科医学系
2北卡罗来纳州三角研究公园国家环境健康科学研究所信号转导实验室
三宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学病理学系
收到日期：2011年6月10日；2012年3月10日验收。
- 补充资料
补充数据
GUID:762DAE8D-F54A-45D7-BC30-B760CB8A2F96
GUID:EAA4F7FC-5AC3-4462-803E-D527E00701AF
摘要
葡萄糖刺激啮齿动物和人类β细胞复制，但细胞内信号机制尚不清楚。碳水化合物反应元件结合蛋白（ChREBP）是一种在胰腺β细胞中功能未知的脂肪生成葡萄糖敏感转录因子。我们测试了ChREBP是葡萄糖刺激的β细胞增殖所必需的假设。使用定量RT-PCR（qRT-PCR）、免疫印迹和免疫组织化学方法测定肝脏和β细胞中ChREBP的相对表达。使用小干扰RNA和ChREBP基因缺失以及腺病毒在啮齿动物和人类β细胞中过度表达ChREBP进行功能丧失和获得研究。通过5-溴-2′-脱氧尿苷掺入测定增殖[三H] 胸腺嘧啶掺入和荧光激活细胞分选分析。此外，通过qRT-PCR和免疫印迹法检测细胞周期调控基因的表达。ChREBP在小鼠胰腺、大鼠和人类胰岛中的表达与肝脏相当。消耗ChREBP降低了从ChREBP分离的β细胞中葡萄糖刺激的增殖−/−小鼠、INS-1衍生的832/13细胞、原代大鼠和人类β细胞。此外，ChREBP的耗竭降低了葡萄糖刺激的细胞周期加速器的表达。ChREBP的过度表达放大了大鼠和人β细胞中葡萄糖刺激的增殖，同时细胞周期蛋白基因表达增加。总之，ChREBP介导葡萄糖刺激的胰腺β细胞增殖。
β-细胞具有非凡的内在能力，通过改变β-细胞质量来检测和响应代谢需求的变化：通过增殖和/或新生来扩张，通过细胞死亡来收缩(1). 为了增殖，β细胞必须通过严格的细胞周期检查点，并且在鉴定β细胞中细胞周期的控制元件方面取得了很大进展(2). 例如，现在人们认识到G组分甚至单个组分的过度表达0/G公司1-S期细胞周期调节蛋白，如D细胞周期蛋白或其cdk伙伴，足以驱动β细胞复制(三–5). 去除或过度表达细胞周期蛋白或cdk的敲除和转基因小鼠模型普遍证实了它们在β细胞增殖和葡萄糖稳态中的关键作用(2). 此外，通过对促进β细胞增殖的各种生理过程的解剖，鉴定出了许多天然有丝分裂原，包括胰高血糖素样肽1、肝生长因子、甲状旁腺激素相关蛋白、催乳素，以及目前研究的重点葡萄糖(6–9). 尚待阐明的是天然有丝分裂信号与细胞周期调控机制相互作用以促进β细胞增殖的详细分子机制。
葡萄糖在体外和体内的各种模型系统中增加β细胞增殖。在体外，葡萄糖刺激胎儿和成年大鼠胰岛、小鼠胰岛和几种啮齿动物胰岛素瘤β细胞系中的β细胞增殖(三,7,10). 在体内，葡萄糖可促进多种模型中的β细胞增殖，包括高蔗糖饮食、低血糖恢复和部分胰腺切除术(11–14). 阿隆索等人(15)结果表明，在小鼠体内静脉注射50%葡萄糖4天，可适度增加血糖浓度，并通过5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）掺入测定，导致β细胞增殖显著增加，这与早期的啮齿动物输注研究一致(16,17). 此外，将人类胰岛移植到免疫受损、糖尿病小鼠的肾包膜下，显示出与循环葡萄糖浓度升高相关的BrdU掺入增加(18). 最近，葡萄糖被确定为小鼠β细胞增殖的强大系统信号，其中增殖与β细胞糖酵解通量成正比(9). 葡萄糖代谢通量如何转化为细胞周期的进展尚不清楚。
碳水化合物响应元件结合蛋白（ChREBP；官方名称：Mlxipl）已成为典型的葡萄糖传感转录因子(19). ChREBP最初从肝组织克隆，以葡萄糖依赖的方式上调参与脂肪酸合成的基因，并在几个代谢相关组织中表达，包括肝细胞、脂肪细胞和胰腺β细胞(19). 值得注意的是，尽管ChREBP在肝脏中的作用明显是成脂的，但其在胰腺β细胞中的生理重要性尚不清楚。鉴于ChREBP调节糖脂代谢，最近发现ChREBP对癌细胞增殖至关重要，这也许并不奇怪(20). 在转化细胞中，ChREBP促进葡萄糖流量增加、糖酵解过度葡萄糖完全氧化、脂肪生成以及细胞分裂所需的还原当量和其他合成代谢中间产物的产生。
在当前研究中，我们测定了人和啮齿动物β细胞中ChREBP的相对丰度，并测定了ChREBP耗竭和过度表达对葡萄糖刺激的β细胞增殖的影响。我们发现啮齿类动物和人类β细胞中ChREBP的丰度与肝脏相当，ChREBP的缺失阻断了INS-1衍生的832/13大鼠胰岛素瘤细胞、分离的大鼠β细胞和从ChREBP分离的β细胞中葡萄糖刺激的增殖−/−小鼠，更重要的是，在分离的人类β细胞中。此外，ChREBP的缺失减弱了几种细胞周期调节因子中葡萄糖依赖性的增加，包括细胞周期蛋白D2、细胞周期蛋白A、细胞周期素E、cdk4和cdk6。此外，ChREBP的腺病毒过表达增强了INS-1衍生的832/13细胞的葡萄糖刺激增殖，同时细胞周期蛋白A和E的表达也随之增加，随着细胞周期加速基因的增加和细胞周期抑制基因的减少。我们得出结论，ChREBP是葡萄糖刺激的β细胞增殖的重要组成部分。
研究设计和方法
细胞培养和腺病毒。
INS-1衍生的832/13大鼠胰岛素瘤细胞(21)由Christopher Newgard博士（北卡罗来纳州达勒姆杜克大学Sarah W.Stedman营养与代谢中心）提供。如前所述对细胞进行维护(22). 野生型ChREBP腺病毒是霍华德·托尔（明尼苏达大学[23)])和对照绿色荧光蛋白（GFP）腺病毒如前所述(24). 将腺病毒以200倍的感染率添加到细胞中，感染率由260 nm处的光密度和斑块分析测定。
小干扰RNA双链介导的基因抑制。
在Dharmafect Reagent 1（Dharmacon）存在下，将SmartPool小干扰RNA（siRNA）双链体（Dharmacon，Lafeyette，CO）转染到INS-1衍生的细胞系中48小时。双联体靶向大鼠ChREBP cDNA序列（分类号L-092970）的19至21 bp区域。没有已知序列同源性或生物效应（siControl）的双工体池用作对照。细胞在用于INS-1细胞的RPMI 1640培养基中培养48小时(21)加入5%FCS，然后在低葡萄糖（3 mmol/L）中放置6小时。然后添加葡萄糖，以将高糖组的最终葡萄糖浓度调整为15 mmol/L葡萄糖，并将细胞额外培养18 h。对于Accell siRNA处理，使用含有2%FCS、5.5 mmol/L-葡萄糖的Accell培养基（Dharmacon）处理分散的大鼠或人胰岛细胞，对照组或种特异性ChREBP Accell siRNA（1μmol/L）培养6小时，然后向高糖组添加葡萄糖，将浓度调节至20 mmol/L。细胞共培养72小时。最后36小时，大鼠胰岛和人类胰岛制剂分别添加BrdU。
RNA分离和RT-PCR。
如前所述，分离RNA并进行定量RT-PCR(25). 引物序列可以在补充表1.
免疫印迹分析。
如前所述进行免疫印迹(25). 使用的抗体包括：ChREBP（NB400–136；Novus Biologicals，Littleton，CO）、cyclin D2（Ab3085；1:1000；Abcam，Cambridge，MA）、cybrin A2（c-4710；Sigma，St.Louis，MO）、cylicn E1（SC-481；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）、cdk-2（SC-163；Santa Cruz）、cdk4（Ab3112；Abcam）、cdk6（Ab3126；Abca姆）和β-肌动蛋白（A2228；Sigma-）所有一级抗体均以1:1000的稀释度使用，但细胞周期蛋白E除外，其使用浓度为1:500。
啮齿动物胰岛的分离。
如前所述，从8至10周龄的Wistar大鼠（马萨诸塞州威明顿市Charles River Laboratories）中分离出胰岛(25). 在进一步实验之前，将分离的大鼠胰岛在添加10%FCS、5.5 mmol/L葡萄糖和青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中培养24小时。如前所述，胰岛通过胰蛋白酶分解而分散(26). 从8至10周龄C57Bl/6野生型或ChREBP中分离出小鼠胰岛−/−老鼠(27)，购自日本宇宙航空研究开发机构实验室（库存号010537)，并按照前面所述进行培养(28). 这些动物研究是按照匹兹堡大学动物护理和使用委员会的要求进行的，并得到了该委员会的批准。
人类胰岛。
通过美国国立卫生研究院和青少年糖尿病研究基金会（JDRF）支持的综合胰岛分布计划获得人类尸体胰岛(网址：http://www.iidp.coh.org). 供体的平均年龄为44岁，制剂的纯度为88%，存活率为95%。如前所述，通过胰蛋白酶作用培养和分散胰岛(4).
人类肝脏。
从五名正常人肝供体中分离出肝细胞。人体肝组织是根据机构审查委员会批准的方案采购的，并得到肝组织采购和细胞分配系统（宾夕法尼亚州匹兹堡）的支持。采用胶原酶三步灌注技术制备肝细胞(29). 所有制剂的活性均大于75%。如前所述，分离蛋白质和RNA用于Western blot和RT-PCR分析。
小鼠组织化学。
取下小鼠胰腺，在Bouin溶液中固定过夜，并用石蜡包埋。将切片放在玻璃载玻片上，用二甲苯脱蜡，并使用抗胰岛素抗体（Invitrogen，Carlsbad，CA）以1:100的稀释度、抗ChREBP抗体以1:1000的稀释度（Novus）和抗BrdU抗体（GE Healthcare，Piscataway，NJ）以1:500的稀释度进行免疫荧光。使用Alexa Fluor 488–共轭二级抗体（1:250；Invitrogen）实现染色可视化。细胞核用DAPI染色，并如上所述进行成像。
细胞增殖和细胞周期分析。
[三H] 胸腺嘧啶掺入测量基本上按照所述进行(7). 简言之，INS-1衍生的832/13细胞在含有11 mmol/L葡萄糖并补充10%FBS的RPMI 1640培养基中培养。24小时后，用含有2 mmol/L葡萄糖的培养基稀释细胞血清。额外24小时后，用不含FBS的新鲜培养基处理细胞，FBS中含有2或20 mmol/L葡萄糖和[三H] 胸苷（0.5μCi/孔；Amersham Pharmacia Biotech）。[三H] 4小时后停止胸腺嘧啶掺入；放射性被校正为蛋白质水平。结果表示为对照细胞中每分钟每微克蛋白质的计数百分比（100%）。为了分析细胞周期进展，将INS-1衍生的832/13细胞在4°C下用70%乙醇固定过夜。在PBS中用100单位/mL RNA酶A（Sigma）处理固定细胞，并在室温下用50μg/mL碘化丙啶（Sigma-）染色30分钟。使用BD-LSR II流式细胞仪通过流式细胞术测定10000个细胞的细胞周期相分布（Becton Dickinson Biosciences，San Jose，CA）。如前所述，使用Modfit LT 3.0软件（Verity software House，Topsham，ME）进行数据分析，包括闸门的确定(30). 根据Cozar-Castellano等人的描述，测定了BrdU在分离的大鼠胰岛细胞中的掺入(三). 所有图像均使用匹兹堡大学生物成像中心核心设施的奥林巴斯Provis I荧光显微镜或共焦奥林巴斯Fluoview 1000获得。
结果
ChREBP在胰腺β细胞和肝脏中的表达水平相似。
ChREBP主要在肝细胞中进行研究，它调节参与脂肪生成的基因的表达(19). 虽然已知ChREBP在胰腺β细胞中表达，但与肝脏相比，其相对丰度尚不清楚(25,31). 在，我们发现ChREBP mRNA在大鼠胰岛和大鼠INS-1衍生的832/13细胞中的表达水平与大鼠原代肝细胞中的水平相当(,左边). 此外，在原代人肝细胞和人胰岛中的ChREBP mRNA表达也发现了类似的丰度(,正确的). 在蛋白质水平上，大鼠肝脏和肝细胞制剂中ChREBP的表达显著高于分离的大鼠胰岛样品（β-肌动蛋白、，P（P）= 0.02,n个= 3;,顶部). 相比之下，ChREBP蛋白在人类胰岛和人类肝细胞中的表达相似（β-actin标准化后，密度单位为1.2±0.4 vs.0.9±0.1，P（P）= 0.44,n个= 3;,底部). 免疫荧光法检测大鼠和人胰岛分离的胰岛素阳性细胞中ChREBP蛋白的表达(). 此外，小鼠胰腺切片的免疫染色显示，ChREBP在胰岛和周围腺泡组织中均有强烈表达。总之，ChREBP在啮齿动物和人类β细胞中的表达水平与肝脏中ChREBP的丰度相似。
啮齿类动物和人类β细胞中ChREBP的丰度与肝脏相当。A类：大鼠或人类肝脏或胰腺β细胞的相对mRNA丰度，使用定量RT-PCR和物种特异性引物。结果归一化为β-肌动蛋白，是三个独立实验±SEM的平均值。B类：来自肝脏、原代肝细胞或大鼠或人类分离胰岛的全蛋白提取物的免疫印迹中ChREBP蛋白的相对丰度。β-肌动蛋白被用作加载控制，其结果代表了三个独立的实验。C类：在分散的大鼠和人胰岛细胞中使用针对ChREBP的种特异性抗体进行免疫荧光，在小鼠胰腺切片中使用针对ChREBP的抗体（红色）、胰岛素（绿色）和核染色（DAPI）进行免疫荧光。最右边的柱证实红色的ChREBP依赖荧光不是二级抗体非特异性结合的结果。显示的结果代表了三个独立的实验。（该图的高质量数字表示可在在线期刊上获得。）
ChREBP是葡萄糖刺激的啮齿动物β细胞增殖所必需的。
ChREBP在转化细胞的增殖中起着重要作用，它重定向中间代谢以提供分子构建块并减少细胞分裂所需的当量(20). 因为ChREBP富含β细胞()葡萄糖是β细胞增殖的天然和强有力的系统驱动因素(9)，我们测试了在分离的大鼠β细胞中，ChREBP是否是葡萄糖刺激增殖所必需的。脂结合siRNA（Accell siRNA）(32)用于降低分离的分散的大鼠胰岛中ChREBP的表达。与对照siRNA相比，靶向ChREBP的siRNA处理使ChREBP mRNA减少60-70%，分散的分离大鼠胰岛细胞中的ChREBP蛋白轻度但可重复减少(). 耗尽ChREBP可完全阻断葡萄糖刺激的大鼠β细胞增殖(). 为了证实ChREBP在葡萄糖刺激的β细胞增殖中的作用，从对照组（C57BL/6）或ChREBP中分离胰岛−/−基因背景相同的小鼠。如所示虽然对照组β细胞显示出强大的葡萄糖反应，如BrdU掺入法所测，但从ChREBP分离的β细胞−/−小鼠对葡萄糖没有反应。
ChREBP是葡萄糖刺激大鼠β细胞增殖所必需的。通过胰蛋白酶分离和分散大鼠胰岛，并在5.5 mmol/L葡萄糖中用对照或ChREBP特异性Accell siRNA处理72 h。分离RNA并用ChREBP和β-actin特异性引物进行定量RT-PCR(A类)或蛋白质被分离出来，并用针对ChREBP或β-肌动蛋白的抗体进行免疫印迹(B类). 中的结果A类是平均值±SE；n个= 3; *P（P）< 0.05; 中的个结果B类是两个具有相同结果的独立实验的代表。C类：用Accell siRNA处理的分散的大鼠胰岛细胞在盖玻片上在5.5或20 mmol/L葡萄糖中培养72 h。最后36 h添加BrdU。细胞固定并用抗胰岛素（绿色）和BrdU（红色）抗体染色，细胞核用DAPI（蓝色）染色。D类：所示为四个独立实验中BrdU阳性：胰岛素阳性细胞百分比的平均值±SE，以盲法计算，并归一化为低血糖对照（平均值=0.7%）(*P（P）< 0.05). 每个治疗组至少计数1300个胰岛素阳性细胞。E类：来自对照组（C57BL/6J）或ChREBP的分散胰岛−/−将具有相同遗传背景的小鼠在5.5或20 mmol/L葡萄糖中培养72 h，最后48 h添加BrdU。细胞固定并用抗胰岛素（绿色）和BrdU（红色）抗体染色，细胞核用DAPI（蓝色）染色。F类：结果是四个对照组和四个ChREBP的BrdU阳性：胰岛素阳性细胞百分比的平均值±SE，以盲法计算，并归一化为低血糖对照组（平均值=0.3%）−/−动物(*P（P）< 0.05). 每个治疗组的平均胰岛素阳性细胞数为1988±265个。野生型；n.s.，不重要；Con，控制；siCon、siControl。（该图的高质量数字表示可在在线期刊上获得。）
为了探索ChREBP促进葡萄糖刺激的β细胞增殖的细胞机制，我们测试了在INS-1衍生的832/13细胞（亲代INS-1细胞的高度葡萄糖反应克隆）中，ChREBP是否需要葡萄糖刺激的增殖[21]). 如所示针对ChREBP的siRNA双链体显著降低了ChREBP mRNA（65%）和蛋白质（70%）水平。如前所述，ChREBP表达的减少就足够了(33)抑制标准葡萄糖应答基因Pklr（肝型丙酮酸激酶；). 值得注意的是，这个动作完全抑制了葡萄糖刺激[三H] 胸腺嘧啶核苷在832/13细胞中的掺入(). 荧光激活细胞分选仪分析证实了这些结果。siRNA对ChREBP的消耗降低了S和G细胞的百分比2/葡萄糖刺激后细胞周期的M期，同时增加G细胞的相同相对百分比0/G公司1(). 此外，子G没有增加0细胞比例，表明ChREBP的耗竭并不影响细胞死亡或凋亡。因此，ChREBP的缺失足以阻断葡萄糖介导的基因表达和葡萄糖刺激的β细胞增殖。
INS-1衍生832/13细胞中ChREBP的耗竭抑制葡萄糖刺激的增殖。在11 mmol/L葡萄糖中用ChREBP特异性或对照siRNA转染INS-1衍生的832/13细胞。48h后，将培养基切换至3mmol/L葡萄糖培养6h，然后在3mmol/L或15mmol/L葡萄糖中再培养16h。提取总RNA或蛋白质，并在归一化为β-actin后通过定量RT-PCR测定ChREBP的相对水平(A类)或通过与β-肌动蛋白相关的免疫印迹(B类)分别是。Pklr公司mRNA表达在C类此外，增殖率由[三H] 胸腺嘧啶掺入(D类). 结果表示为平均值±SE(n个=3至5*P（P）< 0.05; 不另作说明，不重要）。
表1
用针对ChREBP和3或15 mmol/L葡萄糖的混合siRNA处理INS-1衍生的832/13细胞后的荧光激活细胞分选仪分析
ChREBP是葡萄糖介导的细胞周期调节因子诱导所必需的。
几个G的丰度1-测定S调节蛋白以确定ChREBP影响INS-1衍生832/13细胞增殖的机制。如所示在存在ChREBP的情况下，葡萄糖刺激细胞周期蛋白D2（ccnd2）、细胞周期蛋白A2（ccna2）和细胞周期蛋白E1（ccne1）的mRNA，但在耗尽ChREBP后没有。此外，细胞周期蛋白D1（ccnd1）和cdk2的mRNA显示出依赖于ChREBP的葡萄糖刺激无显著趋势，而Cdks 1、4和6的mRNA丰度不受葡萄糖影响。然而，缺乏ChREBP显著降低了15 mmol/L葡萄糖中cdk4 mRNA的丰度(). 在蛋白质水平上，葡萄糖显著诱导细胞周期蛋白D2、A和E以及cdk4和cdk6(). 此外，ChREBP是葡萄糖介导的cdk4、cdk6和细胞周期蛋白A和E诱导所必需的，而ChREBP的缺失降低了细胞周期蛋白D2的基础和葡萄糖刺激的表达。因此，我们得出结论，ChREBP是葡萄糖介导的细胞周期调节器调节所必需的，最有可能在转录和转录后水平，并最终用于葡萄糖刺激的β细胞增殖。
ChREBP耗竭降低细胞周期调节器的mRNA表达。将INS-1衍生的832/13细胞转染ChREBP特异性或干扰siRNAs 48小时。细胞在3mmol/L葡萄糖中预处理6h，然后在3mmol或15mmol/L葡萄糖中培养16h。通过定量RT-PCR测定指示基因的相对mRNA水平，并将其归一化为肌动蛋白。所示为平均值±SE(n个=3至4*P（P）< 0.05; 不另作说明，不重要）。
ChREBP耗竭导致细胞周期调节器蛋白表达降低。将INS-1衍生的832/13细胞转染ChREBP特异性或干扰siRNAs 48小时。细胞在3 mmol/L葡萄糖中预处理6 h，然后在3或15 mmol/L.葡萄糖中培养16 h。免疫印迹分析用于确定指示的细胞周期调节器的相对蛋白表达。所示为具有代表性的细胞周期素放射自显影图(A类)和细胞周期蛋白依赖性激酶(B类).C类–H（H）：免疫印迹密度测定结果，如A类和B类表示为三到四个单独实验的平均值（±SE*P（P）< 0.05; #P（P）与3 mmol/L葡萄糖对照组相比，<0.05；不另作说明，不重要）。
ChREBP的过度表达增强了葡萄糖刺激的β细胞增殖。
我们使用腺病毒载体测试了ChREBP的过度表达是否影响葡萄糖刺激的β细胞增殖。如所示用表达ChREBP的腺病毒治疗INS-1衍生的832/13细胞(34)免疫印迹法测定增加ChREBP的表达。ChREBP丰度的增加导致这些细胞中的基础（3mmol/L葡萄糖）和葡萄糖刺激（15mmol/L葡萄糖）增殖显著增加，这由[三H] 胸腺嘧啶掺入(). 此外，当ChREBP在分散的大鼠胰岛细胞中过度表达时()BrdU掺入β细胞后，葡萄糖刺激的增殖显著增强(). 虽然对基础增殖（5.5 mmol/L葡萄糖）没有影响，但ChREBP过度表达导致葡萄糖刺激的β细胞增殖（20 mmol/L-葡萄糖）扩增三倍。总之，ChREBP是葡萄糖刺激大鼠胰岛β细胞增殖的强大介质。
ChREBP的过度表达可增强葡萄糖刺激的β细胞增殖。在INS-1衍生的832/13细胞中转导表达ChREBP的腺病毒(A类)或隔离的大鼠胰岛(C类)通过免疫印迹法测定，导致ChREBP的稳健表达。图中所示为代表两个具有相同结果的独立实验的斑点。B类：用表达ChREBP或GFP的腺病毒处理INS-1衍生的832/13细胞2小时，并在11 mmol/L葡萄糖中额外培养22小时。然后将细胞在3 mmol/L葡萄糖中预处理6 h，在3或15 mmol/L-葡萄糖中培养16 h后，相对量[三H] 测定胸腺嘧啶核苷掺入。结果表示为平均值±SE(n个=3至5*P（P）< 0.05).C类–E类：用表达ChREBP或GFP的腺病毒转导分散的大鼠胰岛细胞2 h。细胞在含有5.5 mmol/L葡萄糖的培养基中的盖玻片上培养24 h，此时将高糖组调整为20 mmol/L-葡萄糖，并将细胞额外培养60 h。D类：在最后36 h内加入BrdU，固定细胞并染色以检测胰岛素（绿色）或BrdU（红色）和DAPI（蓝色）。E类：以盲法计数细胞，结果以胰岛素：BrdU阳性细胞的百分比表示（±SE；n个= 4; *P（P）< 0.05). 每个治疗组至少计数1500个细胞。siCon、siControl。（该图的高质量数字表示可在在线期刊上获得。）
ChREBP的过度表达改变了细胞周期调节基因的表达。
在，我们确定了ChREBP过度表达对细胞周期控制基因丰度的影响和用腺病毒处理INS-1衍生的832/13细胞时，培养条件与用脂质结合的Accell siRNA（使用专用培养基；参见研究设计和方法). 更具体地说，在和在对照条件下，葡萄糖导致细胞周期蛋白D2、A和E发生更高且显著的变化。相比之下，在在对照腺病毒治疗后，细胞周期蛋白D2显著增加15 mmol/L葡萄糖()，但细胞周期蛋白A和E没有显著变化()或cdk蛋白(). 然而，用表达ChREBP的腺病毒治疗后，葡萄糖刺激的细胞周期蛋白a和E的表达显著增加()与ChREBP过度表达和葡萄糖治疗后增殖增加的模式相似，如ChREBP过度表达后，细胞周期蛋白D2显著增加15 mmol/L葡萄糖，但与高糖下的对照水平无差异(). 因为细胞周期蛋白A或E的过度表达独立地增加了β细胞的增殖(三,35–37)，很可能ChREBP介导的β细胞增殖扩增至少部分是葡萄糖刺激的细胞周期蛋白A和E增加的结果。为了证实这些发现，用表达GFP或ChREBP的腺病毒转导分散的大鼠胰岛细胞，并在20 mmol/L葡萄糖中培养72小时。我们发现，在过度表达ChREBP的细胞中，许多细胞周期加速器（包括cyclin A、cdk1、cdk2、cdk6和c-Myc）显著增加，一些细胞周期抑制剂（包括p57、p15、p18和p19）显著减少(补充表2).
过度表达ChREBP会增加细胞周期蛋白A和E的表达。INS-1衍生的832/13与表达GFP或ChREBP的腺病毒转导，如并在3或15mmol/L葡萄糖中培养18小时，并进行免疫印迹处理。A类–F类：所示蛋白质的代表性免疫印迹显示，密度测定结果归一化为上述β-肌动蛋白（平均值±SE；n个=3至4*P（P）< 0.05).
ChREBP调节人β细胞中葡萄糖刺激的β细胞增殖。
由于人类和啮齿动物的β-细胞通常是不同的，为了测试ChREBP的潜在治疗应用，测试大鼠β-细胞中ChREBP耗竭和过度表达的影响是否可以在人类β-细胞内复制是很重要的。针对人类ChREBP的脂质结合siRNA使ChREBP mRNA表达降低约60%(). 我们发现，当这种siRNA被引入分散的人类胰岛细胞时，葡萄糖刺激的人类β细胞增殖被阻止()，与我们在大鼠β细胞中的观察结果一致(). 相反，当ChREBP在带有重组腺病毒的分散的人类胰岛细胞中过度表达时()，由BrdU掺入测定的葡萄糖刺激的增殖增加显著增加()将我们的结果与大鼠β细胞相比较(). 因此，ChREBP是葡萄糖刺激的人类β细胞增殖所必需的，并且在人类β细胞中过度表达时，其作用是放大葡萄糖对β细胞增殖的影响。
ChREBP调节葡萄糖刺激的人β细胞增殖。将分离的人胰岛通过胰蛋白酶化分散，并在5.5 mmol/L葡萄糖中用对照或ChREBP特异性Accell siRNA处理，72 h后，通过定量RT-PCR测定ChREBP mRNA的相对丰度(A类)或蛋白被分离出来，并用针对ChREBP或β-肌动蛋白的抗体进行免疫印迹(B类). 中的结果A类是平均值±SE(n个= 3; *P（P）< 0.05); 中的个结果B类是两个具有相同结果的独立实验的代表。C类：用Accel siRNA处理的分散的人胰岛细胞在盖玻片上在5.5或20mmol/L葡萄糖中培养72小时。最后48小时加入BrdU。细胞固定并用抗胰岛素（绿色）和BrdU（红色）抗体染色，细胞核用DAPI（蓝色）染色（见补充图1). 每个治疗组至少计数1500个细胞。所示为四个独立实验中BrdU阳性：胰岛素阳性细胞百分比的平均值±SE，以盲法计算，并归一化为低血糖对照（平均值=0.3%）(*P（P）< 0.05).D类和E类：用表达ChREBP或GFP的腺病毒转导分散的人胰岛细胞，并按照在除在实验结束前48小时添加BrdU外。D类：如图所示，具有代表性的免疫印迹显示了对ChREBP或β-肌动蛋白特异的抗体。细胞被固定并用胰岛素抗体（绿色）和BrdU抗体（红色）染色，细胞核用DAPI染色（蓝色）（参见补充图1).E类：以盲法计数细胞，结果表示为胰岛素的百分比：BrdU阳性细胞，归一化为低血糖对照，平均为0.3%（平均值±SE；n个= 4; *P（P）< 0.05). 在四个独立的实验中，每个条件下至少有1500个β细胞被计数。控制；不另作说明，不重要。
讨论
1型或2型糖尿病患者将受益于旨在扩大β细胞质量的治疗(1). 因此，了解β细胞是如何增殖的，以及葡萄糖等天然有丝分裂原刺激功能性β细胞扩张的确切细胞和分子机制，是糖尿病研究界的中心焦点。葡萄糖是一种天然的系统有丝分裂信号，通过葡萄糖激酶和糖酵解增加流量，在体内驱动啮齿动物和人类β细胞增殖(9,15,18). 一个重要的知识缺口是对葡萄糖代谢如何与细胞周期机制相互作用以促进β细胞增殖的理解。在当前的研究中，我们发现葡萄糖敏感转录因子ChREBP的丰度与啮齿动物和人类β细胞对葡萄糖的反应增殖能力直接相关。ChREBP的耗竭减弱了葡萄糖刺激的β细胞增殖，ChREBP的过表达放大了葡萄糖对大鼠和人β细胞增殖的影响。此外，我们发现细胞周期调节因子细胞周期蛋白D2、细胞周期蛋白A2和细胞周期蛋白E1在mRNA和蛋白质水平上均以葡萄糖和ChREBP依赖的方式表达增加。此外，当ChREBP过度表达时，细胞周期蛋白A2和E1在高糖中的表达增加，与[三H] 胸腺嘧啶掺入。
这些观察结果为ChREBP对葡萄糖刺激的β细胞增殖的贡献提供了可能的机制解释。细胞周期蛋白D2、E1和A2先前已被证明可驱动β细胞增殖(三,4,36). 细胞周期蛋白D2对出生后的β细胞增殖至关重要(38)，并且它在体内被胰岛中的高血糖上调(15). 细胞周期蛋白E是对Nkx6.1过度表达的反应而诱导的，当过度表达时足以驱动大鼠β细胞的增殖(36). 通过增加cAMP的策略刺激细胞周期蛋白A的表达，从而导致β细胞增殖(37). 细胞周期蛋白A的过度表达也独立地促进β细胞增殖。因此，至少有三种G基因的过度表达1-S调节性细胞周期蛋白足以驱动β细胞增殖。在目前的研究中，我们发现有丝分裂葡萄糖处理以ChREBP依赖的方式增加细胞周期蛋白D2、a和E的表达，将ChREBP与细胞周期调节联系起来。因为ChREBP是一种葡萄糖激活的转录因子，它在葡萄糖的作用下转位到细胞核(19)与DNA结合后进一步依赖葡萄糖进行反式激活(39,40)因此，ChREBP可能直接激活细胞周期蛋白基因。我们之前已经表明，ChREBP招募和活动需要Myc。在这项研究中，ChREBP的过度表达导致高糖中c-Myc mRNA的显著增加，表明这两种转录因子之间存在潜在的反馈回路。由于Myc是细胞周期蛋白的直接靶点，并且我们未能观察到ChREBP与细胞周期蛋白基因调控区域的结合（数据未显示），葡萄糖可能通过包括葡萄糖代谢、ChREBP和Myc的激活、细胞周期蛋白激活、，并在细胞周期中进行。实验正在进行中以验证这一假设。
ChREBP在β细胞中的作用被指定为多种功能，包括促进脂肪生成、促进糖脂毒性和调节缺氧反应(31,41,42). Kaestner实验室最近证实，ChREBP基因是Foxa1和Foxa2的直接靶点，这两种基因对培养β细胞和维持β细胞表型很重要(43). 随着ChREBP在胰岛发育过程中流行的证实，ChREBP被发现是Ngn3阳性胰岛祖细胞中表达最高的转录因子之一(44). 全球ChREBP基因敲除动物的肝脏脂肪生成能力降低，正如一种转录因子在碳水化合物的作用下激活肝糖酵解和脂肪生成基因所预期的那样(27). 此外，面对适度的空腹高血糖，这些动物显示出不适当的低胰岛素浓度。这表明β细胞存在缺陷，表现为β细胞质量减少或β细胞在面对高血糖时充分分泌胰岛素的能力缺陷，尽管对ChREBP中的β细胞进行了更广泛的表型分析−/−老鼠尚未被报道(27).
Salpeter等人最近的一份报告(45)证明β细胞中细胞周期蛋白D2的葡萄糖活化需要葡萄糖刺激的钙2+大量涌入。在我们的研究中，葡萄糖刺激细胞周期蛋白D2需要ChREBP。至少有两个原因，这两个观察结果不一定冲突。首先，葡萄糖代谢可能激活多种信号通路，最终导致细胞周期蛋白表达和活性增加。除了钙信号外，胰岛素/IGF1/IRS2信号通路、cAMP信号通路和Hif1β的抑制都与葡萄糖刺激β细胞增殖有关(41,46–48). 我们注意到葡萄糖增加Myc表达(25)和cyclin基因是c-Myc的直接靶点(49)以及钙调神经磷酸酶/NFAT(50). 因此，所有这些途径都有可能在β细胞中细胞周期蛋白的激活和细胞周期的进展中发挥重要作用。其次，这些途径可能在不同的时间尺度（Ca2+流入发生在几秒到几分钟内；ChREBP依赖性转录的激活需要几分钟到几小时）或具有不同的细胞调节靶点（例如，转录与蛋白质周转）。未来的挑战将是确定ChREBP依赖性信号通路和其他信号通路之间的关系。另一个重要的挑战是确定ChREBP是否是任何其他有丝分裂信号所必需的，例如生长因子、胰腺切除术后恢复、妊娠或高脂肪饮食。显然，关于β细胞中的ChREBP还需要了解更多。
总之，葡萄糖敏感转录因子ChREBP是葡萄糖刺激的β细胞增殖所必需的。这些结果为许多实验方法提供了一个平台，以测试使用ChREBP作为靶点以增加β细胞增殖、模拟和增强天然β细胞有丝分裂原的可行性。
致谢
这项工作得到了以下赠款的支持：国立卫生研究院（NIH）R56DK065149；美国糖尿病协会ADA 7-11-BS-128；青少年糖尿病研究基金会（JDRF）17-2011-598（D.K.S.）；国家卫生研究院DK077096（A.G.-O.）和国家卫生研究所DK078060（R.C.V.）；和JDRF 34-2008-630、JDRF 1-2008-39、NIH DKR0155023和NIH DK U-01 89538（A.F.S.）。
未报告与本文相关的潜在利益冲突。
M.R.M.和D.K.S.设计了研究并撰写了手稿。M.R.M.、P.Z.、M.K.B.、C.C.、R.E.S.、K.T.和R.G.进行了实验。所有作者都参与了讨论。M.R.M.、P.Z.、L.C.A.、R.M.O.、A.F.S.、R.C.V.、A.G.-O.和D.K.S.审查并编辑了手稿。D.K.S.是这项工作的担保人，因此，他可以完全访问研究中的所有数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。
作者感谢Howard Towle博士（明尼苏达大学）提供了表达ChREBP的腺病毒，感谢Chris Newgard提供了INS-1衍生的832/13细胞（杜克大学Stedman营养与代谢中心）。
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