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酒精临床实验研究。作者手稿；PMC 2013年11月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
酒精临床实验研究，2012年11月；36(11): 1851–1862.
2012年4月6日在线发布。 数字对象标识：10.1111/j.1530-0277.2012.01798.x
PMCID公司：项目经理3396787
尼姆斯：美国国家卫生研究院359557
PMID：22486562

氧化应力调制KLF6完全及其拼接变体

拉奎尔·厄塔松，博士。，1,2 弗朗西斯科·哈维尔·库贝罗，博士。，1,三和娜塔莉亚·尼托，博士。1
作者信息 版权和许可证信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

背景和原理

活性氧（ROS）的诱导是酒精肝毒性的中心机制。KLüppel-like factor 6（KLF6）是一种转录因子和肿瘤抑制基因，是一种早期损伤反应基因；然而，活性氧和酒精对KLF6诱导的影响尚不清楚。

目标

研究细胞色素P450 2E1（CYP2E1）和NAD（P）H醌氧化还原酶（NQO1）这两种活性氧来源和乙醇对细胞凋亡的调节作用KLF6型完全表达式，拼接到KLF6_V1型和KLF6_V2型以及对下游靶点TNFα的影响。

方法和结果

CYP2E1表达的HepG2细胞内源性ROS的产生诱导了细胞的mRNA和蛋白表达KLF6型完全以及与对照细胞相比的剪接变体。用促氧化剂培养，如花生四烯酸（AA）、β-萘黄素和H2O（运行）2，进一步增强KLF6型完全及其剪接变体。AA对KLF6型完全其剪接形式被防止脂质过氧化的维生素E和CYP2E1抑制剂二烯丙基硫化物阻断。甲萘醌和百草枯——通过NQO1诱导的KLF6代谢的两种前氧化剂完全mRNA以硫依赖的方式表达。抗氧化剂和NQO1抑制剂抑制甲萘醌依赖性增加KLF6型完全此外，慢性酒精依赖大鼠的原代肝细胞和肝脏脂质过氧化升高，H2O（运行）2和CYP2E1，但GSH较低，在KLF6型完全mRNA与对照组比较。抑制p38磷酸化进一步上调CYP2E1和AA对KLF6型完全mRNA，而抑制JNK和ERK1/2磷酸化均降低。KLF6_V1型但不是KLF6型完全消融显著增加巨噬细胞TNFα水平；因此，TNFα成为KLF6_V1的下游靶点。

结论

活性氧在调制中的新作用KLF6型完全表达及其剪接变异体可能在肝损伤和TNFα调节中发挥相关作用。

关键词：细胞色素P450 2E1、NAD（P）H醌氧化还原酶、活性氧物种、TNFα

简介

氧化应激和活性氧的产生是介导乙醇肝毒性和肝损伤的主要途径。对CYP2E1的主要兴趣在于，这种未偶联酶能够代谢乙醇，从乙醇氧化中生成反应产物，激活许多毒理学相关试剂，如四氯化碳、对乙酰氨基酚和醇，生成毒性更强的反应产物，生成ROS，并由醇本身诱导(库普，1992年;Song，1996年;Tanaka等人，2000年).

乙醇诱导CYP2E1和随后的氧化应激状态是通过激活转录因子导致基因转录改变的中心机制(邦迪，1992年;塞德鲍姆，1989年;塞德鲍姆，2001;石井等人，1997年;利伯，2000;诺德曼，1994年;Nordmann等人，1992年;筑本，2001). 此外，基因启动子中的抗氧化剂和/或ROS反应元件对氧化应激敏感，ROS修饰mRNA稳定性(Sen等人，2005年;Zhao等人，2004年). 与这些众所周知的转录和转录后控制途径相比，CYP2E1和乙醇诱导的ROS是否能够调节mRNA剪接尚不清楚，而mRNA剪合正成为组织修复和分化的关键调节器。

锌指蛋白是一类重要的真核转录因子。锌指转录因子类Krüppel家族调节细胞生长、增殖、凋亡和血管生成(比克，2001年;Black等人，1999年;Dang等人，2000年;Kaczynski等人，2003年;Oates等人，2001年;Philipsen和Suske，1999年). 所有KLF家族成员都具有高度保守的C端81氨基酸锌指DNA结合结构域，该结构域可以与响应启动子中的“GC盒”或“CACC盒”DNA基序相互作用，每个KLF都具有不同的N端激活结构域(Philipsen和Suske，1999年). 虽然KLF的DNA结合域是相同的，但其不同的激活域解释了其广泛的生物活性。KLF可以与其他任何一种KLF同型异二聚体(梅里卡和奥金，1995年)或使用异源转录因子(苏尔等人，2002年;Zhang等人，2002年).

KLF6型是一种普遍表达的Krüppel样转录因子(Ho和Piquette-Miller，2007年;Sirach等人，2007a)和抑癌基因(Narla等人，2005年;Narla等人，2001年;Narla等人，2007年)谁的角色体内尚未完全澄清。已知的假定转录靶点是胎盘糖蛋白(Blanchon等人，2001年),COL1A1公司(Ratziu等人，1998年),转化生长因子β(Kim等人，1998年)，类型I和II转化生长因子β受体(Kim等人，1998年)尿激酶型纤溶酶原激活剂(Kojima等人，2000年). 在人类中，KLF6可以剪接成较短的亚型(KLF6_V1型,KLF6_V2型和KLF6_V3型) (Narla等人，2005年) (补充图1)缺乏全部或部分DNA结合域。迄今为止，KLF6的诱导子和阻遏子以及下游靶点的储备，特别是可能在肝损伤中起关键作用的靶点，尚未完全确定其特征(比克，2001年). 关于KLF6完全其剪接变异体可以感应活性氧和乙醇，它们的比率是否会发生变化，这是否会影响它们的下游靶点，其中许多目标尚不清楚。活性氧和乙醇可能参与KLF6型完全其剪接亚型可能有助于了解其在酒精性肝病和其他发生氧化应激的疾病状态下对组织损伤和修复的潜在作用。

材料和方法

细胞系和原发性肝细胞

我们的大多数研究都是用亚瑟·I.塞德鲍姆（纽约西奈山医学院）实验室产生的CYP2E1表达细胞（E47细胞）进行的(Chen和Cederbaum，1998年;Chen等人，1997年)是组成性表达人CYP2E1的HepG2细胞。对照细胞（C34细胞）是转染pCI-neo的HepG2细胞，不表达CYP2E1。结肠癌HCT116细胞和小鼠RAW 246.7巨噬细胞取自ATCC（弗吉尼亚州马纳萨斯）。使用无内毒素胶原酶，从喂食8个月的大鼠中分离出原代肝细胞，在人类中大约需要20-30年的时间，使用Lieber-DeCarli饮食(Lieber和DeCarli，1982年). 乙醇衍生热量的百分比1周为10%，1周为20%，7.5个月为35%。对照组接受等量葡萄糖(Lieber和DeCarli，1982年). 研究方案由本研究所动物护理和使用委员会批准。在所有细胞中，通过Western blot和荧光底物7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素（7-MFC）或Reinke法测定CYP2E1含量和催化活性(Reinke和Moyer，1985年).

肝脏病理学

在肝脏灌注之前，从腹主动脉采集血液。分别使用Thermo Electron Corporation（马萨诸塞州沃尔瑟姆）、Sigma（密苏里州圣路易斯）和Wako Chemicals（弗吉尼亚州里士满）的试剂盒对血浆中的ALT和AST活性、乙醇浓度和非酯化脂肪酸（NEFA）进行分析。从左肝叶获取肝脏切片。将样品固定在10%缓冲福尔马林中过夜，并嵌入石蜡中。切片（5μm）用H&E染色，并由一名肝脏病理学家进行评估，该病理学家对实验信息失明。

一般方法

使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）分析监测细胞活力。利用丙二醛二甲基缩醛的标准曲线，从硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）的生成中测定细胞内外脂质过氧化最终产物(Nieto和Rojkind，2007年). 细胞外H2O（运行）2通过亚铁氧化-二甲酚橙试验进行评估(努鲁兹·扎德等人，1994年). 采用Tietze循环法测定无蛋白提取物中的谷胱甘肽水平(蒂泽，1969年). Northern印迹分析第2页第1页,KLF6型完全和GAPDH公司mRNA是使用我们实验室开发的cDNA探针进行的(Nieto等人，1999年). 使用Jerome Lasker博士（加利福尼亚州卡尔斯巴德Puracyp Inc.）捐赠的抗体进行CYP2E1的Western blot分析(清水等，1990年). KLF6抗体可识别所有亚型，来自圣克鲁斯生物科技公司（加州圣克鲁斯）。Western和Northern印迹中信号强度的量化在印迹下表示为密度测定的任意单位。

流式细胞术分析

细胞内H2O（运行）2和O2.−使用荧光探针2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）和二氢乙硫醚（DHE）进行评估(Brenner等人，2003年)分别为（Molecular Probes、Eugene、OR）。使用抗大鼠TNFαPE结合抗体（BD Pharmingen，加利福尼亚州圣何塞）通过流式细胞术分析测定细胞中的TNFα。使用FACS Calibur定量荧光强度™流式细胞仪并使用CellQuest Pro进行分析™软件（BD Biosciences，加利福尼亚州圣何塞）。使用ELISA试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA）测量分泌的TNFα。

定量实时PCR

使用PureLink Micro-to-Midi Total RNA纯化系统（加利福尼亚州卡尔斯巴德市Invitrogen）提取总RNA，用重组DNAse（罗氏诊断，IN）处理，并使用FastStart PCR主混合物（印第安纳波利斯市罗氏诊断）进行反转录。使用中列出的引物，使用LightCycler进行三重qRT-PCR反应表1使用LightCyclerR 480软件对数据进行分析，通过GAPDH对结果进行标准化。

表1

底漆

信使核糖核酸正向底漆反向底漆放大器尺寸
KLF6Fu ll公司5′-CGGACGCACACAG公司GAGAAAA-3′外显子2-外显子3（nt 763–782）5′-CGGTGTGCTTTCGGAAGTG-3′外显子3103个基点
KLF6_V 1型5′-CCTCGCCAGGGAAG公司GAGAA公司-3′外显子2-外显子3（新台币509–780）5′-CGGTGTGCTTTCGGAAGTG-3′外显子3104个基点
KLF6_V 2型5′-GTCGGGGAAGCCA公司GAGAA-3′外显子2-外显子3（nt 607–780）5′-CGGTGTGCTTTCGGAAGTG-3′外显子3103个碱基
GAPDH公司5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′5′-GATCTCGCTCCTGGAAGATG-3′113个基点

转染实验和报告检测

RAW 246.7细胞以5×10的密度进行培养4/转染前1天，12孔板上有孔。根据制造商的说明，使用脂质内酰胺试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）进行共转染研究。人类-982-肿瘤坏死因子α启动子结构由Goldfeld博士（马萨诸塞州波士顿哈佛医学院）提供。总共1μg的-982-肿瘤坏死因子α转染启动子构建物、pGL3 basic和50 ng pRenilla-Luc。20小时后，打乱了siRNAKLF6型完全或siRNAKLF6_V1型每孔转染20 pmol。在一些实验中，细胞在收获前用AA处理3小时。在用TNFα报告构建体转染后48小时收集细胞，并测量萤火虫和肾萤光素酶的活性。

统计分析

数据由一名学生的t吨测试，并在适用时通过双因素方差分析。数值表示为平均值±S.E.M(否>3).

结果

活性氧来源CYP2E1的过度表达诱导KLF6完全及其拼接形式

评估活性氧对KLF6型完全和其剪接形式，一个过表达CYP2E1的永生HepG2细胞系(图1A–1C)，作为活性氧内生生成的来源(图1D-1F，白色条），发现KLF6的表达增加完全与对照HepG2细胞相比，其剪接变体KLF6_V1（25kDa）和KLF6~V2（30kDa(图2A). 在mRNA和蛋白质水平上观察到类似的结果(图2B，未显示）。这可能是由于CYP2E1介导的活性氧增加，因为对照HepG2细胞中没有这种现象。

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CYP2E1-表达细胞在缺乏或存在AA的情况下生成ROS

通过Western blot分析对照细胞和CYP2E1表达细胞的CYP2E2蛋白。信号的量化参考第一个控制，其赋值为1。以7-MFC为底物，通过荧光法监测CYP2E1活性。结果参考平均值±SEM(N个=3, **P（P）<0.01)（A）用pCi-Neo或pCi-Nee转染CYP2E1表达细胞-KLF6型完全向量和第2页第1页和GAPDH公司通过Northern blot分析表达（B）用0–30μM AA处理对照细胞和表达CYP2E1的细胞6小时（100%活力），并拍摄光显微照片（C）.细胞外h的时间-过程研究（1-9小时）2O（运行）2在0–30μM AA存在下（D）.细胞内H2O（运行）2和O2.−使用荧光探针DCFDA在25μM维生素E或5 mM二烯丙基硫（DAS）存在下30μM AA处理后6 h（E）和DHE（F）.（D）至（F）中的结果为平均值±SEM(N个=6; *P（P）<0.05和**P（P）AA-处理的<0.01与。未经处理，•P（P）<0.05, ••P（P）<0.01和•••P（P）CYP2E1表达细胞<0.001与。控制，■ ■ ■P（P）联合治疗<0.001与。AA处理）。

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KLF6的表达完全及其在CYP2E1表达细胞中的拼接变体

的表达式KLF6型完全,KLF6_V1型和KLF6_V2型蛋白质经Western blot分析。信号的量化是指对照组中的平均信号，其赋值为1（A）.qRT-PCR用于KLF6型完全,KLF6_V1型和KLF6_V2型在对照细胞和CYP2E1表达细胞中（B）。在两个面板中，结果均表示为对照组的倍数增加，该对照组的数值为1（（B）中的虚线），并参考平均值±SEM(N个=3, ••P（P）<0.01和•••P（P）CYP2E1表达细胞<0.001与。控制）。

KLF6表达增加完全不会改变CYP2E1水平

由于KLF6是一种转录因子，为了阐明KLF6之间是否存在反馈回路完全用pCI-neo载体转染CYP2E1、CYP2E1表达细胞，该载体含有编码KLF6型完全或用空载体，48小时后通过Northern印迹分析CYP2E1的表达。类似 第2页第1页在所有样本中都发现了mRNA水平(图1B).GCLC公司和GCLM公司，两种调节蛋白质从头开始GSH合成可以防止ROS诱导的损伤，也保持类似（未显示）。

花生四烯酸对CYP2E1-E表达细胞活性氧的诱导作用

研究CYP2E1衍生活性氧在KLF6型完全表达和剪接，我们首先证实了CYP2E1表达细胞在与酒精诱导肝损伤发生相关的底物存在下产生氧化应激状态的能力(南麂，2004). 对照细胞和CYP2E1表达细胞与0-30μM AA（一种代表性的多不饱和脂肪酸（PUFA））在长达9小时的时间过程实验中培养(图1D-1F、灰色和后栏）。选择短时间点是因为KLF6型完全是一种早期反应基因(Kojima等人，2000年). 通过MTT分析和流式细胞术分析（未显示）或监测细胞形态变化来评估细胞活力；然而，在选定的时间点没有观察到细胞毒性的迹象(图1C). CYP2E1表达细胞显示较高的胞外和胞内H2O（运行）2级别(图1D-1E，白色条）以及细胞内O2 −(图1F，白色条）。AA处理可进一步提高ROS生成(图1D-1F、灰色和黑色条）。CYP2E1的表达和活性可以通过添加特定的抑制剂进行调节，而ROS介导的作用可以通过抗氧化剂来阻止。添加维生素E可防止脂质过氧化反应(图1E–1F和二烯丙基硫（一种选择性CYP2E1抑制剂）(图1E–1F，深灰色条），阻止细胞内H的增加2O（运行）2和O2 −分别为。二烯丙基硫处理下CYP2E1的水平和活性如插图所示。

促氧化剂增加KLF6完全主要在CYP2E1表达细胞中

添加两种前氧化剂（15μM甲萘醌或100μM百草枯），它们通过NAD（P）H醌氧化还原酶进行双电子还原，或添加CYP2E1诱导剂（100μMβ-萘黄素），可提高KLF6型完全Northern blot分析显示CYP2E1表达细胞中的表达约为1.9至4.8倍(图3A). 用甲萘醌进行时间进程实验，以确定最大诱导时间点（6–12 h，图3B). 甲萘醌对HCT116细胞（结肠癌细胞系）的治疗对KLF6型完全（未显示）。第二组实验是在其他促氧化剂如30μM AA、20μM H的存在下进行的2O（运行）2，15μM甲萘醌和AA+H的组合2O（运行）2以及AA加甲萘醌，剂量和时间不影响细胞活力（未显示）。有一个归纳KLF6型完全在所有这些处理下的表达，CYP2E1表达细胞比对照细胞更明显(图3C). 向AA处理的细胞中添加铁（脂质过氧化衍生反应的催化剂）进一步增加KLF6型完全表达式（未显示）。

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促氧化剂增加KLF6完全

用15μM甲萘醌、100μM百草枯或100μMβ-萘黄素重复处理CYP2E1表达细胞6 h（A）或使用15μM甲萘醌进行长达24小时的时程研究（B）和KLF6型完全通过Northern blot分析评估表达情况。（A）中未处理的细胞和（B）中显示任何信号的第一个时间点的值为1。用30μM AA、20μM H处理对照细胞和CYP2E1表达细胞2O（运行）215μM甲萘醌或AA加H的组合2O（运行）2和AA加甲萘二酮6小时KLF6型完全通过Northern blot分析评估表达情况。斑点下所示信号的量化为N个=2.未经治疗的对照组的信号被赋值为1（C）.

Pro-oxidants还增加CYP2E1-E表达细胞中的KLF6_V1和KLF6~V2 mRNA

为了在ROS之间建立联系，KLF6型完全用30μM AA或15μM甲萘醌孵育KLF6剪接变异体的表达以及ROS、对照和CYP2E1表达细胞对其可能的调节6小时KLF6型完全及其拼接形式KLF6_V1型和KLF6_V2型通过qRT-PCR分析(图4A-4B). 如果没有治疗，KLF6型完全,KLF6_V1型和KLF6_V2型在CYP2E1表达细胞中同样诱导(图4A-4B，白色条）。添加AA或甲萘醌进一步增加所有人的mRNA水平KLF6型主要在CYP2E1表达细胞中的同种型(图4A-4B，黑色条）。

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促氧化剂增加KLF6完全CYP2E1-表达细胞的拼接形式多于对照细胞

用30μM AA处理对照细胞和CYP2E1表达细胞（A）或使用15μM甲萘醌（B）持续6小时KLF6型完全及其拼接形式KLF6_V1型和KLF6_V2型通过qRT-PCR进行评估。结果表示为未经处理的对照组的倍数增加，数值为1（虚线），为平均值±SEM(N个=3; *P（P）<0.05, **P（P）<0.01和***P（P）治疗后<0.001与。控制和•P（P）<0.05, ••P（P）<0.01和•••P（P）CYP2E1表达细胞<0.001与。控制）。

NQO1或CYP2E1的抗氧化剂和抑制剂防止KLF6增加完全甲萘醌、百草枯和AA的拼接形式

对照细胞和表达CYP2E1的细胞在没有或存在抗氧化剂（过表达过氧化氢酶或SOD的腺病毒、2–10 mM谷胱甘肽乙酯（GSH-EE）和25μM维生素E）、促氧化剂（L-丁硫氨酸亚砜胺-一种GSH消耗剂-）的情况下，用0–15μM甲萘醌或0–100μM百草枯培养或NQO1抑制剂（25μM双香豆素）。添加抗氧化剂和NQO1抑制剂阻止了KLF6型完全甲萘醌和百草枯(图5A–5B). BSO对谷胱甘肽的消耗进一步提高了甲萘醌对KLF6型完全表达，而GSH-EE减弱了它(图5C). 此外，在不存在或存在CYP2E1抑制剂二烯丙基硫和抗氧化剂维生素E的情况下，用0-30μM AA培养细胞。AA增加了1.8倍和5.3倍KLF6型完全2.3倍和4.2倍KLF6_V1型以及2倍和3.7倍KLF6_V2型分别在对照细胞和CYP2E1表达细胞中(图5D，黑色条与.白色条）。二烯丙基硫阻止了这种增长(图5D，浅灰色条与。黑条）和维生素E(图5D，深灰色条与黑色条）或0.1 mM二乙基二硫代氨基甲酸钠，另一种CYP2E1抑制剂（未显示）。

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抗氧化剂、NQO1和CYP2E1抑制剂可防止KLF6的增加完全及其拼接形式

表达CYP2E1的细胞与15μM甲萘醌孵育（A）和100μM百草枯（B）在没有或存在表达过氧化氢酶或SOD、2–10 mM GSH-EE、25μM维生素E和25μM双香豆素的腺病毒的情况下。表达CYP2E1的细胞也在0–0.2 mM BSO存在下与15μM甲萘醌孵育（C）和Northern blot分析用于评估KLF6型完全表达式。未处理细胞的值为1。对照细胞和CYP2E1表达细胞与0–30μM AA在25μM维生素E或5 mM二烯丙基硫（DAS）存在下孵育6 h，并表达KLF6型完全及其拼接形式KLF6_V1型和KLF6_V2型通过qRT-PCR进行评估（D）。结果表示为未经处理的对照组的倍数增加，该对照组的数值为1（虚线），为平均值±SEM(N个=3; **P（P）<0.01和***P（P）<0.001（对于经AA-处理的与。控制，•P（P）<0.05, ••P（P）<0.01和•••P（P）CYP2E1表达细胞<0.001与。控制和■P（P）<0.05,■ ■P（P）<0.01和■ ■ ■P（P）联合治疗<0.001与。AA处理）。

KLF6型完全高CYP2E1乙醇喂养大鼠原代肝细胞的表达增加

由于酒精诱导的肝损伤部分由活性氧介导，我们将实验扩展到了从喂食对照组或乙醇Lieber-DeCarli饮食、体内已知主要通过CYP2E1诱导诱导氧化应激的模型。Lieber-DeCarli饮食是诱导早期酒精性肝损伤的一种非常成熟的方案(利伯，1999年)并导致中度脂肪变性(图6A，右侧面板），AST、ALT、血浆乙醇水平增加2倍，约120 mg/dL，非酯化脂肪酸增加5倍（未显示）。乙醇喂养大鼠肝细胞的氧化应激升高，如细胞内和细胞外TBARS、细胞内H2O（运行）2和谷胱甘肽水平(图6B-6D)通过CYP2E1表达(图6E). qRT-PCR分析显示诱导KLF6型完全乙醇喂养大鼠肝细胞和全肝(图6F). 从注射吡唑的大鼠分离的肝细胞中也获得了类似的结果，吡唑是一种已知可诱导CYP2E1水平的化学物质（未显示）。由于KLF6剪接尚未在大鼠中描述，因此未对剪接变体进行分析。

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乙醇喂养大鼠的原代肝细胞和肝脏KLF6表达增加完全

H&E染色（A）喂食对照Lieber-DeCarli饮食的大鼠显示出最小的脂肪变性（左），而喂食乙醇的Lieber-DeCarli食物的大鼠则显示出门脉周围和中央周围的微小和宏观囊泡脂肪变性（右）（原始放大倍数=200倍）。细胞内和细胞外脂质过氧化水平（TBARS）（B），细胞内H2O（运行）2 （C）和GSH（D）Western blot分析对照组和乙醇喂养大鼠肝细胞中CYP2E1的表达（E）.诱导KLF6型完全肝细胞和全肝中的表达（F）用qRT-PCR法测定了乙醇喂养大鼠的血清。结果表示为未经治疗的对照组的折叠增加，其值为1。在所有面板中，结果均为平均值±SEM(N个=6–10, *P（P）<0.05, **P（P）<0.01和***P（P）乙醇<0.001与。控制）。

应激激活激酶参与KLF6的上调完全表达式

确定应激敏感性激酶的激活与KLF6型完全表达时，我们添加了激酶磷酸化的特异性抑制剂。p38磷酸化抑制剂SB203580增加了KLF6型完全而MEK1/2磷酸化抑制剂PD98059或JNK磷酸化抑制剂SP600125显著降低KLF6型完全与对照组相比，在CYP2E1表达细胞中，在活性氧、应激激活激酶和KLF6型完全水平(图7A–7B). 此外，在30μM AA处理前2 h添加SB203580，进一步提高了KLF6型完全比AA介导的增加增加2.5倍，而SP600125、Wortmanin或PD98059未观察到任何附加效应(图7C).

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KLF6型完全应激激活激酶调节表达

对照细胞和CYP2E1表达细胞在p38（SB203580）、MEK1/2（PD95059）和PI3K（Wortmanin）磷酸化抑制剂存在下培养KLF6型完全通过Northern blot分析进行评估。未经处理的对照组被赋值为1（A）.qRT-PCR用于KLF6型完全在对照组和CYP2E1表达细胞中，用上述抑制剂孵育，并在没有抑制剂的情况下添加JNK磷酸化抑制剂SP60025（B）或存在30μM AA时（C）在所有面板中，结果表示为未经处理的对照细胞的倍数增加，数值为1，并参考平均值±SEM(N个=3; **P（P）AA-处理的<0.01与。控制，•P（P）<0.05, ••P（P）<0.01和•••P（P）CYP2E1表达细胞<0.001与。控制和■P（P）<0.05,■ ■P（P）<0.01和■ ■ ■P（P）联合治疗<0.001与。AA处理）。

KLF6_V1潜在下游靶点TNFα

确定KLF6或KLF6_V1型可能影响TNFα，TNFα在酒精性肝病和其他肝损伤模式中起关键作用，RAW 264.7细胞是一种小鼠巨噬细胞系，用−980-肿瘤坏死因子α启动子，然后与对照组共转染，KLF6型完全或KLF6_V1型siRNA。在一些实验中，用30μM AA转染细胞48小时后处理细胞3小时。评估转染效率，并将结果归一化为Renilla-Luc。转染KLF6_V1型siRNA导致未经处理的RAW细胞和AA处理的细胞内TNFα分别增加2倍和6倍(图8A)分泌的TNFα也略有增加(图8B); 因此，在KLF6_V1型氧化应激和TNFα。

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KLF6_V1消融上调AA存在下的TNFα

RAW 246.7巨噬细胞转染-982-肿瘤坏死因子α发起人。然后，与对照组进行联合转染，KLF6型完全或KLF6_V1型siRNA。在一些实验中，用30μM AA处理细胞3小时。转染48小时后，Luc活性通过转染效率校正，并用Renilla-Luc标准化（A）.通过ELISA测定各自上清液中分泌的TNFα（B）结果表示为平均值±SEM(N个=6;■P（P）<0.05,■ ■P（P）<0.01和■ ■ ■P（P）任何siRNA均<0.001与。控制和•P（P）<0.05, ••P（P）<0.01和•••P（P）<0.0 01 f或A A处理与。控制）。

讨论

在涉及酒精毒性的机制中，ROS的产生被认为是非常重要的，目前它是大量研究的中心。活性氧的产生，以及抗氧化防御受损，会影响基因转录和随后细胞靶点的激活。此外，多种细胞应激信号通路可以影响对ROS的反应，并决定蛋白质功能，最终决定细胞命运(Carreras和Poderoso，2007年). 因此，研究ROS对关键蛋白（如KLF6）诱导的影响及其潜在的下游靶点（如TNFα），有助于更好地理解酒精诱导的肝损伤和其他肝脏疾病的机制，并开发新的治疗策略。

定义活性氧对KLF6表达的影响完全由于CYP2E1是一种非偶联酶，可代谢酒精，因此即使在没有任何添加底物的情况下，也会产生氧化应激状态，因此我们使用了一种过度表达CYP2E1的永生HepG2细胞系，作为内源性ROS生成的来源。同时KLF6型完全及其剪接变体KLF6_V1型和KLF6_V2型与对照细胞相比，CYP2E1表达细胞中ROS与KLF6型完全表达和剪接。KLF6作为一种转录因子可能改变活性氧的产生就其本身而言被排除为转染含有编码KLF6型完全既不影响CYP2E1的表达，也不影响一氧化氮合酶2（NOS2）、GCLC、GCLM或过氧化氢酶。

接下来我们探讨了两种前氧化剂对诱导KLF6型完全mRNA。甲萘醌和百草枯是氧化还原循环化合物，通过NQO1进行双电子还原，生成与O反应的非烷基化代谢物2生产活性氧，主要是O2.−，H2O（运行）2，俄亥俄州−和OH。添加甲萘醌或百草枯诱导KLF6型完全mRNA和细胞色素P450诱导剂β-萘黄素一样。甲萘醌在结肠癌细胞株HCT116中也观察到类似的结果，这表明这些抗氧化剂的作用可能不仅限于肝脏。此外，作用机制不同的前氧化剂，如AA、H2O（运行）2而甲萘醌单独或联合添加，导致KLF6型完全信使核糖核酸主要在CYP2E1表达细胞中，而不是在相应的对照中，这表明促氧化剂就其本身而言（例如H2O（运行）2)通过CYP2E1代谢（例如AA、β-萘黄素）或通过NQO1代谢（例如甲萘醌和百草枯）增强KLF6型完全mRNA。此外，AA和甲萘醌不仅诱导KLF6型完全mRNA，但也触发了KLF6_V1型和KLF6_V2型mRNA，主要在CYP2E1表达细胞中，可能反映了转录效应，而不是增加选择性剪接。

从那以后在体外模型允许调节ROS水平，以验证ROS在调节中的作用KLF6型mRNA，接下来我们在抗氧化剂和特定活性氧来源的选择性抑制剂的存在下培养细胞。含有编码过氧化氢酶分解H的cDNA的腺病毒的转导2O（运行）2-或SOD1-歧化O2.−-或用维生素E治疗以阻止脂质过氧化引起的反应，部分阻止了KLF6型完全甲萘醌和百草枯的mRNA。同样，双香豆素（NQO1的抑制剂）减弱了甲萘醌和百草枯介导的作用。在含有维生素E或二烯丙基硫（CYP2E1抑制剂）的AA培养的细胞中观察到类似的结果，验证了CYP2E1在AA引发的转录效应中的作用KLF6型完全及其剪接变体。

细胞谷胱甘肽在防止细胞膜氧化性损伤方面发挥着重要作用，并作为谷胱甘肽过氧化物酶的氢供体，谷胱甘肽过氧化物酶是抵御脂质过氧化的防线。降低谷胱甘肽的药物，如L-丁硫氨酸亚砜胺，通过与蛋白巯基减少相关的氧化应激事件诱导细胞损伤。GSH的消耗增加了KLF6型完全mRNA合成甲萘醌。相反，使用GSH-EE恢复GSH池减缓了KLF6型完全甲萘醌的mRNA，表明两者之间存在直接联系KLF6型完全和GSH。甲萘醌可能会影响KLF6型由于GSSG氧化或蛋白巯基减少（可能是由于-SH基团的氧化），细胞内GSH储存耗尽，尽管也可能发生芳基化。KLF6–SH基团的氧化还原转变可能影响其活性和细胞功能。

作为第二种方法，我们随后将研究扩展到从喂食对照组或乙醇Lieber-DeCarli饮食（早期酒精诱导肝损伤模型）的大鼠中分离出的原代肝细胞。乙醇喂养大鼠肝细胞显示脂质过氧化增加，H升高2O（运行）2降低GSH，以及诱导的CYP2E1。KLF6型完全对肝细胞和全肝的mRNA进行分析，发现乙醇喂养大鼠的mRNA升高了约两倍。自KLF6型完全尚未描述大鼠进行选择性剪接，剪接变体未进行分析。KLF6型完全慢性乙醇喂养大鼠原代肝细胞中的上调可能反映了一种保护CYP2E1衍生氧化应激的适应性机制。可以假设，在酒精诱导的肝损伤中，由于CYP2E1上调和酒精代谢而发生氧化爆发，KLF6表达的调节有助于细胞防御。至少在人类中，KLF6的剪接可能是酒精诱导肝损伤的早期事件，导致KLF6表达的改变和蛋白激酶的激活，从而导致肝损伤和/或修复。除酒精性肝病外，KLF6还与非酒精性肝疾病相关(Starkel等人，2003年)和肝细胞癌(Sirach等人，2007b;Tarocchi等人，2011年;珍珍等，2011).

自KLF6型完全表达受到活性氧的调节，许多蛋白激酶在氧化应激条件下具有高度的响应性，我们研究了应激激活激酶在活性氧调节细胞凋亡中的作用KLF6型完全p38磷酸化抑制剂的添加增加KLF6型完全mRNA，而JNK或MEK1/2抑制剂减少KLF6型完全mRNA。自AA诱导以来KLF6型完全mRNA和p38磷酸化抑制剂SB203580已被证明可防止CYP2E1表达细胞中的AA毒性(Wu和Cederbaum，2003年)接下来，我们分析了p38磷酸化是否在调节中起作用KLF6型完全mRNA水平。添加AA前用SB203580培养细胞的时间进一步增加KLF6型完全mRNA水平，可能有助于细胞防御；当添加SP60025或PD98059时，JNK或MEK1/2磷酸化抑制剂几乎没有降低KLF6型完全mRNA表达。

由于TNFα在酒精性肝病中的重要作用，我们接下来研究了TNFα是否可以作为两种疾病的靶点KLF6型完全或KLF6_V1型氧化应激诱导的主要KLF6亚型。KLF6的拆卸完全α启动子反式激活略有降低，对AA的反应减弱。相反，KLF6_V1型消融增加了TNFα启动子的反式激活，AA进一步增强了其反式激活。这一发现表明TNFα可能是KLF6_V1的直接靶点。这些结果也在人星状细胞中得到了验证，星状细胞也有能力在肝损伤发作时产生TNFα（未显示）。总之，这些结果表明内源性ROS的几种来源增加KLF6型完全表达及其剪接变异体；因此，有助于调节关键下游靶点，如TNFα。

补充材料

补充图S1

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致谢

财政支持：拉奎尔·厄塔桑获得了纳瓦拉（西班牙）政府的博士后奖学金。Francisco Javier Cubero获得了教育和科学部（西班牙）的博士后奖学金（参考号EX2006-0070）。美国公共卫生服务局从国家酒精滥用和酒精中毒研究所（N.N.）拨款5R01 AA017733、5R01 IA017733-01S1、5P20 AA017067、5P20AA017067-01S1和5P20 IA017067-03S1。

作者非常感谢Arthur I.Cederbaum在本项目中的见解。我们要感谢斯科特·弗里德曼（Scott L.Friedman）及其实验室成员在一些实验中提出的建议以及为一些试剂提供的便利。

缩写

AA公司花生四烯酸
英国标准组织L-丁硫氨酸亚砜胺
第2页第1页细胞色素P450 2E1
DAS系统二烯丙基硫
谷胱甘肽谷胱甘肽
KLF6型类Krüppel因子6
KLF6_V1型KLF6变型1
KLF6_V2型KLF6变型2
MTT公司3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴
NEFA公司非酯化脂肪酸
NOS2号一氧化氮合酶2
NQO1号机组NAD（P）H醌氧化还原酶
多不饱和脂肪酸多不饱和脂肪酸
ROS公司活性氧物种
TBARS（待定）硫代巴比妥酸反应物质

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