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癌症研究。作者手稿；PMC 2013年7月15日发布。
以最终编辑形式发布为：
《癌症研究》，2012年7月15日；72(14): 3677–3686.
2012年5月18日在线发布。 数字对象标识：10.1158/0008-5472.CAN-12-0080
预防性维修识别码：PMC3399032型
NIHMSID公司：NIHMS379879
PMID：22609800

脯氨酸氧化酶促进缺氧肿瘤微环境中肿瘤细胞的存活

刘伟（音译）,1 克里斯汀·格伦德,2,三 Zaver M.Bhujwalla先生,2,三 维努·拉曼,2,三 安妮特·夏尔玛,1和詹姆斯·M·彭1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

脯氨酸是一种容易释放的应激底物，在营养应激期间，脯氨酸氧化酶（POX）可以代谢产生活性氧物种以诱导细胞凋亡或自噬或ATP。然而，脯氨酸代谢在缺氧微环境中对肿瘤发生的作用尚未被探索。在本研究中，我们研究了低氧和葡萄糖缺乏条件下POX的不同功能。我们发现缺氧在体外诱导癌细胞中POX表达，并且POX上调与体内缺氧组织共存。此外，低氧和低血糖联合作用对POX表达有加性影响。与低血糖条件类似，低氧介导的POX诱导依赖于AMP活化蛋白激酶（AMPK）的激活，但不依赖于HIF-1α和HIF-2α。在低葡萄糖以及低葡萄糖和缺氧的联合条件下，POX分解代谢的脯氨酸优先用于ATP的产生，而在缺氧条件下，POX通过产生ROS介导自噬信号以促进生存。尽管缺氧和葡萄糖缺乏的具体机制不同，但POX始终有助于肿瘤细胞在这些条件下存活。总之，我们的发现为恶性微环境中肿瘤细胞的代谢重编程提供了新的见解，并表明脯氨酸代谢是癌症治疗的潜在靶点。

介绍

控制细胞生长的途径研究的最新进展，揭示了它们与代谢途径的密切相互作用，为癌症代谢研究重新注入了活力(1-三). 肿瘤细胞以葡萄糖和谷氨酰胺为其代谢提供燃料，以满足增殖的生物能量和生物合成需求。80多年来，Warburg效应或有氧糖酵解被认为是癌细胞代谢的中心原则(1,4). Fogal等人认为氧化磷酸化在肿瘤发生中也起着关键作用(5). 此外，胆碱磷脂代谢异常目前正在成为肿瘤发生和肿瘤进展的代谢标志(2). 最近的研究记录了Myc癌基因刺激的谷氨酰胺分解代谢在肿瘤代谢中的重要作用(三). 然而，由于肿瘤的快速生长和相关的血管功能不全，许多肿瘤细胞会耗尽氧气和营养物质，即葡萄糖和谷氨酰胺。肿瘤中的低氧、低血糖或低氧和低血糖混合区域使肿瘤代谢特征难以表征。由于这些区域性不利的微环境，转化带来的高生物能量需求要求肿瘤重新编程其代谢模式，以满足增殖和/或生存的需求。脯氨酸作为一种微环境应激底物，由于其在肿瘤中的可用性、独特的代谢以及对各种应激的反应，引起了人们的关注。随着葡萄糖的缺乏和脯氨酸氧化酶（POX）的上调，脯氨酸可以被代谢以提供ATP(6). 然而，缺氧对脯氨酸代谢的影响尚未被探索。

脯氨酸是细胞微环境中最丰富的氨基酸之一。脯氨酸与羟脯氨酸一起构成胶原蛋白中25%以上的残基，胶原蛋白是细胞外基质（ECM）中的主要蛋白质（80%）(7). 随着基质金属蛋白酶（MMP）分解胶原蛋白，脯氨酸很容易得到。与其他氨基酸不同，脯氨酸有自己的代谢酶；它被脯氨酸氧化酶（POX），也就是线粒体内膜酶脯氨酸脱氢酶（PRODH）分解为吡咯烷-5-羧酸盐（P5C）；PRODH公司被鉴定为p53快速而有力地诱导的少数基因之一(8). 随后，对其在细胞存活、凋亡细胞死亡和癌细胞自噬中的作用进行了研究和表征(9-11). 脯氨酸转化为P5C提供电子，电子可以通过黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）直接产生超氧化物，或者进入电子传输链产生ROS或产生ATP(6,12,13). POX被p53、PPARγ配体（一种对炎症应激反应的信号系统）和氧化的低密度脂蛋白上调，产生超氧自由基，根据特定应激启动凋亡细胞死亡或前存活自噬(8-11). 然而，在营养胁迫条件下，脯氨酸可以作为能量来源提供ATP(6). 在本研究中，我们研究了缺氧对POX表达和功能的影响，并探讨了缺氧和/或缺糖条件下POX催化脯氨酸代谢的差异功能。对脯氨酸分解代谢在癌症代谢中的重要性的评估将有助于更好地了解恶性微环境中的肿瘤代谢重编程。

材料和方法

细胞培养

人结肠癌（HCT116、HCT15、HT29）、肾癌（TK10和786-0）、乳腺癌（MCF7和Hs-578-T）、前列腺癌（PC3）、黑色素瘤（M14）、肺癌（A549）和卵巢癌（IGROV1）细胞系由NCI细胞系库提供，并在添加10%胎牛血清、100单位/mL青霉素、，建议使用100μg/mL链霉素和2 mM谷氨酰胺。

三阴性转移人乳腺癌细胞系MDA-MB-231是从美国型培养物集落（ATCC）中获得的，并用含有五个拷贝的低氧反应元件（HRE）（5′-CCA CAG TGC ATA CGT GGG CTC CAA GTC CTC TT-3′）的构建物稳定转染人类VEGF-A基因与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的互补DNA连接，如前所述，EGFP产生MDA-MB-231 HRE-EGFP(14,15). MDA-MB-231 HRE-EGFP细胞在低氧条件下表达EGFP，作为低氧诱导因子1（HIF-1）驱动的低氧传感器，在低氧细胞培养物中通过荧光显微镜进行验证，在相应的蛋白裂解物中通过SDS-PAGE和抗EGFP抗体的免疫印迹分析（BD Biosciences）进行验证，如前所述(14). 可检测到的EGFP表达通常在暴露于低于1%的O的6小时内观察到2以及在培养的HRE-EGFP表达细胞中20小时后EGFP的稳定表达(14). 所有细胞系均通过形态学和生长速度鉴定支原体免费。

POX启动子活性

在检测之前，细胞与POX启动子-荧光素酶（POX-Luc）和pRL-完整肾素构建物共转染(11). 在转染后6-10小时，将细胞暴露于常氧或缺氧（0.05%O2）。根据制造商的说明，使用双荧光素酶报告试验（Promega）评估POX启动子活性。

统计分析

所有数据代表至少3个独立实验，所有误差条均为平均值±SEMP（P）值由学生双尾计算t吨测试，除非另有说明。结果被认为在P（P）< 0.05.

其他方法

有关低氧暴露、实时RT-PCR、Western blot、肿瘤异种移植研究、EGFP和POX免疫组织化学染色和colocolization分析、siRNA转染、ROS和ATP测量、TUNEL染色、自噬体检测等方法的详细说明，请参阅补充材料和方法.

结果

缺氧上调多种肿瘤细胞系中POX的表达在体外

缺氧是实体瘤微环境的一个重要特征，它通过引起遗传不稳定和驱动肿瘤代谢的变化来影响肿瘤的进展(16). 为了研究缺氧是否影响POX的表达，我们首先测试了缺氧条件下多种癌细胞中POX启动子的活性，包括结肠（HT-29、HCT-116和HCT-15）、肾（TK10和786-0）、乳腺（MCF7和Hs-578-T）、前列腺（PC3）、黑色素瘤（M14）、肺（A549）和卵巢（IGROV1）癌细胞系2). 除TK10肾癌细胞系外，大多数癌细胞系在缺氧24小时后，与常压相比，POX启动子显著激活(图1A). 这种瞬时转染试验直接测量特定DNA序列片段的促进作用，其准确性受多种因素影响，如载体、转染剂量和宿主细胞特性(17-19). 因此，我们同时测量了相同细胞系中POX的mRNA水平，这些细胞系以绝对基因组当量表示(17). 如所示图1B在缺氧暴露的所有受试细胞系中，POX mRNA水平增加（0.05%2). POX启动子活性与mRNA水平之间存在显著相关性（r=0.40），这与其他人的报道接近(17,19). HT29显示POX mRNA的显著高表达，高达10倍(图1B). 使用HT29细胞系，我们测定了氧浓度和POX mRNA和蛋白质水平的时间依赖性反应。随着氧浓度的降低，POX mRNA表达的增加呈时间依赖性。治疗24小时后，POX mRNA在5%、0.5%和0.05%氧浓度下分别增加了1.8倍、5倍和10倍2浓度，分别(图1C). 在0.05%O中也观察到POX蛋白表达的时间依赖性增加2环境(图1D). 密度分析表明，POX蛋白的变化与POX mRNA水平的变化相对应。

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缺氧上调POX表达在体外在缺氧24小时（0.05%氧自由基）后，检测不同癌细胞中POX启动子活性（A）和mRNA表达（B）2)治疗。结果表明，与常氧暴露相比，缺氧暴露细胞的相对荧光素酶活性和POX mRNA水平发生了翻倍的变化。C、 HT29结直肠癌细胞中POX mRNA表达的氧浓度和时间依赖性反应。D、 0.05%O的时效效应2对HT29细胞中POX蛋白表达的影响。E、 低氧和/或低血糖（1mM）对HT29细胞POX mRNA表达的影响。F、 暴露于缺氧（Hy）和/或低血糖（LG）（1mM）24小时的HT29细胞中POX蛋白表达。*,P（P）<0.05,**,P（P）<0.001，与常氧对照组（Ctr）相比。

肿瘤中的葡萄糖分布被认为遵循与氧气相似的模式(20). 此外，具有激活的需氧糖酵解（Warburg效应）或厌氧糖酵化（缺氧细胞）途径的肿瘤细胞比氧化细胞使用更多的葡萄糖来生成ATP。他们往往会耗尽周围的葡萄糖。因此，我们测试了缺氧伴或不伴葡萄糖剥夺对POX mRNA和蛋白表达的影响(图1E和1F). 与上一份报告一致(6)低血糖条件下（1mM）POX mRNA和蛋白表达均增加。低氧和低血糖对POX表达有加性影响。在上述条件下，TK10和Hs-578-T细胞中的POX蛋白水平增加(补充图1A).

人乳腺癌小鼠异种移植模型缺氧肿瘤微环境中POX表达增加

证实缺氧对整个肿瘤微环境中POX的上调体内，我们开发了人乳腺癌细胞系MDA-MB-231 HRE-EGFP，该细胞在含有低氧反应元件（HREs）的启动子的控制下表达EGFP报告基因，该启动子与HIF-1结合并由HIF-1诱导。因此，我们可以通过监测EGFP的表达，在小鼠原位生长的MDA-MB-231 HRE-EGFP肿瘤异种移植物中定位缺氧区域，其中缺氧稳定的HIF-1导致EGFP的表达。我们首先描述了低氧条件下MDA-MB-231 HRE-EGFP中POX mRNA的表达（0.3-0.5%2)在组织培养中。正如预期的那样，缺氧条件下POX mRNA呈时间依赖性增加(补充图2)荧光显微镜证实HIF-1控制的EGFP表达。然后，我们使用MDA-MB-231 HRE-EGFP肿瘤异种移植物的组织切片进行POX和GFP免疫组织化学（IHC）。的左侧面板图2 B图中显示了如何切割MDA-MB-231 HRE-EGFP肿瘤异种移植物，以及通过IHC分析肿瘤中切割的切片。的右侧面板图2A显示了肿瘤中心载玻片的EGFP和POX IHC染色的代表性图像，其中通常包含肿瘤的大部分缺氧区域。通过EGFP表达确定的缺氧区域也具有最高的POX染色。虽然POX和EGFP在肿瘤顶部和身体部位的染色水平较低，但POX的染色强度趋势与EGFP相同。共校准分析表明，大多数载玻片中POX和EGFP的Pearson相关系数均大于0.5（p<0.001），有力地表明POX和EGFP的表达共定位(图2B).

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缺氧肿瘤微环境中POX增加体内.A，左面板，MDA-MB-231 HRE-EGFP肿瘤异种移植物图，显示肿瘤全切切片的位置，用于POX和GFP免疫组织化学（IHC）染色。右侧面板，POX和EGFP IHC染色的代表性图像。B、 使用皮尔逊相关系数对POX和EGFP IHC染色进行共定位分析。

低氧诱导的POX表达依赖于AMPK激活，而不是HIF-1α或HIF-2α

AMP-activated protein kinase（AMPK）是细胞能量状态的传感器；它存在于所有真核生物中，在缺氧或营养缺乏等应激条件下，在高AMP/ATP条件下被激活(21). 因此，我们通过使用AMPK活化的特异抑制剂（6-[4-（2-哌啶-1-乙氧基）-苯基）]3-吡啶-4-基-吡唑并[1,5-a]嘧啶，即化合物C，来确定AMPK在低氧诱导POX表达中的潜在作用。通过Western blot评估磷酸-AMPKα。据报道，HT29细胞缺氧24小时和48小时后激活了AMPK，这可以被化合物C（50μM）抑制(图3B).图3A和B清楚地表明，AMPK的激活正向调节POX的mRNA和蛋白表达。化合物C使POX表达几乎降至未刺激的基础水平。这些结果在TK10和Hs-578-T细胞中得到证实(补充图1B)

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缺氧诱导的POX表达依赖于AMPK的激活。用AMPK抑制剂化合物C（Com C）（50μM）处理HT29细胞，而用0.05%的O处理细胞2通过Western blot（B）评估AMPK激活。分别用实时PCR和Western blot检测POX mRNA（A）和蛋白表达（B）。*,P（P）<0.001（与正常氧相比）。#,P（P）与缺氧相比<0.001。

尽管缺氧诱导因子（HIF）-1和HIF-2是激活靶基因转录以应对肿瘤缺氧的关键转录因子(22)，我们的结果表明HIF-1α和HIF-2α对低氧诱导的POX表达不是必需的(补充结果和补充图3).

上述结果与Pandhare等人的观察结果一致(6)也就是说，在低血糖条件下POX的活化是由活化的AMPK介导的，AMPK激活剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷（AICAR）增加POX。因此，我们可以得出结论，缺氧和葡萄糖消耗通过AMPK途径介导的相同机制上调POX表达。

POX有助于癌细胞在缺氧和葡萄糖缺乏时存活

如前所述，POX降解脯氨酸，生成ROS用于凋亡或促生存自噬，或根据不同的应激产生ATP(6,9-11). 我们研究了在低氧和/或低血糖条件下，上调POX对细胞活力以及ATP和ROS生成的影响。如所示图4A在HT29细胞处理48小时后，低血糖（1mM）使细胞增殖降低46.5%，而低氧（0.05%O2)仅减少了7.3%。然而，两者的结合是协同作用的，减少了72%。POX抑制剂脱氢脯氨酸（DHP）（10mM）进一步降低了所有条件下的细胞存活率，尤其是在低血糖和低氧条件下（分别为73.2%和60.4%），表明POX对脯氨酸的降解参与了生存的代偿机制。添加外源脯氨酸（5mM）对增殖影响不大，表明基础培养基脯氨酸或内源脯氨酸足以适应这种变化。

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POX有助于癌细胞在缺氧和葡萄糖缺乏时存活。用低血糖（1mM）和/或低氧（0.05%O）处理HT29细胞2)在48小时内，同时给细胞注射10mM脱氢脯氨酸（DHP）、POX抑制剂和/或5mM脯氨酸，如图所示。A、 用WST法进行增殖试验。分别使用DCF分析和基于荧光素酶的分析进行细胞内ROS（B）和ATP生成（C）。当细胞被低血糖和/或缺氧处理时，使用D到F，POX siRNA（siPOX）来降低POX的表达。如上所述检测增殖、活性氧和ATP生成。

接下来，我们检查了在这些条件下ROS和ATP的生成，以分析它们对细胞生存的贡献。低氧应激显著增加了ROS的生成，DHP可以部分降低这种增加(图4B). 外源脯氨酸添加（5mM）进一步增加了活性氧的生成，这也被DHP抑制。有趣的是，缺氧处理48小时后，无论是否添加DHP，ATP水平都没有显著降低(图4C)表明缺氧时上调POX对ROS有显著影响，但对ATP的维持无显著影响。相反，低血糖本身对HT29细胞的ROS或ATP几乎没有影响。然而，当在低血糖条件下添加DHP时，细胞内ATP而非ROS显著降低(图4B和C)这表明，在缺乏葡萄糖的情况下，脯氨酸是能量的来源，而不是代谢信号的来源。在暴露于缺氧和低血糖的细胞中，ATP的产生显著减少，DHP进一步降低了ATP的产生。在这种极端条件下，添加外源脯氨酸显著提高了ATP水平(图4C)，但ROS没有显示任何明显变化(图4B).

为了避免POX抑制剂DHP的任何潜在非特异性副作用，并证实上述结果，我们在一系列类似实验中使用POX siRNA（siPOX）来敲低POX表达。western blot证实POX表达降低，80%以上的POX被敲除(补充图4). POX敲除导致低血糖、低氧以及低血糖和低氧联合作用时细胞增殖降低(图4D). POX敲低在缺氧时显著降低ROS的产生，但在低血糖时仅适度降低(图4E). 如DHP抑制所示，在低血糖条件下，POX击倒时ATP生成显著降低，而低氧时无变化(图4C和F). 这些结果证实了DHP抑制POX的上述结果，表明POX降解脯氨酸导致不同的终点，这取决于代谢应激的类型。低血糖时，脯氨酸被用作能量来源，而低氧时，脯蛋白代谢是ROS信号的机制。由于POX有助于细胞存活，而不是细胞在缺氧条件下死亡，我们假设POX诱导的ROS发生保护性自噬，而不是凋亡。以下实验证实了这一假设。

缺氧条件下POX诱导保护性自噬，但不诱导凋亡

众所周知，缺氧可增加凋亡细胞死亡和自噬，后者是癌细胞的生存策略(23,24). 一个重要的问题是低氧下上调POX产生的ROS是否介导细胞凋亡或保护性自噬。为此，我们首先通过Western blot监测HT29细胞中的凋亡标记物PARP和切割的PARP。缺氧（0.05%O2)增加了裂解PARP的产量(补充图5A). 然而，POX-siRNA（siPOX）略微增加而不是减少这种缺氧效应。这种微小的增加可能是由于转染过程本身，因为阴性对照siRNA（siNeg）显示出相同的效果。TUNEL染色证实了这一结果(补充图5B和C). HT29细胞经缺氧处理72小时后，进行TUNEL染色，计算TUNEL阳性细胞（凋亡细胞）的百分比。与常压相比，缺氧使凋亡细胞的百分比从10%增加到62.5%。SiPOX与siNeg没有表现出任何明显不同的效果。

已知低氧诱导的自噬涉及AMPK的活性(24). AMPK通过缺氧介导POX上调的事实进一步加强了我们的假设，即POX可能激活自噬。因此，我们研究了缺氧诱导自噬以及AMPK和POX在HT29细胞自噬诱导中的作用。如图所示图5A，缺氧（0.05%O2)显著诱导LC3II的形成，其数量与自噬体的数量密切相关。AMPK抑制剂化合物C显著抑制缺氧诱导的自噬。在我们用siRNA敲低AMPK诱导的POX表达后，LC3II的形成部分被阻断，而siNeg没有影响。为了确保这是一个动态和完整的自噬过程，我们使用巴非霉素A1阻断了自噬体与溶酶体的融合。巴氟霉素A1导致未经处理的LC3-II的显著积累。此外，beclin-1是自噬的中央调节器之一(25)，显示出与LC3II相似的变化模式(图5B). GFP-LC3II病毒转导后自噬体的产生进一步验证了上述结果(图5C和D). 低氧状态下GFP-LC3II阳性细胞的百分比远高于常压状态（分别为35.4%和2.6%）。化合物C和siPOX使GFP-LC3II阳性细胞百分比分别降低到10.8%和16.05%。此外，为了确定低氧诱导的自噬维持细胞存活，但不致细胞死亡，我们用自噬抑制剂氯喹（CQ）处理细胞。如所示图6E，两种浓度的CQ（5和10μM）显著降低了细胞增殖，表明持续的自噬促进了细胞存活，这一发现与POX对细胞活力的影响一致。

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缺氧时POX诱导保护性自噬。A、 HT29细胞转染POX siRNA或干扰阴性siRNA 18小时后，细胞暴露于缺氧（0.05%2)或在不同时间段同时用化合物C处理。Western blot检测自噬LC3-I和II（左侧）。Bafilomycin A1治疗（48小时）表明存在自噬通量（右图）。B、 细胞缺氧48小时后，实时RT-PCR检测beclin-1 mRNA的表达。C、 通过GFP-LC3II病毒转导追踪自噬体的积累。突变GFP-LC3（G120A）作为阴性对照。D、 计算GFP-LC3阳性细胞百分比。E、 HT29细胞在缺氧（0.05%O）条件下给予自噬抑制剂氯喹（CQ）（5和10μM）2). 使用WST方法在不同时间点进行增殖分析。*,P（P）<0.001（与正常氧相比）；##,P（P）<0.05,##,P（P）与缺氧相比<0.01。

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POX诱导的ROS对于低氧诱导的自噬是必需的。HT29细胞被给予5mM的活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC），而细胞暴露于低氧（0.05%O2)48小时后，用Western blot检测自噬LC3-I和II。B和C，通过GFP-LC3II病毒转导追踪自噬体的积累，并计算GFP-LC3阳性细胞的百分比。D、 用WST方法进行增殖试验。E、 缺氧暴露前，将POX siRNA或干扰阴性siRNA转染HT29细胞18小时。然后用缺氧（0.05%O）处理HT29细胞2)48小时。同时将化合物C添加到培养基中。通过Western blot测定磷蛋白-mTOR和磷蛋白S6水平。*,P（P）<0.001（与正常氧相比）；#,P（P）与缺氧相比<0.001。

POX诱导的ROS对低氧诱导的自噬是必需的

为了证实POX产生的ROS确实与自噬有关，我们检测了ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）对LC3II的形成和低氧条件下自噬体的积累的影响。如所示图6ANAC（5mM）显著降低低氧（0.05%O2)在HT29细胞中。它还减少了GFP-LC3II呈点状分布的细胞数量(图6B和C). 我们进行了增殖试验，以评估低氧诱导的活性氧对细胞活力的贡献。NAC对ROS介导的应激的防御显著改善了细胞生长(图6D)表明在我们的实验条件下，低氧诱导的活性氧可以损伤细胞并降低细胞活力。由于POX不是低氧诱导的活性氧的唯一贡献者，而且活性氧具有多种功能，因此POX产生的活性氧对保护性自噬是必要的。

AMPK调节的主要下游信号通路之一是哺乳动物靶向罗哌霉素（mTOR）通路(26). 众所周知，AMPK可以通过抑制mTOR活性来诱导自噬反应(27). 我们实验室以前的工作表明，雷帕霉素抑制mTOR会增加POX并刺激脯氨酸降解(6). 此外，其他人的研究表明，Akt/mTOR通路能够诱导ROS介导的自噬(28). 因此，为了评估mTOR途径在AMPK-POX-ROS自噬途径中的参与，我们检测了mTOR及其下游因子S6的激活。如前所述(26,27,29)，我们发现磷酸化-mTOR和磷酸化-S6随着缺氧而降低，这种作用可以被AMPK抑制剂化合物C逆转(图6E). 然而，POX siRNA对mTOR和S6的激活没有影响，这与mTOR在POX诱导的缺氧自噬中的作用相矛盾。

在营养素限制的条件下也可以诱导自噬，这为维持细胞活力提供了一种机制(30). 我们的实验表明，低血糖条件确实会诱导自噬，但使用siRNA敲除POX并不会改变LC3I向LC3II的转化（数据未显示）。这可能是因为POX用于产生ATP以直接提供能量，而不是用于ROS信号。

讨论

缺氧和营养缺乏是肿瘤微环境的重要特征。肿瘤细胞的特征之一是它们的代谢重编程以适应这些不利条件(31,32). 肿瘤细胞的代谢变化可以提高生存率并促进恶性进展(32,33). 氧和葡萄糖的缺乏会导致AMPK的激活，AMPK是肿瘤细胞介导这些代谢变化的关键因素(21,34). 一旦受到刺激，AMPK就会抑制能量消耗过程，并通过直接激活代谢酶或诱导特定基因表达来激活能量产生过程以恢复能量平衡，这些基因表达控制着与肿瘤发展相关的过程，包括细胞周期进行、蛋白质合成、细胞生长和生存(35,36). 我们以前的报告表明，葡萄糖戒断诱导POX依赖于AMPK(6). AICAR对AMPK的药理学激活导致POX的显著诱导(6). 因此，正如本研究所证明的那样，缺氧引起的POX上调与细胞对缺氧反应的主要调节因子HIF-1α或HIF-2α无关，而是由于缺氧激活的AMPK途径发出的信号。

我们的结果表明，AMPK信号诱导POX有助于肿瘤细胞存活。POX是一种多功能酶，其结构决定了其在嗜热菌(12). 脯氨酸在POX活性部位转移到FAD的电子对可以直接还原溶剂氧生成超氧物(12,13). 然而，相邻的α-螺旋结构可以构象转移以阻止FAD与溶剂氧的接触。或者，电子可以被提供给电子传输链以生成ATP(6,13). 总结如下图7，我们目前的研究揭示了POX在缺氧和葡萄糖缺乏时的不同功能。POX激活在低血糖应激下产生ATP，而充足葡萄糖的缺氧激活POX介导的ROS生成。作为对厌氧环境的适应，糖酵解被诱导，肿瘤最大限度地利用有限的可用葡萄糖(37). 当葡萄糖供应有限时，癌细胞可能会被迫选择脯氨酸作为替代能源的一部分，因为ECM/脯氨酸来源比脂肪酸和谷氨酰胺（与葡萄糖一样也需要通过循环输送）具有显著优势。虽然脯氨酸不是生成ATP的有效底物，但它在癌细胞对营养限制的代谢适应中的作用可能是显著的。我们的结果表明，POX对脯氨酸的氧化可能代表ATP和ROS生成之间的一个转换点，根据特定的肿瘤微环境应激，例如葡萄糖缺乏或缺氧，这会导致不同的结果。介导这种转换的机制尚不清楚，需要进一步探讨。然而，由于POX的诱导，脯氨酸的降解可以在低血糖条件下增加ATP的生成，并在缺氧条件下诱导ROS的生成，这两个过程都有助于肿瘤细胞存活。ATP用于直接提供能量，而ROS用于保护性自噬，而不是凋亡细胞死亡。

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缺氧和低血糖条件下POX的差异功能。低氧、低血糖以及低血糖和低氧联合作用通过相同的机制上调POX：AMPK途径。在低血糖条件下，POX优先用于ATP生成，而在低氧条件下，葡萄糖POX介导的ROS生成充足。然而，POX诱导的ATP和ROS最终通过直接能量供应（ATP）或ROS诱导的保护性自噬促进肿瘤细胞存活。

自噬是一种细胞自分解代谢过程，细胞质和细胞器在溶酶体中降解，以回收氨基酸和能量(38). 它通常在氧和/或营养限制的压力下在癌细胞中被诱导，提供了维持细胞活力的生存机制(38). 许多报告表明，应激触发的自噬依赖于AMPK途径(24,39). AMPK调节自噬的下游靶点包括mTOR(40)，第27页(41)和真核延长因子-2激酶（eEF-2激酶）(42)本研究表明POX是AMPK激活自噬的另一个下游靶点。缺氧条件下POX生成的ROS似乎对诱导自噬至关重要。尽管作为重要的自噬诱导物和标记物的beclin-1的过度表达已被证明与肿瘤缺氧有关，并能预测各种癌症的不良预后(43,44)低氧对其上调的机制尚不清楚。据报道，蛋白激酶C（PKC）δ在缺氧反应早期通过分解Bcl-2/beclin 1复合物诱导beclin-1(45). 奇帕等。确定Beclin-1是AMPK启动自噬级联反应的潜在下游靶点(46)我们的研究表明，POX依赖AMPK激活诱导beclin-1(图5B).

许多报告显示，脯氨酸在各种肿瘤中的浓度增加(47,48). 游离脯氨酸的一个重要来源是I型胶原的降解，I型胶原是肿瘤ECM中的主要蛋白质(7). 卡卡德SM等。据报道，缺氧会导致胶原蛋白降解(15). 我们实验室以前的工作表明，葡萄糖消耗激活了MMP-2和-9，它们降解ECM中的胶原蛋白I，同时观察到细胞内脯氨酸水平的增加(6). 自噬降解的细胞内蛋白质也可能提供游离脯氨酸的重要来源。充足的脯氨酸来源确保了其作为替代胁迫底物的可用性。我们目前的研究表明，DHP或siRNA对POX的抑制显著降低了增殖、ATP的生成或ROS的生成，而外源脯氨酸的添加仅轻微影响这些效应，这表明在本文所用的实验条件下，内源性脯氨酸是应激底物的主要来源。

值得注意的是，我们仅在HT29结肠癌细胞中研究了缺氧和/或葡萄糖剥夺对POX上调的作用，尽管我们观察到了不同癌细胞中POX表达的诱导。POX上调的下游效应可能与组织或环境有关，需要进一步研究。

总之，我们已经证明缺氧和/或葡萄糖剥夺可诱导各种癌细胞中POX的表达。POX是AMPK信号网络中的一个关键因子，至少在HT29结肠癌细胞中，在缺氧和葡萄糖缺乏条件下，AMPK是适应性代谢诱导的关键因子。脯氨酸分解代谢的诱导是肿瘤细胞转变为生存模式的重要机制。这些发现为我们理解肿瘤细胞的代谢变化提供了新的见解，超越了众所周知的有氧糖酵解的Warburg效应。

补充材料

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致谢

我们感谢朱自强博士的深刻评论。我们还感谢Donna Butcher对EGFP和POX免疫组化的技术帮助，以及De Chen博士和Stephen Lockett博士对结肠镜化的分析。

赠款支持这项研究（部分）得到了NIH内部研究计划、国家癌症研究所、癌症研究中心以及NIH外部拨款P50 CA103175和CA154725的支持。本出版物的内容不一定反映卫生与公众服务部的观点或政策，提及商品名称、商业产品或组织也不意味着美国政府的认可。

脚注

潜在利益冲突的披露没有披露潜在的利益冲突。

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