ES细胞效力随内源性逆转录病毒活性波动

总结

合子及其子细胞具有全能性，因为它们能够发育成所有胚胎和胚外细胞类型^1，2。当这些前两个子细胞激活不同的基因表达模式，首先将其导向三个广泛谱系之一：Oct4/Sox2/Nanog时，其子代的命运逐渐受到限制⁺产生胚胎的外胚层细胞，Gata4/6⁺形成包裹胚胎的胚外膜的原始内胚层细胞，以及Cdx2⁺构成胎盘大部分的滋养层细胞^三这些早期细胞命运的决定代表了哺乳动物进化的一个重大且相对较新的进展，其中支持胎儿宫内营养的胎盘和胚胎外组织允许在出生前进一步发展。合子的表观遗传景观在第一次细胞分裂期间发生显著变化。受精后不久，卵母细胞母细胞转录物被通过激活合子基因组转录产生的新合成RNA所取代^4——6合子及其子细胞的独特转录谱定义了细胞全能的短暂时期。

小鼠ES细胞是从胚泡的内细胞团（ICM）中分离出来的，这些胚泡已经成为滋养层的一个独立谱系^7，8ICM衍生的ES细胞被视为多能干细胞，因为它们具有生成胎儿组织的能力，但在胚胎外组织定植方面效率极低⁹胚胎干细胞对胚外组织的罕见贡献可以解释为胚胎干细胞培养物被滋养层或原始内胚层提交细胞污染，也可以解释为罕见的胚胎干细胞获得了除胚胎组织外生成胚外组织能力。后一种可能性很有趣，因为最近的证据表明ES培养物是亚稳细胞的异质混合物，基因表达波动，如Zscan4公司，斯特拉，纳克，Sox17系列和Gata6公司，可以解释单个细胞的特殊属性^10——14.

合子基因组首次转录时，会表达大量的逆转录转座子，包括内源性逆转录病毒（ERV）、LINE-1元件和非自主SINE元件¹⁵在2C期，MuERV-L/MERVL逆转录病毒样元件瞬时失表达，产生3%的转录mRNA^15——17在2C期后，MERVL-retroelement表达沉默^18，19我们发现，MERVL表达的这种调控模式与100多个2C以上的特异性基因重叠，这些基因与这些外来逆转录病毒的调控元件共同作用以启动其转录。我们利用这些2C病毒衍生启动子的调节活性来标记细胞，发现ES和iPS培养物中都含有少量但相对恒定的进入2C转录状态的细胞。这些2C样细胞的纯化表明，它们具有独特的发育特征，并能有效地为胚外和胚胎谱系产生后代。

ES培养物中类2C状态的鉴定

为了鉴定合子激活基因，我们对小鼠卵母细胞和2C期胚胎进行了深入的RNA测序。通过对这些细胞中转录物的比较，确定了大量在2C胚胎中表达的基因和反转录转座子，以及大量下调的转录物(图1a，补充表1). 最活跃的重复序列是逆转录病毒MERVL家族及其相应的长末端重复序列（LTR）启动子（Mt2_mm），其激活倍数超过300倍(补充表1). 序列比对显示，近700份MERVL元件中超过25%被激活，307个基因产生了与MERVL元素连接的嵌合转录物(图1a，补充表2)，包括之前描述的10个¹⁵在生成的626个嵌合转录物中，>90%是产生开放阅读框（ORF）的5’LTR-外显子融合，表明这些LTR已成为蛋白质编码基因的功能启动子(图1b，补充图1a). 代表这些嵌合蛋白的最丰富的基因本体分类是转录调控、离子结合、翻译、核苷酸结合和mRNA转运(图1c). 利用MERVL-LTR交替启动子的两个显著转录因子是Gata4公司和撕裂4，分别是原始内胚层和滋养层的重要规范因素^20——22.

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图1

MERVL逆转录病毒及其LTR驱动的一名记者标志着2C状态

a、，卵母细胞与2C胚胎基因表达的比较。产生MERVL连接的基因显示为红色/绿色，红色的基因表示表达发生显著变化。b、，预测的MERVL连锁嵌合转录物的ORF状态。c、，MERVL相关蛋白编码转录物的GO分析。显示了来自10个最丰富GO类别的基因数量。d-e、，将2C（d）和囊胚（e）混合，并用MERVL-Gag和Oct4抗体进行免疫染色。比例尺20μm。f、，Zygote注射了2C:：番茄转基因，并允许发育在体外成像前48小时。比例尺50μm。克，2C:：番茄⁺免疫荧光检测ES细胞表达MERVL-Gag蛋白。比例尺50μm。小时，微阵列分析2C:：番茄⁺与。^负极细胞。红色表示基因的表达变化超过4倍。我，2C:：番茄⁺/MERVL-Gag公司⁺通过免疫荧光测定，ES细胞和iPS细胞缺乏Oct4蛋白。标尺20μm

由于近700份MERVL内源性逆转录病毒中有300多份仍编码Gag病毒蛋白，我们对2C和早期囊胚胚胎进行染色，以确认病毒Gag是表达和发育调控的。我们发现2C胚胎表达Gag但缺乏多能性标记Oct4，而囊胚细胞缺乏Gag但表达Oct4(图1d–e). 因此，MERVL的活性受到发育调控，许多细胞基因都选择了这些逆转录病毒启动子来严格控制其表达。

接下来，我们询问是否可以使用MERVL元件的调控序列来标记2C细胞。我们克隆了MERVL 5'LTR、引物结合位点和Gag基因上游的一部分串联型荧光报告基因(2摄氏度∷番茄). 我们给受精卵注射了2摄氏度∷番茄番茄培养过程中表达的构建与监测在体外番茄的表达在停滞的合子和2C胚胎中最高，并在桑椹胚期下调(图1f，补充电影1). 有趣的是，当我们介绍2摄氏度∷番茄构建成ES细胞并选择克隆稳定的整合子，我们发现在缺乏报告基因表达的细胞中，有几个克隆含有1–5个用番茄强烈标记的细胞(图1g). 重要的是，我们还发现罕见的ES细胞表达MERVL mRNA和Gag蛋白，这些与2摄氏度∷番茄⁺单元格(图1g，补充图1b–c). The correspondence between the2摄氏度∷番茄通过免疫印迹和EM成像进一步证实了MERVL在番茄内质网内编码的病毒ε颗粒⁺细胞而不是番茄^负极单元格(补充图1d，e). 因此MERVL表达式受到限制体内到1-4C胚胎，并在一小群来自囊胚的ES细胞中重新激活。

描述意外情况2摄氏度∷番茄-ES培养物中的标记细胞我们将番茄分类⁺和番茄^负极并进行微阵列和mRNA序列分析(图1h，补充表3-5). 番茄⁺细胞表达的MERVL转录水平是番茄的55倍^负极但绝大多数其他反转录转座子未受影响(补充表3). 引人注目的是，番茄⁺与番茄相比，细胞有165个转录物激活4倍以上，零个基因被抑制4倍以上^负极单元格(图1h，补充表4，补充图2a-f). 在番茄中高度富集的基因中⁺细胞，其中一些细胞以前被证明仅限于2-4C发育阶段，包括Zscan4公司，Tcstv1/3型，Eif1a公司，Tho4号机组(Gm4340型)Tdpoz（吨/盎司）、和兹夫普352^23——25共有525个基因在2摄氏度∷番茄⁺细胞也是在2C期激活的基因，包括52个产生与MERVL元件相关的嵌合转录物的基因(补充表6-7).

ICM和ES细胞的一个特征是其Oct4、Sox2和Nanog的表达，而全能2C胚胎不表达Oct4(图1d–e). 我们发现了2摄氏度∷番茄⁺ES培养物中的细胞也缺乏Oct4、Sox2和Nanog(图1i，补充图1f). Oct4、Sox2和Nanog蛋白标记减少，尽管它们的mRNA水平发生了变化，表明调控是在转录后发生的(图1h，补充图2g). 总之，2摄氏度∷番茄标记一组与2C胚胎具有转录和蛋白质组特征的ES细胞，并显示出与培养的大多数ES细胞截然不同的多能性标记模式。

ES细胞在2C状态下循环

我们考虑了以下可能性：2摄氏度∷番茄ES培养物中散发细胞中的报告蛋白和MERVL-Gag蛋白可能是由滋养层或原始内胚层污染引起的。为了排除这种可能性，我们检测了来自小鼠成纤维细胞的诱导多能干细胞（iPS），因为它们不应受到胚泡胚胎细胞的污染。与ES细胞类似，我们发现散发的iPS细胞表达MERVL-Gag蛋白，但缺乏Oct4(图1i). 因此，ES培养物中的异质性是与iPS培养物共有的特性，不太可能由细胞污染物引起。

接下来，我们检查了2摄氏度∷番茄⁺细胞代表一个稳定的细胞群，或者ES细胞是否进入或退出这种2C样状态。我们利用Cre-LoxP命运定位策略对表达2C基因的细胞进行不可磨灭的标记(补充图3a–c). 我们利用MERVL调节元件驱动三苯氧胺诱导的Cre重组酶的表达，建立了转基因小鼠系(2摄氏度∷ERT2核心ERT2，补充图3a). 然后将这些小鼠与Cre应答报告系交配(ROSA公司∷LSL番茄和ROSA公司∷LSL-LacZ公司，补充图3b). ES细胞系来源于双阳性转基因囊胚(补充图3c). 在ES培养基中加入4羟基三苯氧胺（4OHT）后，我们检测到MERVL-Gag中的核Cre表达⁺单元格(补充图3d). 当ES培养物用4OHT培养2-6天时，我们发现报告阳性细胞的百分比稳步增加(图2a). 值得注意的是，几乎每一个ES细胞都通过超长的通道激活了报告者(图2b)，表明ES细胞有规律地进入这种瞬态。

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图2

2C表观遗传状态是短暂的，在ES培养的大多数细胞中，随着传代的增加，2C表生状态被激活，并受细胞内外因素控制

a、，，FACS分析2C:：ERT2-Cre-ERT2，ROSA LSL:：番茄在4OHT存在下，ES细胞的传代增加。番茄的百分比⁺显示单元格。b、，2C:：ERT2-Cre-ERT2，LSL:：LacZES细胞在4OHT存在下培养，在增加传代时，细胞被固定，用抗β-半乳糖苷酶抗体进行免疫染色，并用DAPI进行复染。比例尺50μm。c、，2C:：番茄⁺和^负极48小时后，在成像前用流式细胞仪收集细胞并进行电镀。比例尺50μm。日期：，2C:：番茄ES细胞在20%O中培养₂（常氧）或5%O₂（缺氧），以及番茄的百分比⁺细胞经流式细胞仪检测。误差线代表s.d.，n=3e、，2C:：番茄将指定传代的ES细胞在含有15%胎牛血清（FCS）、20%敲除血清替代物（KOSR）或含有3mM GSK3β和MEK抑制剂（2i）的N2B27培养基中培养48小时，然后计算细胞百分率2C:：番茄⁺FACS的单元格。误差线表示s.d.，n=3。

监测2摄氏度∷番茄⁺和^负极我们用流式细胞术收集番茄细胞⁺和番茄^负极细胞。当培养这些纯化的亚群时，我们发现番茄⁺番茄细胞生产^负极单元格，反之亦然(图2c). 24小时内，约50%的番茄⁺细胞转化为番茄^负极，与两个细胞群的起始百分比无关(图2c和数据未显示）。低氧条件下（5%O₂)，表达2摄氏度∷番茄报告基因减少，这可以通过将培养物移回20%O来逆转₂(图2d). 我们还发现，在48小时“基态”介质条件下（2i-media²⁶)减少但没有消除番茄的存在⁺细胞相对于含有敲除血清置换（KOSR）的培养基，表明外源和内在机制调节MERVL/2C基因网络(图2e).

组蛋白修饰调节2C-ES开关

在小鼠发育过程中合子基因组激活后，组蛋白脱乙酰化和组蛋白H1合成导致抑制性染色质的形成，这被认为限制了2C胚胎中存在的广泛转录模式^27，28.使用间接免疫荧光法，我们发现番茄⁺细胞的活性组蛋白标记水平明显较高，包括组蛋白3赖氨酸4（H3 K4）的甲基化和H3和H4的乙酰化(补充图4a)，一项通过分类细胞群的免疫印迹分析证实的发现(图3a). 这种染色质镜出现在两个细胞胚胎中²⁸接下来我们测试了番茄是否⁺与未标记的ES细胞相比，这些细胞的DNA甲基化水平不同。我们发现番茄中的MERVL序列发生了低甲基化⁺细胞与番茄的比较^负极细胞。与MERVL序列相反，IAP逆转录病毒在两个番茄中都高度甲基化⁺和番茄^负极表明甲基化模式改变的细胞在基因组中并不一致(补充图4b). 总之，这些数据表明，当ES细胞（再）进入2C状态时，它们的染色质和DNA会发生改变，以有利于转录的方式反映出双细胞胚胎。

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图3

2C状态与活跃的表观遗传特征相关，并被抑制性染色质修饰酶拮抗

a、，2C:：番茄⁺和^负极通过FACS收集细胞，并使用指示的抗体进行免疫印迹分析。b、，激活基因数量的成对比较卡普1，G9a公司、和丹麦马克1a突变的ES细胞与2C胚胎中激活的基因进行比较。c、，突变等位基因纯合的ES细胞系丹麦马克1a，卡普1、和G9a公司用MERVL-Gag抗体对相应的野生型ES株进行免疫染色，并用DAPI进行复染。比例尺50μm。日期：，2C:：番茄ES细胞在成像前用40nM TSA处理24小时。比例尺50μm。e、，丹麦马克1aFl/Fl，Cre-ERT ES细胞包含稳定整合的2C:：番茄用载体或4OHT处理转基因，并用FACS计数番茄的百分比⁺细胞。f中，2C:：番茄;丹麦马克1aFl/Fl，Cre:ERT ES细胞用4OHT或载体处理24小时，然后传代72小时，然后用FACS收集番茄阴性细胞。番茄的百分比⁺在培养时间增加后绘制细胞图。误差线表示s.d.，n=3。

我们之前证明，在没有组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶的情况下，MERVL和2C特异性基因增加Lsd1/Kdm1a²⁹为了测试其他前病毒共抑制因子和组蛋白修饰酶是否也影响这些基因，我们分析了KRAB盒相关转录抑制因子中纯合突变ES细胞的转录组卡普1组蛋白H3 K9甲基转移酶G9a公司^29——31我们发现MERVL和一些2C基因在丹麦马克1a，卡普1、和G9a公司突变ES细胞(图3b，补充图5b–c，补充表7). 这些发现通过使用就地杂交和免疫荧光显微镜(图3c，补充图5d). 治疗2摄氏度∷番茄组蛋白脱乙酰酶抑制剂TSA的ES系也增加了番茄的数量⁺单元格四倍(图3d). 为了更好地理解染色质阻遏物被剧烈消除时2C基因调控是如何被控制的，我们利用了一个稳定的整合2摄氏度∷番茄ES系是纯合子的floxed等位基因丹麦马克1a并含有一个可被4OHT激活的Cre-ERT转基因。删除后24小时内丹麦马克1a我们发现番茄的含量增加了十倍⁺稳定维护的细胞(图3e). 此外，FACS纯化番茄^负极细胞更快地变成番茄⁺在没有丹麦马克1a(图3f)，并在此状态下停留更长时间(补充影片2–3). 这些发现表明，Kdm1a、Kap1、G9a和组蛋白去乙酰化酶都有助于抑制ES细胞中的2C基因，并且它们通过改变细胞间的平衡来发挥作用2摄氏度∷番茄⁺和^负极州。

2C样ES细胞具有更大的命运潜能

由于ES培养物中的2C样细胞表达全能性卵裂球中发现的高水平2C限制性基因，并且多能性相关蛋白水平降低，我们推断ES细胞的这一亚群可能具有不同的功能特征。我们测试了2摄氏度∷番茄⁺细胞已经获得了产生胚胎外组织的能力，而胚胎干细胞缺乏这种能力。我们用FACS收集番茄⁺和番茄^负极来自的单元格2摄氏度∷番茄ES系并将四个细胞注入桑椹胚期胚胎。西红柿^负极分析的所有5个嵌合体囊胚的ICM都是由专门参与ICM的细胞构成的(图4a). 相反，西红柿⁺除了ICM（在5个嵌合胚胎中的3个）外，滋养层细胞（在5个中的4个嵌合胚中）也是由细胞组成的(图4a). 追踪2C番茄的命运⁺胚胎干细胞发育后期，我们将囊胚注入番茄⁺或者番茄^负极预先感染由组成活性Ef1a启动子编码GFP的慢病毒的细胞(Ef1a公司∷GFP公司). 番茄^负极/GFP公司⁺细胞只对胚胎组织有贡献，而番茄⁺/GFP公司⁺细胞参与胚胎内胚层、外胚层、中胚层、生殖谱系以及卵黄囊和胎盘(图4b–c，补充图6a–b). 番茄的胚外贡献⁺/GFP公司⁺细胞包括胎盘的滋养层巨细胞(图4c). 因此2摄氏度∷番茄⁺细胞包括胚胎组织和胚外组织，而培养的大多数ES细胞仅限于产生胚胎细胞类型。

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图4

2C状态的激活与嵌合体胚胎向胚外谱系的潜能扩大有关

a、，2C:：番茄⁺或2C:：番茄^负极将CMV：：GFP ES细胞注射到桑椹期胚胎中，然后进行生长在体外对所产生的囊胚进行成像，以可视化注射细胞在滋养层（TE）或ICM中的位置。比例尺20μm。b、，2C:：番茄⁺或2C:：番茄^负极，Ef1a:：GFP⁺将细胞注射到囊胚中，然后将其植入假孕雌性体内，以生成嵌合体胚胎。箭头表示2C:：番茄⁺、GFP⁺卵黄囊和胎盘的细胞。c、，2C:：番茄⁺，Ef1a:：GFP⁺细胞有助于胚胎内胚层、中胚层、外胚层、卵黄囊、胎盘组织（包括滋养层巨细胞-白色箭头）和原始生殖细胞（PGC，用红色、蓝色箭头标记的抗Ddx4抗体）。比例尺表示500uM（内胚层、中胚层、外胚层、卵黄囊）或50um（胎盘和PGC）。日期：，杂合（+/GT）或纯合（GT/GT）丹麦马克1a-将geo-genetrap ES细胞注射到野生型囊胚中，将其植入假孕雌性体内。从嵌合体胚胎中分离出胚胎（E）和胚外（X）组织，并使用地缘引物进行半定量PCR，以确定注入细胞对这些谱系的相对贡献。误差条代表标准误差。e、，1:1的混合物丹麦马克1a将Fl/Fl和KO/KO ES细胞联合注入野生型囊胚。在E12.5，从胎盘（P）、卵黄囊（Y）和羊膜（A）分离嵌合体胚胎组织（E），并进行PCR，以检测注射细胞相对于常驻注射胚胎WT等位基因的FL和KO等位。F、，丹麦马克1a燃气轮机/燃气轮机，Ef1a:：GFP⁺细胞有助于胚胎内胚层、中胚层、外胚层、卵黄囊、胎盘组织（包括滋养层巨细胞-白色箭头）和原始生殖细胞（PGC，用红色、蓝色箭头标记的抗Ddx4抗体）。比例尺表示500uM（内胚层、中胚层、外胚层、卵黄囊）或50um（胎盘和PGC）。

接下来我们检查了丹麦马克1a突变ES系，包含更高频率的2摄氏度∷番茄⁺在小鼠嵌合体分析中，细胞的效力也有所提高。正如预期，丹麦马克1a杂合子ES细胞只对胚胎组织有贡献（在5/5嵌合体胚胎中），但从未对胚外组织有贡献(图4d). 相反，丹麦马克1a纯合突变型ES细胞同时产生胚胎（4/6嵌合胚胎）和胚外组织（5/6嵌合胚）(图4d). 确认丹麦马克1a突变ES细胞，我们使用竞争嵌合体分析。我们共同注射了1:1的丹麦马克1aFl/Fl和KO/KO ES细胞分化成5个野生型胚泡。然后用PCR检测丹麦马克1a解剖组织中的Fl/Fl或KO/KO细胞。我们检测到丹麦马克1a胚胎组织和羊膜中的Fl/Fl ES细胞，但卵黄囊或胎盘中没有(图4e). 相反，丹麦马克1a突变的ES细胞有助于胚胎组织、羊膜、卵黄囊和胎盘组织，包括滋养层巨细胞和PGC(图4e–f). 因此，通过去除丹麦马克1a与命运潜能的扩大有关。

我们已经证明了这一点2C：番茄⁺ES培养物中的细胞具有更强的效力，但尚不清楚进入这种状态是否对其长期多能性至关重要。为了测试这种可能性，我们用白喉毒素（DTA）进行基因消融，连续去除2C样ES细胞。我们通过交叉生成ES线2摄氏度∷ERT2核心ERT2老鼠(补充图3a)带有Cre应答DTA等位基因(ROSA公司∷LSL-DTA公司)用4OHT处理ES线20次(补充图7a). 我们发现这些2C-缺失ES培养物仍然能够产生高贡献嵌合体(补充图7b)尽管它们的分化偏向于中胚层和外胚层谱系在体外(补充图7c). 这些数据表明，偶尔进入2C样状态可能有助于保持ES细胞广泛的胚胎命运潜能。

讨论

在哺乳动物的发育过程中，合子及其子代细胞从能够产生整只小鼠的全能细胞发展到桑椹胚的更具谱系限制的内部和外部细胞，分别能够产生胚胎谱系或胚胎外谱系。全能细胞的一个关键转录特征是合子基因组开始激活，胚胎从母体转录组转换为合子转录组。为了标记胚胎发育早期阶段的细胞，我们利用内源性逆转录病毒MERVL的调节元件生成了一份报告，该病毒高度限制在合子/2C阶段。令人惊讶的是，我们发现罕见的ES和iPS细胞表达了该报告人。当我们对这些细胞进行特征分析时，我们发现它们缺乏多能性蛋白Oct4、Sox2和Nanog的表达。相反，这些罕见的细胞表达了大量限制在2C期的基因，最重要的是，它们能够形成胚胎和胚外谱系(图5a–b). 我们的研究在ES培养物中发现了一种罕见的2C样细胞，它具有扩大的命运潜力。

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图5

MERVL-LTR连接的2C基因网络在调节胚胎潜能中的作用模型

a、，在合子基因组激活过程中，利用MERVL-LTR作为启动子的基因网络被激活。这一阶段与卵裂球全能期相关。随着发育的进展，当ICM与TE和PrE分离时，MERVL-LTR连接的2C基因网络被染色质阻遏物沉默。b、，在胚胎干细胞从囊胚中分化出来的过程中，一种罕见的暂时性细胞群被标记为2C:：番茄报告者表达高水平的2C基因和低水平的多能性标记。在小鼠嵌合体分析中，这些细胞有助于胚胎和胚外组织（以绿色显示）。增加ES培养物的氧化张力或抑制组蛋白修饰酶的缺失/抑制会改变2C和ES状态之间的平衡。

虽然还不清楚MERVL和其他2C基因是如何调节效力的，但一些证据表明，2C样细胞是ES培养物健康和维持所必需的。首先，我们发现随着传代的增加，几乎所有细胞都进入2C样状态。其次，当我们从细胞培养物中去除2C-like ES细胞时，我们发现它们的分化特征发生了改变，产生了更多的外胚层和中胚层衍生物。第三，功能研究Zscan4公司该基因与全长MERVL元件相邻，在2C｜番茄⁺细胞，表明它是ES培养物中维持端粒所必需的¹⁴¹⁴另一个仍然存在的重要问题是，这些特殊ES细胞的选择是否可以用于实际目的，例如重新编程体细胞核。这一观点得到了以下发现的支持：2C基因在克隆胚胎中没有被正确激活，组蛋白脱乙酰化酶和Kdm1a的抑制可以提高重编程效率，后者抑制2C状态^32，33，34因此，一个或多个MERVL连锁2C基因的过度表达或其他2C-基因阻遏物的抑制可能是促进重编程的有用策略。最近的研究结果支持了这种可能性，即成纤维细胞中强制表达Zscan4可以提高其iPS重编程效率³⁵.

转座因子是进化的主要驱动力。我们的发现支持了这样的观点，即细胞基因对逆转录转座子元件的协同作用可以作为协调连接许多基因表达的进化机制^15，29，36最近研究表明，转座子序列在胚胎干细胞和子宫内膜的基因调控网络重组中起着关键作用，而这些基因调控网络对哺乳动物妊娠的进化起着重要作用^37，38也有人推测，ERV通过提供适合合胞体滋养层细胞形成的融合包膜基因，在胎盘的进化中发挥作用³⁹我们认为ERVL元素存在于所有胎盘哺乳动物中⁴⁰，可能在哺乳动物早期发育中发挥了同样重要的基因调控作用，通过促进细胞类型的规范化和导致胎盘组织的形成。

方法总结

2C｜番茄通过消化MERVL LTR-Gag克隆#9而产生²⁹与MluI和HindIII，产生MERVL LTR 1-730，并在去除CMV启动子的情况下连接到pcDNA3湿番茄。为了产生2C｜番茄ES细胞，丹麦马克1a飞行/飞行；Cre:ERT ES细胞转染2CŞ番茄使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）和150ug/ml潮霉素筛选7天。含有番茄的菌落⁺然后挑选细胞并使其扩增。2C｜ERT2-Cre-ERT2通过使用EcoR1和Not1位点用ERT2-Cre-ERT2插入物代替tdtomato而产生。将DNA与Mlu1和AvrII位点线性化，然后注射到胚胎中生成转基因小鼠。结果小鼠与ROSA｜LSL-番茄小鼠（JAX 007905），ROSA｜LSL-DTA鼠标（JAX 010527），或ROSALSL-LacZ小鼠（安德森实验室的礼物）和ES系是使用标准程序衍生的。丹麦马克1a燃气轮机/燃气轮机，丹麦马克1aFl/Fl、KAP1 ES3 Cre和G9A TT2 ES细胞如前所述^29——31在使用Tru-Seq RNA样品制备试剂盒（Illumina）构建文库之前，通过在Prelude直接裂解缓冲液（Nugen）中裂解一窝胚胎（5-10个胚胎）并使用Ovation RNA-Seq系统（Nugen）扩增RNA，从卵母细胞和2C胚胎中提取RNA-Seq。按照说明进行微阵列、QRT-PCR、免疫染色和嵌合体小鼠注射²⁹.我们根据索尔克研究所的IACUC指南进行的所有动物实验。

完整的方法

补充材料

致谢

脚注

工具书类