结果
过氧化物酶体的自噬分解需要Atg36
酿酒酵母Pex3是一种膜蛋白，具有一个短的管腔N末端，其后是一个跨膜段和一个细胞溶质域（残基40–441）(Hohfeld等人，1991年). 我们对酵母细胞溶质结构域进行了双杂交筛选酿酒酵母Pex3并鉴定出一种新的非特征性蛋白质，由YJL185c型，作为潜在的Pex3相互作用蛋白。我们已经将这个基因命名为自动液位计36.自动液位计36编码一个没有很好保存的34-kDa蛋白。使用BLASTP搜索，我们在酵母菌科物种，包括鲁西酵母({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“CAQ43500”，“term_id”：“186703811”，“term_text”：“CA Q43500“}}CAQ43500卡),棉蚜Ashbya gossypii({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“NP_984715”，“term_id”：“45190461”，“term_text”：“NP_9847十五”}}NP_984715),兰蔻属耐热菌（XP-002554387）和多孢范德瓦尔托兹马（XP-001646846）。
为了研究Atg36在过氧化物酶体生物发生中的可能功能，我们比较了第36页Δ细胞与WT细胞形成过氧化物酶体并在细胞分裂期间将其分离的能力。附加有过氧化物酶体靶向信号1型（GFP–PTS1）的GFP在翻译后导入过氧化物质体，在缺乏过氧化物酶或管腔蛋白导入缺陷的细胞中观察到细胞溶质标记。当导入完整时，GFP–PTS1导入代表单个过氧化物酶体或小簇过氧化物酶体的点。细胞中过氧化物酶体的数量反映了过氧化物酶的形成过程以及调节过氧化物质体数量的机制，包括降解和分离。穿孔在母芽之间的相对分布是衡量细胞分裂过程中过氧化物酶体分离的一个指标。
过氧化物酶体数量增加第36页大多数生长条件下的Δ细胞(补充图S1A和B）。通过将细胞从过氧化物酶体增殖状态（油酸盐培养基）切换到葡萄糖饥饿培养基（SD-N），这是一种诱导pexophage的状态，可以最好地说明这种增加。在WT细胞中，过氧化物酶体数量显著减少，而过氧化物酶数量在第36页Δ单元。
然而，在对数相条件下，在葡萄糖培养基上的长时间生长会导致过氧化物酶体数的正常化(补充图S1B). 这清楚地表明复制过氧化物酶体增殖不受影响。在所有测试的生长条件下，母细胞和子细胞都含有过氧化物酶体，表明分离不受影响。自第36页Δ细胞在油酸盐上正常生长(补充图S1C)过氧化物酶体功能未受到严重影响。这表明β-氧化机制被正确诱导，过氧化物酶体正常增殖以响应油酸盐。事实上，油酸盐诱导的Pex11水平与WT细胞中的水平相当。灯具标记GFP–PTS1的导入不受影响。
日志后阶段和氮保存的发现第36页Δ细胞过氧化物酶体数量增加表明，过氧化物酶体周转可能需要Atg36。我们使用生化和基于显微镜的pexophagy分析进一步研究了这一表型。生化分析测量从自身启动子表达的Pex11的降解，并在其C末端标记GFP。Pex11是最丰富的PMP，由油酸盐诱导。Knoblach和Rachubinski（2010）研究表明，在油酸盐培养基上生长期间，小部分Pex11定位于外周内质网，随后在细胞切换到葡萄糖培养基时转移到过氧化物酶体。我们发现在葡萄糖培养的细胞中，Pex11–GFP与HcRed–PTS1共定位。在油酸盐培养过夜的细胞中，Pex11–GFP标记的过氧化物酶体趋向于某种程度的聚集，尽管即使在这种情况下，重叠几乎是完全的，只是偶尔有含有Pex11-GFP的膜延伸物不含HcRed–PTS1(补充图S1E). Pex11单体GFP也会发生这种聚集(补充图S1D). 将Pex11–GFP标记的细胞从油酸盐培养基切换到SD-N培养基可恢复两个过氧化物酶体标记的完全重叠：切换3小时后，大多数簇状结构消失，出现点状结构，液泡的一些微弱标记变得明显(补充图S1E). 22小时后，WT细胞中过氧化物酶体数量进一步减少，空泡标记清晰(). 这表明Pex11–GFP可以作为过氧化物酶体降解的标记物。WT细胞中的液泡标记与GFP的出现相对应，GFP是Pex11–GFP的蛋白酶抗性分解产物(). 在WT细胞中，这种分解产物在饥饿培养基上6小时后明显可见，而在第36页Δ和atg1处Δ细胞，过氧化物酶体保持完整()Pex11–GFP在饥饿培养基上22小时后仍保持稳定().
吞咽pexophagy需要Atg36。验证Pex11–GFP作为WT中pexophagy的标记物，atg1处Δ，以及第36页Δ单元格依据(A类)显微镜和(B类)western blot包括聚乙烯14Δ单元。荧光分析显示，与HcRed–PTS1、Pex11–GFP一样，GFP在饥饿培养基的液泡中积累(A类)对应于GFP在western blot上的积累(B类). (B类)细胞在油酸盐培养基中培养18小时，并切换到缺乏氮的葡萄糖培养基（SD-N），达到指定的时间。GFP*表示相对抗蛋白酶降解产物，表明液泡破裂。(C类)通过GFP–PTS1的荧光进行Pexophagy分析CTA1公司WT中的启动子，第36页Δ,atg1处Δ，以及pep4-3，prb1-1122菌株。按照上述方法培养细胞进行Pex11–GFP噬菌体测定，并在SD-N培养基中培养22小时后成像。在中获取了多个荧光图像Z轴-轴并展平为单个图像。亮场图像是一个平面。(D类)FM4-64中生长的细胞标签(C类). The three central images of aZ轴-烟囱被压平成一个平面。亮场图像是一个平面。棒材，5μm。(E类)通过在葡萄糖、油酸盐或甘油培养基中培养3天的细胞的Pex11–GFP western blot检测Pexophagy。WT电池样品（左侧面板）和第36页24、48和72小时后从培养物中取出Δ细胞（右侧）。
我们测试了一系列突变体在饥饿条件下诱导Pex11–GFP分解的能力。免疫印迹法pex1型Δ,pex2Δ,聚乙烯4Δ,pex5Δ,聚乙烯x6Δ,pex7型Δ,聚乙烯10Δ,聚乙烯11Δ,聚乙烯12Δ,聚乙烯13Δ,聚乙烯14Δ,聚乙烯15Δ,聚乙烯17Δ,聚乙烯18Δ,pex22型Δ,聚乙烯25Δ,聚乙烯27Δ,聚乙烯28Δ聚乙烯29Δ,聚乙烯30Δ聚乙烯31Δ聚乙烯32Δ,聚乙烯34Δ,djp1型Δ,inp1型Δ,inp2合金Δ,像素1Δ,像素2Δ，以及蚂蚁1Δ细胞显示，所有这些突变体都形成了典型的Pex11–GFP分解产物（数据未显示）。令人惊讶的是，pexophagy在聚乙烯14Δ电池().
我们还使用了从过氧化物酶体过氧化氢酶基因油酸诱导启动子表达的GFP–PTS1(CTA1公司)监测pexophagy(). 荧光点的减少和液泡状GFP信号的出现，如上文对Pex11–GFP和HcRed–PTS1所见，表明WT细胞中存在pexophagy。过氧化物酶体在atg1处Δ和第36页Δ细胞，以及第4-3页,prb1-1122号许多液泡水解酶未能被激活的细胞。用FM4-64确认了液泡室的身份() (Vida和Emr，1995年). 因此，western blot检测的嗜酸粒细胞与显微镜检测的嗜酸性粒细胞相关。
如上所述，过氧化物酶体在日志后阶段葡萄糖生长时数量更多第36页Δ细胞与WT细胞相比，表明日志后细胞中过氧化物酶体降解也依赖于Atg36。为了验证这一点，我们在葡萄糖、甘油或油酸盐培养基中连续培养表达Pex11–GFP的细胞3天，并通过免疫印迹法每隔24小时监测一次pexophagy。我们发现在所有这些条件下都会发生pexophage，并且在所有病例中Atg36依赖性().
线粒体吞噬、Cvt途径或非特异性大自噬不需要Atg36
为了测试Atg36的需求是否特定于pexophagy，我们检测了其他类型自噬的功能第36页Δ细胞。
通过标记物Ape1–GFP在液泡中的积累来检测Cvt途径。此路径在第36页Δ电池(). 细胞在甘油中生长72小时后，通过线粒体外膜标记物OM45–GFP的降解来测量细胞的吞噬能力(Kanki和Klonsky，2008年;Okamoto等人，2009年). 游离GFP的出现表明OM45–GFP的空泡降解。如所示，有丝分裂发生于第36页Δ细胞在2天后生长，类似于WT细胞。相反，atg1处Δ细胞不能降解OM45–GFP。通过测量细胞溶质形式的碱性磷酸酶在液泡中的摄取来监测氮饥饿诱导的非选择性自噬。如所示，该途径在第36页Δ单元。
Cvt途径、有丝分裂或非特异性自噬不需要Atg36。(A类)通过WT内源性Ape1–GFP表达评估Cvt通路活性，第36页Δ和atg1处Δ单元。细胞在葡萄糖培养基中生长18 h，空泡用FM4-64染色。GFP在液泡中的积累表明该途径的功能正常。棒材，5μm。(B类)WT的线粒体自噬，第36页Δ和atg1处在甘油培养基中培养3天后，通过OM45–GFP的western blot分析检测Δ细胞。每隔24小时取样一次。(C类)重量，第36页Δ和atg1处用碱性磷酸酶法检测Δ细胞的非特异性自噬。细胞在YPD中生长，并转移到SD-N培养基中4 h。收集并处理样品以检测Pho8Δ60活性。结果代表了三个实验的平均值和标准差。WT 4 h饥饿设置为100%。
我们的结论是，Atg36是一种新的自噬因子，是pexophagy所特有的。
Atg36定位于过氧化物酶体及其过度表达诱导pexophage
为了检测Atg36的定位，我们在基因组中用GFP标记它。在大多数测试条件下，信号都很低(补充图S2). 然而，在对数后葡萄糖或油酸盐生长的细胞中，微弱的点状模式变得明显，而在聚乙烯3Δ单元。WT细胞与HcRed–PTS1共表达证实与过氧化物酶体共定位。用Atg36–GFP标记的过氧化物酶体聚集而不是分散在整个细胞中。当Atg36被单体GFP标记时，也可以观察到这种聚集(补充图S2)表明GFP二聚体不是聚集的原因。
我们从一个着丝粒质粒中表达Atg36，该着丝粒载体未标记或带有N或C末端GFP或mRFP标签，受镀锌1发起人(). 我们注意到，在半乳糖生长后的早期时间点，可以看到Atg36与过氧化物酶体标记物HcRed–PTS1共定位(). GFP–Atg36诱导5小时后，HcRed–PTS1的点状模式消失，空泡标记明显。这种降解的自噬性质通过GFP–Atg36在atg1处Δ细胞，其中Atg36标记过氧化物酶体，但未发生降解(). 当过表达C-标记的Atg36（右侧面板）时，过氧化物酶体的自噬降解在此时点不太明显。我们比较了不同标记版本的半乳糖诱导的嗜酸细胞吞噬活性与内源性Atg36在半乳糖培养6h的WT细胞中的嗜酸活性，然后切换到饥饿状态(). WT细胞含有空质粒（W），镀锌1–mRFP–附件36（N），镀锌1–Atg36–mRFP（C）或GAL1–附件36（U）(). 在WT细胞中，过度表达三种版本Atg36中的任何一种的细胞都会诱导高于内源性水平的pexophage。带有N标记的版本比带有C标记或未标记的版本更为活跃，其活动不太依赖于切换到饥饿状态。有趣的是，通过在饥饿培养基中的生长，C标记和未标记的版本被激活到N标记版本的水平。此外，即使在过氧化物酶体增殖条件下，N标记的版本也能诱导嗜酸细胞吞噬(). 这表明N-标记的Atg36具有组成型活性。半乳糖诱导6小时后，N-和C-标记的基因表达水平相似(补充图S3B)在相同的生长条件下，这一水平是内源性水平的约50至100倍(补充图S3B和C）。尽管标记的版本极度过度表达，但pexophagy只是适度诱导，这表明Atg36的水平本身并不决定pexopha反应的大小（另见下文）。
Atg36定位于过氧化物酶体并诱导其自噬降解。(A类)N（左）和C（右）GFP标记自动液位计36在镀锌1启动子在第36页Δ或atg1处Δ单元。显示诱导后的早期（2小时）和晚期（5小时）时间点。使用组成型表达的过氧化物酶体标记HcRed–PTS1评估PexophagyHIS3型发起人。(B类)Pex11–GFP western blot显示在半乳糖培养基（0）中生长6 h的WT细胞发生了pexophage，然后切换到饥饿培养基中1、2或3 h，如图所示。（W） ，WT（空质粒）；（N） ，GAL1–mRFP–ATG36; (C类),GAL1–ATG36–mRFP; （U） ，GAL1–ATG36.WT通过内源性Atg36显示pexophagy。(C类)Pex11–含有空质粒（WT）或GAL1–mRFP–ATG36在油酸盐培养基（0）中生长18小时，然后切换到含有2%半乳糖的油酸盐介质，并在3、6或22小时收获，如图所示。
Pex3招募Atg36到过氧化物酶体
对Atg36氨基酸序列的生物信息学分析没有发现任何特征表明它可能与膜相关或导入细胞器，因为没有检测到潜在的跨膜区域、脂质结合域或靶向信号。然而，Atg36与过氧化物酶体的结合是饱和的：在半乳糖诱导后的早期，Atg36-标记过氧化物酶，但进一步表达导致GFP–Atg36在细胞内积聚().
由于我们使用Pex3的细胞溶质域作为诱饵，在酵母双杂交筛选中鉴定出Atg36，因此我们期望Pex3与Atg36发生物理相互作用。为了测试这一点，我们孵化了大肠杆菌-用网织红细胞裂解物表达Pex3的细胞质域（作为固定在小球上的GST融合物），其中放射活性产生Atg36。如所示，Atg36专门绑定到Pex3。
Atg36通过Pex3结合过氧化物酶体。(A类)安在体外使用大肠杆菌-产生GST–Pex3（40–441）和与谷胱甘肽Sepharose珠结合的GST。在大量洗涤结合的蛋白质后，合成了Atg36在体外在以下人员在场的情况下[35S] -添加了蛋氨酸。进一步洗涤后，用GSH洗脱缓冲液洗脱蛋白质，并进行SDS-PAGE。结合组分和Atg36输入通过考马斯染色（底部面板）和磷成像（顶部面板）进行分析。使用纯珠样品作为进一步的对照*代表受约束的GST–Pex3（40–441），**代表受约束GST。(B类)第36页Δ聚乙烯3用编码质粒转化Δ细胞镀锌1–GFP–Atg36和a镀锌1–Tom70–Pex3–mRFP嵌合蛋白（左面板，顶部）或镀锌1–GFP–Atg36（右侧面板，顶部）。诱导表达3 h。用镀锌1–Tom70–Pex3–mRFP和preCox4–GFP(Motley等人，2008年)以证实Tom70–Pex3–mRFP的线粒体定位。棒材，5μm。(C类)中的拆分-GFP分析第8天Δ单元。表达GFP半体的细胞在半乳糖培养基中培养4小时，并对荧光的存在进行评分（−，无信号；+，荧光信号）。表达GFP–C-Atg36和Pex3–GFP-N的细胞中的过氧化物酶体通过与聚乙烯19表达HcRed–PTS1的Δ细胞。在中获取了多个荧光图像Z轴-轴并展平为单个图像。亮场图像是一个平面。棒材，5μm。(D类)Pex3与Atg36的免疫共沉淀。使用表达Pex3-GFP或Pex13-GFP的质粒，在其内源性启动子的控制下，在C13深渊或C13–Atg36–PtA的背景菌株中进行IP。细胞在葡萄糖培养基中生长24小时至记录后阶段。使用IgG Sepharose珠固定来自球形酵母裂解物的Atg36–PtA。用抗GFP和PAP检测SDS-PAGE凝胶。酵母裂解物占添加到小球中的裂解物的5%，并通过免疫印迹法进行分析。TL，总裂解物；IP，免疫沉淀。
我们之前使用Tom70–Pex3–mRFP融合来显示当Pex3存在于线粒体上时Inp1与Pex3结合(Munck等人，2009年). 尽管Tom20线粒体靶向信号与Pex3胞质结构域的融合被证明可以恢复过氧化物酶体的形成聚乙烯3Δ电池(Rucktaschel等人，2010年)，我们的全长Tom70融合到Pex3的胞质域的情况并非如此。我们发现GFP–Atg36标记了聚乙烯3Δ第36页Δ细胞，与Tom70–Pex3–mRFP共表达时与线粒体结合(). 发现Atg36与Pex3结合，即使Pex3在线粒体上定位错误，也表明Pex3的细胞溶质域足以将Atg36定位在膜上。在一些缺乏过氧化物酶体的细胞中偶尔出现GFP–Atg36斑点(). 由于它们不与Atg11共定位，也不存在于液泡膜上（未显示），因此我们没有进一步研究它们。
我们的结果表明，Pex3和Atg36两者相互作用在体外和体内。通过拆分-GFP分析进一步检查了相互作用第8天Δ细胞以防止pexophage和我们试图检测的信号的降解。在交配细胞中分裂-GFP与HcRed–PTS1相互作用的共聚焦显示，Pex3和Atg36在过氧化物酶体膜上相互作用(). 我们通过共免疫沉淀实验证实了Pex3–Atg36的相互作用()：Atg36–PtA特别降低了Pex3–GFP。这些观察结果表明，单独的Pex3可能负责将Atg36募集到过氧化物酶体中。
噬菌体特异性突变体的分离PEX3系列
Pex3通过与遗传因子Inp1结合，在分裂细胞中实现过氧化物酶体分离。我们以前使用了一个聚乙烯3识别基因突变的等位基因PEX3系列导致过氧化物酶体分离缺陷表型，如inp1型Δ电池(Munck等人，2009年). 这个聚乙烯3-1等位基因引起了这种分离表型，并编码了一个不能结合Inp1的突变Pex3蛋白。基于我们发现Pex3与嗜酸细胞吞噬因子Atg36结合，以及在嗜甲基酵母中观察到Pex3参与嗜酸细胞的吞噬，我们决定筛选聚乙烯3pexophagy缺陷突变体的等位基因。
我们筛选了我们的图书馆聚乙烯3使用GFP–PTS1 pexophagy分析通过显微镜观察等位基因。大多数等位基因显示GFP–PTS1的细胞质定位，每个细胞最多有几个过氧化物酶体，即Pex3功能严重受损。这些突变体未被考虑。在191个含有过氧化物酶体并且在油酸盐培养基上生长时没有显示细胞质标记的突变体中，我们发现了三个聚乙烯3具有类似于第36页Δ细胞，即过氧化物酶体保持完整，GFP–PTS1在饥饿时不会积聚在液泡中。所有其他188个突变体在饥饿时表现出空泡GFP标记。我们找到了PEX3系列三个突变体的质粒并将其重新导入聚乙烯3表达GFP–PTS1的Δ细胞。这些等位基因再次恢复过氧化物酶体的形成聚乙烯3Δ细胞，但不能支持pexophagy（显示为聚乙烯3-177等位基因;补充图S4D).
这个聚乙烯3-177等位基因在pexophagy中受到影响。(A类)通过显微镜检测Pex11–GFP对聚乙烯3Δ电池和聚乙烯3Δatg1处用含有WT的质粒转化的Δ细胞PEX3系列或聚乙烯3-177或使用空质粒ycplac111。细胞在葡萄糖中生长，转移到油酸盐培养基中18 h，然后切换到SD-N培养基中22 h(B类)相同细胞在SD-N培养基上饥饿时的Western blot分析。GFP*表示相对抗蛋白酶降解产物，反映液泡破裂。显示了western blots的时间点。(C类)通过Pex13–GFP分解分析Pexophagy聚乙烯3Δ细胞携带上述质粒。(D类)Atg36定位分析聚乙烯3Δ细胞表达聚乙烯3,聚乙烯3-177和pex3-1型.的母细胞聚乙烯3-1没有过氧化物酶体（黑色箭头）。(E类)Pex3-177与Atg36的免疫共沉淀。在内源性启动子控制下，使用表达Pex3-177-GFP的质粒在背景菌株C13-Atg36-PtA中进行IP。细胞在葡萄糖培养基中生长24小时至记录后阶段。使用IgG Sepharose珠固定来自球形酵母裂解物的Atg36–PtA。用抗GFP和PAP检测SDS-PAGE凝胶。酵母裂解物占添加到小球中的裂解物的5%，并通过免疫印迹法进行分析。TL，总裂解物；IP，免疫沉淀。与Pex3–GFP IP的比较（左侧面板）。
我们通过跟踪Pex11–GFP的降解进一步研究了pexophagy表型(;补充图S4A). 在聚乙烯3Δ细胞，包括Pex11在内的大多数PMP迅速被分解，导致这些PMP水平较低(Hettema等人，2000年). 正如预期的那样，Pex11–GFP水平在聚乙烯3油酸盐上生长的Δ细胞(，ycplac111）。后续中断自动液位计1无法稳定Pex11–GFP(,atg1处Δ聚乙烯3Δcells，ycplac111），此外atg1处Δ聚乙烯3Δ细胞表明，在缺乏Pex3的情况下，Pex11–GFP通过自噬非依赖性途径（例如泛素/蛋白酶体机制）降解().
Pex11–GFP在聚乙烯3Δ单元格包含聚乙烯3-177等位基因()存在于过氧化物酶体中(补充图S4C). 将这些细胞转移到饥饿培养基中后，只有一小部分Pex11–GFP被分解()表明该等位基因在pexophagy中存在严重缺陷。第二个过氧化物酶体膜标记物（Pex13-GFP）证实了这些观察结果(). 因此，三个独立标记（GFP–PTS1、Pex11–GFP和Pex13–GFP）表明过氧化物酶体pex3-177型在pexophagy条件下，细胞能够抵抗分解。使用显微镜pexophagy筛查分离出另外两个Pex3等位基因，这两个等位基因在pexopha条件下稳定Pex11–GFP(补充图S4A).
我们分析了过氧化物酶体在母细胞和芽之间的分布聚乙烯3含有分离缺陷的Δ细胞聚乙烯3-1等位基因或pexophagy-deficient聚乙烯3-177等位基因(补充图S4B). 与中相反聚乙烯3-1我们发现过氧化物酶体分离完整，Inp1–GFP被招募到过氧化物酶体中聚乙烯3-177单元格(补充图S4D).
为了测试嗜酸粒细胞表型是否存在于聚乙烯3-177细胞是由于过氧化物酶体不能结合Atg36所致，我们在来自自动液位计36启动子聚乙烯3-177或聚乙烯3-1单元格(). 我们发现Atg36–GFP与过氧化物酶体的结合在聚乙烯3-177细胞。此外，我们表明Pex3-177不相互作用体内带有Atg36–PtA().
我们得出结论，含有聚乙烯3-177等位基因能够在细胞分裂过程中形成过氧化物酶体结构并将其分离，但在Atg36募集方面存在缺陷，这导致了嗜酸细胞缺陷。Pex3的Atg36结合功能可以从遗传上与过氧化物酶体形成和分离所需的功能分离。
自动液位计36在pexophagy之前诱导表达
如果Atg36标记过氧化物酶体进行自噬降解，我们预计其表达在过氧化物酶降解之前最高。为了比较自动液位计36我们用PtA标记基因组Atg36中C末端的Atg36，并分析其在不同生长条件下在表达Pex11–GFP的细胞中的表达(). 我们发现，在油酸盐上，Atg36的水平增加，而不诱导pexophagy，并且当细胞切换到饥饿培养基并且pexophagy开始时，Atg36的水平开始降低，如Pex11–GFP降解所示。以及中描述的过度表达实验很明显，Atg36的表达水平与pexophagy之间没有直接的相关性，也就是说，Atg36水平的增加（内源性或诱导性）不足以引发pexophagy，而pexophagy只有在转换到饥饿培养基后才会发生(和，但带有N标记的版本除外，该版本似乎具有组成活性）。这表明Atg36通过切换到饥饿介质而被激活。值得注意的是，Atg36–PtA似乎根据生长条件进行了不同的修饰：Atg36-PtA迁移为一组模糊带，其迁移率随饥饿而变化，并对CIP治疗表现出不同的敏感性(;补充图S3D). 在表达GFP标记的Atg36的WT细胞中，进一步观察到Atg36在油酸盐中上调，在细胞转换到饥饿状态时下降(). 在饥饿培养基上培养6小时后，大多数Atg36–GFP被裂解，表现为典型的GFP特异性分解产物的出现，该产物在GFP融合蛋白的液泡进入时积聚，并且这种裂解的出现依赖于Atg1。有趣的是，Atg36–GFP也从atg1处Δ细胞，但由于没有GFP裂解产物积累，这种分解不会发生在液泡中。我们得出结论，在WT细胞中，Atg36在与过氧化物酶体共同转运到液泡后通过自噬降解，但在atg1处Δ细胞，atg36通过自噬独立过程降解。
Atg36的表达和切割与Pex11–GFP降解相关。(A类)在质粒上表达基因组Atg36–PtA和Pex11–GFP的WT细胞在葡萄糖中生长22小时，转移到油酸培养基中，然后转移到SD-N培养基中。在指定的时间采集样品，并用过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物进行western blot检测，以检测Atg36–PtA（顶面板）或抗GFP，以检测Pex11–GFP噬菌体（底面板）。GFP*表示相对抗蛋白酶降解产物，反映液泡破裂。(B类)在油酸盐和饥饿条件下对所示菌株中指定时间点的基因组Atg36–GFP进行Western blot分析。(C类)WT基因组Atg36–GFP的Western blot分析，聚乙烯14Δ,atg1处Δ和聚乙烯3Δ细胞在油酸盐培养基中生长3天。每隔24小时取样一次。(D类)在葡萄糖培养基中培养22 h，将WT细胞转移到油酸盐培养基，然后转移到SD-N培养基中，测定总裂解液中的Pex3水平。在指定的时间采集样品，并用抗Pex3蛋白进行蛋白质印迹处理。A类聚乙烯3Δ葡萄糖22h样品用于测定抗体的特异性**表示非特定频带。(E类)蛋白质印迹分析聚乙烯3Δ和第36页Δ聚乙烯3Δ细胞在葡萄糖、油酸盐培养基中生长，并在指定的时间转移到SD-N培养基后，从其自身的启动子表达Pex3–GFP。
我们研究了在油酸盐培养基中连续生长3天的细胞中Atg36–GFP的降解(). 如图所示，在第2天开始pexophagy。虽然Atg36–GFP被分解，并且在WT细胞的pexophagy过程中出现了对蛋白酶耐药的GFP片段，但在聚乙烯3Δ或atg1处Δ电池(). Atg36–GFP被劈开聚乙烯14Δ细胞，这与我们的发现一致，即这些细胞中的pexophagy是完整的。我们得出结论，Atg36通过自噬过程与过氧化物酶体一起进入液泡，因为Atg36–GFP没有被裂解聚乙烯3Δ或atg1处Δ单元。
Bellu等人（2002年）已报告多形H当pexophagy被诱导并在整个细胞器的液泡吸收之前降解时，Pex3从过氧化物酶体中迅速去除。调查这是否属于酿酒酵母，我们跟踪内源性Pex3的稳定性()和Pex3–GFP()在葡萄糖、油酸盐和饥饿培养基上生长的细胞中。我们发现，Pex3和Pex3–GFP降解的时间过程与Atg36–PtA和Pex11–GFP相当()在饥饿培养基上，这三种蛋白质在3到6小时之间降解最多。Pex3以与过氧化物酶体标记物Pex11和Atg36相同的动力学降解的发现表明酿酒酵母Pex3在pexophagy之前并没有从过氧化物酶体中去除并降解，与已经发现的多形H聚乙烯3(Bellu等人，2002年). 此外，多形H即使在自噬受阻的细胞中，Pex3也会降解，而在酿酒酵母，Pex3–GFP在第36页Δ电池(). 这清楚地表明了在多形H和酿酒酵母.
需要Atg36将过氧化物酶体连接到自噬装置
Atg11被提议作为连接选择性货物受体和核心自噬机制的衔接蛋白。例如，线粒体吞噬受体和Cvt途径酿酒酵母（分别为Atg32和Atg19）和巴氏杆菌（PpAtg30）绑定Atg11(尤里米苏和克林斯基，2005a;Farre等人，2008年;Kanki等人，2009年;Okamoto等人，2009年). Atg32还可以绑定Atg8(Okamoto等人，2009年)在哺乳动物细胞中，许多选择性受体与哺乳动物Atg8同源基因LC3相互作用(Johansen和Lamark，2011年). 因此，我们试图确定Atg11和Atg8是否与Atg36相互作用。我们在共表达HA–Atg11或HA–Atg8的细胞中表达了从其染色体位点标记的Atg36–PtA。细胞在油酸和饥饿条件下生长。Atg36–PtA用IgG琼脂糖珠免疫沉淀，共纯化的蛋白质通过Tev蛋白酶裂解洗脱。通过免疫印迹法检测洗脱液中是否存在HA–Atg11和HA–Atg 8(). 从饥饿细胞制备的裂解液中，HA–Atg11和HA–Atg 8与Atg36–PtA共提纯。油酸盐条件下也观察到低水平的结合，但与阴性对照物Mvp1–PtA共纯化的HA–Atg11和HA–Atg 8水平相似。我们得出结论，Atg36与Atg11和Atg8相互作用，这种相互作用是在pexophagy条件下诱导的。
Atg11和Atg8绑定Atg36。(A类)Atg11和Atg8与Atg36的免疫共沉淀。在C13–Atg36–PtA中执行IPatg1处Δ或C13–Mvp1–PtAatg1处含有表达HA–Atg11或HA–Atg 8质粒的Δ细胞TPI1型发起人。细胞在葡萄糖培养基中生长24 h至对数后阶段，然后在油酸盐培养基中再生长18 h。然后在非失活或饥饿条件下再生长2 h。使用IgG Sepharose珠固定来自球形酵母裂解物的Atg36–PtA或Mvp1–PtA。在大量洗涤后，结合物通过Tev蛋白酶裂解洗脱。用抗HA（单克隆12CA5）和PAP探测SDS-PAGE凝胶（显示百分比）。TL，总裂解物；IP，免疫沉淀（Tev洗脱液）。(B类——D类)GFP–Atg11在所示菌株中表达，细胞在葡萄糖培养基中生长至对数后阶段。插图显示了放大倍数和堆栈的各个切片atg1处Δ单元。棒材，5μm。
许多货物受体已被证明含有一个将其与Atg8/LC3连接的AIM/LIR。对Atg36的分析显示八个氨基酸序列与AIM/LIR一致性弱相似(补充图S5). 突变分析表明，尽管Atg36功能需要其中一个序列，但它并不保守，也不构成功能性AIM(补充图S5).
然后，我们研究了在自噬被阻断的细胞中，将过氧化物酶体与Atg11阳性结构连接起来的Atg36的要求(atg1处Δ细胞）：我们表达了GFP–Atg11并量化了与过氧化物酶体共存的程度()或缺席()第页，共页自动液位计36。我们使用atg1处Δ细胞组装含有Atg蛋白的PAS，但在进一步形成自噬体时被阻断(铃木等人，2007). 大多数日志atg1处表达这两种标记的Δ细胞（>65%）显示GFP–Atg11点与过氧化物酶体非常接近或共定位，而在atg1处Δ第36页Δ细胞，只有少数（<15%）细胞在这两个标记物之间表现出密切的相似性。这证实了Atg36需要将过氧化物酶体带到GFP–Atg11标记的自噬结构，并表明在atg1处Δ细胞，过氧化物酶体，如线粒体，与Atg11阳性结构相关，最可能是PAS(Kanki等人，2009年).
在一项类似的实验中，我们发现过氧化物酶体和Atg11之间的接近度在聚乙烯3Δatg1处Δ单元格包含聚乙烯3-177相比之下聚乙烯3Δatg1处Δ电池包含PEX3系列().
线粒体靶向的Pex3可以驱动有丝分裂
我们已经在上面证明，即使Pex3定位于线粒体时，Pex3也会将GFP–Atg36招募到细胞膜上。我们还表明，即使在通常刺激过氧化物酶体增殖的条件下，mRFP–Atg 36的诱导也会导致pexophagy。我们假设，如果Atg36通过Tom70–Pex3–mRFP的共表达靶向线粒体，GFP–Atg36的过度表达可能导致线粒体吞噬。
我们确实发现GFP–Atg36的延长表达（22小时）聚乙烯3Δ细胞导致Tom70–Pex3–mRFP的空泡定位，当细胞转移到饥饿培养基时，这种作用增强(). 只有当GFP–Atg36和Tom70–Pex3–mRFP同时表达时，才会出现GFP–Attg36表达的这种影响，并且是Atg1依赖性的。这种过度表达的影响也见于第32页Δ聚乙烯3Δ细胞，否则有丝分裂缺陷。这表明Tom70–Pex3–mRFP和Atg36可以作为可移植模块一起发挥作用，导致线粒体自噬降解。
当Atg36直接作用于线粒体时，它会促进有丝分裂(A类)聚乙烯3Δ,聚乙烯3Δatg1处Δ和聚乙烯3Δ第32页Δ细胞在半乳糖培养基中培养6小时，以表达镀锌1–Tom70–Pex3–mRFP和GAL1–附件36–GFP。将细胞移到SD-N培养基中，12小时后成像Z轴-轴并展平为单个图像。亮场图像是一个平面。棒材，5μm。(B类)OM45在第32页Δ聚乙烯3Δ和第32页Δ聚乙烯3Δ第36页Δ细胞，用空质粒（−）或编码OM45–Pex3（+）的质粒转化。细胞在甘油培养基中培养3天，每隔24小时采集样本，进行抗GFP蛋白免疫印迹。GFP*表示相对抗蛋白酶降解产物，反映液泡破裂。
我们通过测试内源性Atg36能否在缺乏线粒体吞噬受体Atg32的细胞中恢复线粒体吞噬功能，进一步研究了这一观察结果。这是通过OM45–甘油生长3天期间GFP分解进行评估的(). 这些生长条件诱导有丝分裂()和pexophagy()从第2天开始。内源性Atg36直接作用于第32页Δ聚乙烯3Δ细胞通过表达OM45–Pex3，在这些实验中，OM45启动子控制下，OM45–Pex3融合蛋白由编码质粒组成。这种融合并不能拯救过氧化物酶体的形成聚乙烯3Δ单元格（数据未显示）。通过OM45-GFP的免疫印迹法测定线粒体吞噬功能。
如图所示，表明有丝分裂的游离GFP仅在第32页Δ聚乙烯3表达OM45–Pex3的Δ细胞。中断自动液位计36在里面第32页Δ聚乙烯3Δ细胞破坏了OM45–Pex3拯救有丝分裂的能力，这证实确实是内源性Atg36负责有丝分裂活动。我们的结论是，Atg36作为一个标签将其货物与自噬机制联系起来，如果它以线粒体为靶点，甚至可以取代Atg32。
讨论
我们开始了解Pex3在过氧化物酶体周转中的作用，并分离出一个聚乙烯3等位基因(聚乙烯3-177)这在过氧化物酶体的自噬分解中被特别阻断。该等位基因无法招募一种新的自噬因子Atg36，该因子将过氧化物酶体与自噬机制联系起来。这些观察结果支持了一个模型，即Pex3作为pexophagy-specific因子的锚定，该因子标记过氧化物酶体降解。
Pex3需要招募Atg36用于pexophagy
我们发现pex3是pexophagy所必需的，因为我们分离了三个聚乙烯3等位基因（包括pex3-177型)在pexophagy中受到影响的。我们鉴定了一种新的Pex3相互作用蛋白，Atg36。当Pex3和Atg36相互作用时，Pex3充分且必要地将Atg36从细胞质招募到过氧化物酶体在体外和体内如果我们将Pex3的细胞溶质域重定向到线粒体，Atg36如下。这个聚乙烯3pexophagy-deficient等位基因在其细胞溶质域中发生突变，我们发现其中一个等位基因，聚乙烯3-177，无法绑定Atg36体内因此不会将Atg36招募到过氧化物酶体中。比较突变等位基因并没有发现突变热点。这表明，突变不是破坏线性结合基序，而是更有可能影响Pex3的三级结构，从而抑制Atg36的结合。然而，这些突变仍然允许Inp1和Pex19结合，如聚乙烯3-177在过氧化物酶体形成和分离中很活跃。我们的数据显示第36页Δ细胞在过氧化物酶体形成、分离或功能方面不受影响。在大多数生长条件下，过氧化物酶体数量的增加是过氧化物酶周转缺陷的结果。
在全基因组双杂交筛选中，Atg36与Pex34和Inp1相互作用(Ito等人，2001年;Yu等人，2008年). 这两种蛋白质分别参与过氧化物酶体的增殖和分离。我们在过氧化物酶体增殖或分离中没有发现Inp1或Pex34的需求，也没有发现Atg36的需求。此外聚乙烯3在嗜酸或分离中受影响的等位基因分别在过氧化物酶体募集Atg36或Inp1中选择性缺失。这意味着这些因子被Pex3相互独立地招募到过氧化物酶体中。Pex34是一种通过内质网传递到过氧化物酶体的完整膜蛋白(Tower等人，2011年). 当我们将Pex3重新定向到线粒体时，Atg36遵循它刺激有丝分裂的位置。对这些结果的最简单解释是，Atg36招募或活动不需要Pex34。因此，在全基因组筛选中观察到的双杂交相互作用的相关性尚不清楚。
Atg36在pexophagy中的作用是什么？
首先，我们确定了Atg36是pexophagy所特有的，而不是其他各种自噬过程所必需的，包括非选择性自噬、有丝分裂或通过Cvt途径靶向液泡的Ape1。
我们认为Atg36是酿酒酵母基于以下观察结果。当从镀锌1启动子，我们看到它与过氧化物酶体的结合先于pexophagy，并且Atg36的持续过度表达诱导pexopha。选择性自噬的真菌受体通过Atg11将其货物连接到核心自噬机制(尤里米苏和克林斯基，2005a;Farre等人，2008年;Kanki等人，2009年;Okamoto等人，2009年). 有丝分裂和Cvt受体Atg32、Atg19和Atg34也分别与Atg8相互作用(Shintani等人，2002年;Okamoto等人，2009年;铃木等人，2010)、和体内突变研究表明，Atg19和Atg34的AIM序列对Cvt途径的活性至关重要(Noda等人，2008年;铃木等人，2010). 在哺乳动物细胞中，Atg11似乎不存在，但Atg8家族同源物LC3/GABARAP与货物受体相互作用，通过LIR选择性自噬，这些相互作用已被证明对功能至关重要(Pankiv等人，2007年;Noda等人，2008年;Kirkin等人，2009年;Novak等人，2010年;Wild等人，2011年). 然而，Atg32的AIM突变并不能消除其体内与Atg8的相互作用，由共免疫沉淀测定，这种突变对有丝分裂仅有轻微影响(Okamoto等人，2009年;Kondo-Okamoto等人，2012年). 相反，Atg32与Atg11的相互作用对有丝分裂至关重要(Kondo-Okamoto等人，2012年). 作者提出，“其他蛋白质-蛋白质界面可能有助于Atg32和Atg8之间的相互作用体内’. 同样巴氏杆菌Atg11和Atg30对pexophagy至关重要，但该蛋白中没有典型的AIM，也没有与Atg8结合的描述。
我们表明Atg36相互作用体内Atg11和Atg8。虽然我们在Atg36中确定了8个序列，它们与AIM/LIR一致性弱相似，但其中7个序列的破坏并不影响pexophagy(补充图S5). 然而，对Atg36活性所需的Y191/L194的进一步分析表明，它不是一个AIM，因为它不保守，并且在-1处缺少丝氨酸或苏氨酸，这在迄今为止鉴定的所有酵母AIM中都已发现(补充图S5). 此外，它在X位置缺乏AIM/LIR的负电荷残基特征1/X（X）2或X−1/X（X）−3(Johansen和Lamark，2011年)，并且将−2处的D替换为A并不影响功能。最后，发现Y191被L（存在于大多数酵母Atg36同源物的这个位置(补充图S5))不影响pexophagy证实Y191/L194不是AIM。Atg8是否通过不同的基序与Atg36相互作用，或者这些基序是否是多余的，还有待测试。我们无法检测到Atg8和Atg36之间的交互在体外或与酵母双杂交（数据未显示）。然而，我们确实发现了一种相互作用体内()，并且Atg8可能不会直接绑定Atg36。
在atg1处Δ细胞，大多数Atg蛋白在PAS处积累(铃木等人，2007)，但自噬过程的后续步骤被阻断。我们发现过氧化物酶体经常定位于含有Atg11的结构atg1处Δ细胞，这种共定位需要Atg36向过氧化物酶体募集第36页Δ电池和聚乙烯3-177细胞减少了过氧化物酶体与Atg11的共定位。所有这些观察结果都证明Atg36是连接过氧化物酶体和自噬体膜的pexophagy受体。我们的移植实验进一步测试和证实了这一点，我们将Pex3引导到线粒体，并恢复了第32页Δ. 此恢复取决于Atg36。
我们的观察结果提出了一个重要的问题，即吞咽是如何调节的。在这个阶段，我们只能假设Atg36如何激活pexophagy。我们建议Atg36通过两步过程完成这一过程，即首先在过氧化物酶体表面积累Atg36，然后发生激活事件。当细胞生长在油酸盐上时，过氧化物酶体上的Atg36水平增加，但这与pexophage无关。这表示需要第二个事件。当细胞随后被转移到饥饿培养基时，噬Pexophagy被激活，western blot分析表明，这与Atg36的迁移率变化有关，这意味着Atg36是翻译后修饰的。在这些条件下，我们还观察到Atg36与Atg11和Atg8的相互作用增加。修改的性质很复杂。磷酸酶处理表明，Atg36在油酸盐生长和饥饿期间都被磷酸化。然而，饥饿前和饥饿期间的磷酸酶治疗不会导致Atg36的流动性相同。这表明Atg36在这些条件下被不同的修饰，并且这种修饰可能刺激与自噬机制的相互作用。这方面的先例是Atg11与ScAtg32和PpAtg30的磷酸化依赖性相互作用(Farre等人，2008年;青木等人，2011年). 此外，视神经蛋白LIR−1位置丝氨酸残基的磷酸化刺激与ATG8-家族同源物的结合和选择性自噬沙门氏菌(Wild等人，2011年). AIM/LIR的位置1附近经常有负电荷或丝氨酸或苏氨酸(Noda等人，2010年;补充图S5)有人提出LIR磷酸化是调节自噬受体的一种常见机制(Wild等人，2011年). 目前，我们只能将Atg36修饰形式的出现与pexophagy诱导相关联，但无法测试其相关性。我们发现，即使在非失活条件下，Atg36的过度表达也会诱导pexophage。由于过度表达至少是50到100倍，在这些条件下，似乎可以绕过调节过程中的第二步。特别令人感兴趣的是外源性表达的N标记的Atg36的作用，它似乎具有组成活性，也就是说，不依赖于饥饿。
如上所述，Atg36在介导有丝分裂中可以取代Atg32，并且Atg36介导的有丝分裂的时间反映了Atg32介导的线粒体分裂和Atg36中介导的pexophagy。人工Atg36依赖性有丝分裂是否依赖于pexophagy特异性调节机制尚不清楚，有待进一步研究。最近，MAPKs Slt2和Hog1与选择性自噬有关。尽管数据不一致，但Hog1和Slt2都与有丝分裂和有丝分裂有关(Manjithaya等人，2010a;青木等人，2011年;毛和克林斯基，2011年;Mao等人，2011年). 然而，它们的自噬靶点尚不清楚。Atg36的水平和迁移模式slt2型Δ和猪1Δ细胞与WT细胞相比未受影响（数据未显示）。这表明Slt2和Hog1都没有达到Atg36的水平。这与认为Slt2作用于吞噬体形成后的吞噬作用晚期的观察结果相一致(Manjithaya等人，2010a).
酿酒酵母嗜酸酵母菌与嗜甲基酵母菌的嗜酸机理不同
Atg36同源物只能在密切相关的物种中鉴定，而在巴氏杆菌同样，PpAtg30在酿酒酵母我们的研究表明PpAtg30和ScAtg36之间有许多共同特征，包括过度表达诱导pexophagy、氮饥饿条件下的翻译后修饰以及与Pex3和Atg11的相互作用(Farre等人，2008年). 虽然有很多相似之处，但在巴氏杆菌和酿酒酵母.Pex14是PpAtg30向过氧化物酶体募集所必需的巴氏杆菌并且对于PpAtg30过度表达诱导的pexophagy至关重要。由于Pex3与PpAtg30相互作用，因此建议Pex3发挥作用，但由于PpAtg30不局限于含有Pex3的结构聚乙烯14Δ细胞，Pex3在巴氏杆菌pexophagy仍不清楚。
Bellu等人（2002年）据报道，在相关的甲基营养酵母中多形H，在过氧化物酶体在液泡中隔离和降解之前，在pexophagy诱导条件下，Pex3从过氧化物质体中快速去除。另据报道，Pex3的去除是过氧化物酶体降解的先决条件，并且与自噬无关(Bellu等人，2002年;van Zutphen等人，2011年). 与此相反，我们发现Pex3与过氧化物酶体并行降解，并且在其在液泡中降解之前没有从过氧化物酶体中去除酿酒酵母此外，与中相反多形H，当自噬被阻断时，ScPex3在饥饿条件下不会降解。我们的数据强烈支持ScPex3通过Atg36将过氧化物酶体偶联到自噬机制中的作用。这一作用可能由嗜甲基酵母中的Pex14完成，如巴氏杆菌PpAtg30定位于过氧化物酶体需要Pex14(Farre等人，2008年)Pex14也需要用于多形H(Bellu等人，2001年). 在哺乳动物细胞中，Pex14被证明通过微管蛋白与LC3相互作用，因此被认为在pex吞噬中发挥作用(Hara-Kuge和Fujiki，2008年). 相反，我们表明酿酒酵母Pex14对pexophagy来说是完全不必要的().
我们得出结论，ScPex3作用于（至少）三个不同的过程，并且这些过程可以在遗传上分离。Pex3在过氧化物酶体形成中充当Pex19的对接因子，它还将Inp1募集到过氧化物酶体中，作为其在过氧化物酶体分离中作用的一部分。现在我们证明，Pex3将pexphagy特异性蛋白Atg36招募到过氧化物酶体中，并且这种招募是pexphag所必需的。出现了一个模型，根据该模型，Pex3通过招募过程特定因子来协调过氧化物酶体室的生物发生和维持。这是如何实现的，有待进一步调查。
材料和方法
酵母菌株、培养基和生长条件
本研究中使用的酵母菌株列于补充表S1通过同源重组进行基因标记和破坏，并通过PCR检查菌株。在所有实验中，细胞在规定的选择性葡萄糖培养基中培养过夜。为了通过显微镜分析表型，随后将细胞稀释至0.1 OD600成像前，在新鲜的选择性葡萄糖培养基中培养2至3个细胞分裂（4-6小时）。当需要诱导报告蛋白时，将细胞转移到0.1 OD的选择性半乳糖培养基中600并按照图和文本中所示的时间增长。酵母细胞在以下任一培养基中在30°C下生长：富含YPD培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）、用于选择尿嘧啶原营养标记物的最小培养基（YM2）（碳源、不含氨基酸和硫酸铵的0.17%酵母氮基、0.5%硫酸铵、1%酪氨酸）或最小培养基用于筛选所有原营养标记物（碳源、不含氨基酸的0.17%酵母氮基和硫酸铵、0.5%硫酸铵）。关于碳源，将葡萄糖和半乳糖添加到2%（w/v）和甘油3%（v/v）。为了诱导过氧化物酶体，将细胞转移到油酸盐培养基（YM2油酸盐：YM2加0.12%油酸盐（v/v），0.2%吐温-40®（v/v），0.1%酵母提取物）中，进行1/10隔夜稀释。通过将细胞转移到缺乏氮源（SD-N；不含氨基酸和硫酸铵的0.17%酵母氮基，2%葡萄糖）的饥饿培养基中，诱导了嗜酸作用(Hutchins等人，1999年;Manjithaya等人，2010a). 根据需要将适当的氨基酸储备添加到最少的培养基中。总的来说，外径为5-10600单位是在选定的时间点收集的，如图和文本所示。细胞通过免疫印迹或荧光显微镜进行分析。对于线粒体自噬诱导，将中对数期酵母细胞在YM2甘油培养基中生长3天(Okamoto等人，2009年). 该方法也被用作用YM2甘油代替YM2油酸盐或YM2葡萄糖的pexophage测定方法。总的来说，外径为5-10600如图和文本所示，在选定的时间点收集单位。油酸盐平板含有0.67%的酵母氮碱，不含氨基酸和硫酸铵，0.1%酵母提取物，0.1%油酸盐（v/v），0.25%吐温-40（v/v），2%琼脂和所需氨基酸。
如前所述进行配对实验(莫特利和赫特玛，2007年). 如前所述，液泡膜被染色(Vida和Emr，1995年).
聚乙烯3突变筛选
为了确定pexophagy-deficientPEX3系列突变体，我们筛选了一个PEX3系列实验室先前产生的等位基因(Munck等人，2009年). 基本上，我们使用如上所述的pexophagy分析在96 well板上用荧光显微镜筛选突变体。在筛选的1000个突变体中，只有191个显示出多点荧光结构，没有细胞溶质标记。这表明这些聚乙烯3等位基因支持过氧化物酶体的形成。在pexophagy分析中，这191个突变体中的大多数失去了过氧化物酶体并显示出空泡GFP标记，但有三个突变体保留了过氧化物酶体并且没有空泡标记。我们找到了这些聚乙烯3来自三个突变体的质粒，对其进行测序，并将其重新导入聚乙烯3表达GFP–PTS1的Δ细胞。同样，这些等位基因恢复了过氧化物酶体的形成，但未能支持pexophagy。等位基因的DNA序列分析揭示了以下氨基酸替换：聚乙烯3-58（F35S、I170T、D196E、Q285R、D374E、T397S、S429R）；聚乙烯3-153（E58D、L166P、K210R、Q284L）；聚乙烯3-177（F64S、T74A、H354L）。
In-vitro公司转录/翻译
In-vitro公司使用TnT快速偶联兔网织红细胞转录/翻译试剂盒（Promega），使用PCR生成的模板进行转录/翻译自动液位计36根据制造商的说明。GST–Pex3（40–441）于年生产大肠杆菌如前所述(Munck等人，2009年). SDS–PAGE凝胶用考马斯蓝染色，然后进行磷酸成像。
免疫印迹法
为了通过碱解制备提取物，对细胞进行离心，并将颗粒重新悬浮在0.2 M NaOH和0.2%β-巯基乙醇中，并在冰上放置10分钟。通过添加5%TCA再沉淀10分钟，沉淀可溶性蛋白质。离心后（13 000克，5分钟，4°C），将可溶性蛋白重悬于10μl 1 M Tris–HCl（pH 9.4）中，并在90μl 1×SDS–PAGE样品加载缓冲液中煮沸10分钟。样品（0.25–1 OD600等效物）通过SDS–PAGE进行解析，然后进行免疫印迹。在TBS-Tween-20（50 mM Tris–HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.1%（v/v）Tween-20）中2%（w/v）无脂漫威™牛奶中封住斑点。使用单克隆抗HA 12CA5（小鼠1:50稀释杂交瘤培养上清液）、单克隆抗GFP（小鼠；1:3000；Roche）、过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）（兔子；1:2000；Sigma）、多克隆抗Pex3（兔子；1:3000，Ralf Erdmann和Erdmann-Girzalsky的礼物）或单克隆抗PGK 22C5（小鼠；1:17000；Invitrogen）。二级抗体为HRP-连接的抗鼠多克隆（山羊；1:4000；Bio-Rad）或HRP-链接的抗兔多克隆（羊；1:10000；Promega）。使用增强化学发光（生物工业）和化学发光成像实现检测。
协同免疫沉淀
为了用基因组表达的Atg36–PtA使IgG Sepharose™6 Fast Flow beads（GE Healthcare）充分饱和，用50 ml 24小时葡萄糖培养基接种500 ml油酸盐培养基。在30°C下搅拌培养18小时。在收获用于饥饿条件的细胞（2500个）时，将非保存条件烧瓶再放置2小时克，5 min），洗涤并重新悬浮在50 ml SD-N培养基中，并再放置2 h。收集所有细胞，洗涤并称重颗粒。通过在山梨醇缓冲液（50 mM Kpi（pH 7.4）、1.2 M山梨醇、2%葡萄糖、不含氨基酸和硫酸铵的0.17%酵母氮基、酵母糖酶（5 mg/g细胞）、赖氨酸/组氨酸/蛋氨酸、0.5%硫酸铵（非变性））中用发酵糖酶（MP Biomedicals）处理1 h制备球形体，在50 mM Kpi（pH 7.4）+1.2 M山梨醇中洗涤一次，并在10 ml裂解缓冲液（150 mM KCl，20 mM Tris–HCl（pH 8.0），4 mM Pefabloc SC（Roche），1 mM EDTA（pH 8.0），一片完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片/25 ml（Roches），5 mM钒酸钠，25 mM氟化钠）中再次悬浮。全细胞裂解物通过静置匀浆获得，然后在冰上培养10分钟，加入0.5%（v/v）Triton X-100。离心后（13000克，5分钟，4°C），将裂解物与35μl IgG Sepharose™6 Fast Flow珠一起孵育，在裂解缓冲液中预先洗涤，在4°C下旋转15分钟。随后用含有0.1%（v/v）Triton X-100的裂解缓冲液洗涤珠三次。根据制造商的说明（Invitrogen），通过添加裂解缓冲液并在95°C下用4×SDS–PAGE缓冲液煮沸5分钟或通过AcTEV蛋白酶裂解来洗脱结合材料。
碱性磷酸酶测定
如前所述进行非选择性自噬的碱性磷酸酶检测(Noda等人，1995年). 简而言之，细胞隔夜生长直至OD600=0.5英寸YPD。收集培养物，将其一半转移到SD-N培养基中并孵育4 h。将细胞在水和1–2×10的颗粒中清洗6细胞在液氮中冷冻，并在80°C下保存，直至分析。
细胞在分析缓冲液（250 mM Tris–HCl（pH 8.5）、0.4%（v/v）Triton X-100、10 mM MgSO）中溶解4，10μM硫酸锌41 mM PMSF），并用玻璃珠旋涡。离心后，将10μl裂解液添加到含有1 mM的190μl分析缓冲液中第页-磷酸硝基苯酚（Sigma，N9389），并在30°C下培养。OD的增加400使用Mutiscan Ascent（Thermo Labsystems）平板阅读器每隔2分钟进行一次跟踪。OD的变化400/将饥饿条件下WT裂解液的min/mg蛋白质设置为100%。进行了三个独立的实验。
图像采集
使用配备Exfo X-cite 120激发光源、带通滤波器（Carl Zeiss，Inc.和Chroma）、αPlan-Fluar 100×/1.45 NA或A-Plan 40×/0.65 NA Ph2物镜（Carl蔡司，Inc.）和数码相机（Orca ER；Hamamatsu）的Axiover 200M显微镜（卡尔蔡司公司）分析活细胞。使用Openlab和Volocity软件（Perkin-Elmer）进行图像采集。荧光图像常规采集为0.5μmZ轴-在Volocity中增强对比度后叠加并合并成一个平面，并在Photoshop（Adobe）中进一步处理，其中只使用了水平调整。有时（如文本所示）图像被收集为单平面图像。在一个平面上采集了亮场图像。
