WNT-TCF成瘾的丧失和HH-GLI1信号的增强决定了人类结肠癌的转移转移

WNT抑制剂在患者转移性肿瘤中的上调

自空气污染指数突变CC细胞仍然依赖WNT配体和腺瘤，早期CC表现为表观遗传沉默DKK1（丹麦克朗）和SFRP1系统WNT拮抗剂（González-Sancho等人，2005; 麦克唐纳等人，2009; Niida等人，2004; 铃木等人，2004)，我们在患者样本中测试了这些WNT信号抑制剂是否也会在我们上面描述的转移转移过程中上调。晚期转移性CC（TNM3,4和肝转移）显示较高水平的DKK1（丹麦克朗）和SFRP1系统比非转移性CC高（约3–6倍；图图1A–C;S2系列)最显著的是CD133⁺细胞，支持晚期转移性CC中WNT-TCF的抑制。

转移性肿瘤患者部分ES-样信号上调

除了已知的HH-GLI和WNT-TCF通路成分和靶点外，我们还通过qRT-PCR测量了我们之前在人脑胶质瘤干细胞中描述的ES细胞样信号的水平（Clement等人，2007; Zbinden等人，2010). 此签名的核心由NANOG公司,华侨城4号和SOX2标准，如ES细胞（Boyer等人，2005)，但特征也包含其他干细胞基因，如KLF4型和BMI1公司（克莱门特等人，2007)，类似于在分化细胞中诱导类ES-状态的重编程基因集（高桥和山中，2006; Yu等人，2007). 类ES-特征成分在CD133中富集⁺ 与CD133型⁻所有情况下的单元格(图1C)支持将其用作茎干标记。总的来说，ES-like信号的平均值稍高（约1.5倍），但在CD133中显著增强⁺ 与CD133型⁻晚期和转移性CC细胞与非转移性CC的比较(图1A–C;S1（第一阶段）):NANOG公司,华侨城4号和BMI1公司显示出微小变化（图图1C;S1（第一阶段）)，但是SOX2标准和KLF4型CD133明显增加⁺和CD133⁻转移性细胞与非转移性CC（2~8倍；图1A–C). 自SOX2标准和KLF4型在这两个人群中都有所增加，但在显示CD133的热图中这些增加并不明显⁺超过CD133⁻比率（比较图1A与.1摄氏度).

HH-GLI在CC细胞中与WNT-TCF功能上位体外

是什么驱动了我们上面描述的转移过渡期基因表达的变化？为了研究CC途径和癌基因之间可能的相互作用，从而解释我们在转移转移过程中观察到的基因表达水平的变化，我们首先修改了HH-GLI和WNT-TCF的活性体外在许多初级CC和Ls174T细胞系中，用作现场标准(例如van de Wetering等人，2002)，并对结果的表型进行评分，然后测试几个CC癌基因和肿瘤抑制因子修改GLI1水平或活性的能力。

为了阻断TCF功能，我们使用了一种与雌激素受体配体结合域（ERT2）融合的改良型dnTCF，从而使其依赖于雌激素类似物他莫昔芬（TAM）的添加。TAM诱导的dnTCF4抑制内源性TCF活性^ERT2系统消除稳定转染CC Ls174T细胞的集落形成(图2A). 同样，所有受试CC细胞的增殖体外作为单层或三维胶原凝胶，被dnTCF4抑制(图S3A和B)，完美再现了以前的数据(例如van de Wetering等人，2002).

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图2

调节CC细胞WNT-TCF和HH-GLI水平的作用

1. Ls174T-dnTCF4的图像^ERT2系统用结晶紫染色后，菌落在平板上。如前所述，用慢载体转导细胞。添加TAM（+TAM）激活的dnTCF4^ERT2系统并与模拟处理细胞（−TAM）进行比较。对照细胞（c）用GFP纯亲本慢载体转导。还使用ERT2部分±TAM进行了对照分析，确认ERT2或TAM本身没有不良反应（未显示）。量化如所示图S4A.
2. 量化抗增殖作用的挽救，显示为每个场计数的BrdU+核/总DAPI标记核shSMOH公司通过GLI抑制剂SUFUH通过表达shSUFUH公司。两个主要CC的结果如图所示。>每个条件统计10个字段。星号表示有效(对<0.05）学生的变化t吨-测试。ns：不显著。误差条代表标准误差。
3. mCC11细胞中HH-GLI、WNT-TCF和ES样干性特征的选定关键基因在表达cDNA或shRNA后通过qRT-PCR确定的早期（16小时）变化的热图，如图所示。数值是归一化后单个实验值与对照值（仅转染GFP的细胞）的比值。CC14和Ls174T的结果如所示图S4B。白色方框表示0.7–1.4范围内的比率值。蓝色方框表示等于或小于0.5的比率值。红色方框表示等于或大于1.5的值。
4. GLI1和cMYC之间的正调节环。qRT-PCR测定的mRNA表达水平显示为与对照转染（仅GFP）细胞的比率。热图颜色和值如（C）所示。cMYC水平的提高是通过其过度表达获得的，而内源性cMYC活性的阻断是通过dnMYC的表达获得的（也称为OMOMYC；Soucek等人，2002). 注意的一般差动调节GLI1型和PTCH1与GLI3和第21页后者是一个经证实的cMYC目标。GLI2型水平未受影响。缺乏对PTCH1型GLI1目标（Agren等人，2004)，何时GLI1型Ls174T细胞中cMYC上调可能是由于不同的靶向反应动力学（参见Zbinden等人，2010).

用特定shRNA敲除SMOH阻断HH-GLI1通路(shSMOH公司; 克莱门特等人，2007)或通过表达编码GLI3R的互补DNA（cDNA）（Varnat等人，2009)废除Ls174T菌落形成(图2A;第4页). 相反，HH-GLI的激活增强shPTCH1型（Varnat等人，2009)或通过增强GLI1的表达（Stecca等人，2007)菌落数量增加～5倍(图2A;S4A系列). 特异性得到了GLI1表达增强或抑制因子敲低与shSUFUH公司针对GLI功能的关键负调节器（Svärd等人，2006)，通过shSMOH公司(图2A和B).

引人注目的是，GLI1和shPTCH1型挽救了dnTCF4的抑制作用(图2A;S4A系列). 这表明HH-GLI作用于WNT-TCF下游或并行，增强的HH-GL绕过了WNT-TCF功能的要求。

靶基因表达揭示WNT-TCF与HH-GLI的相互作用

通过qRT-PCR监测WNT-TCF和/或HH-GLI途径调控后原代（第3-6代）局部CC（CC14；TNM4）、CC肝转移（mCC11）和CC细胞系（Ls174T）细胞早期基因表达的变化。正如预期的那样，dnTCF4对内源性WNT-TCF信号的阻断导致了dnTCF5对隐窝/腺瘤WNT-TCF信号的抑制（van de Wetering等人，2002)，但它并没有降低真正的HH-GLI途径活性标记的表达GLI1型和PTCH1型(图2C;S4B系列). 反过来，通过以下途径阻断内源性HH-GLIshSMOH公司或GLI3R被抑制GLI1型和PTCH1型如预期（Clement等人，2007; Varnat等人，2009)，但它没有抑制WNT-TCF靶点(图2C;S4B系列)，表明，体外、WNT-TCF和HH-GLI并行作用。

与阻断内源性活性的结果相反，GLI1或shPTCH1型（～2–4倍，测量单位：GLI1型或PTCH1型级别）(图2C;S4B系列)导致WNT-TCF靶点受到抑制，进一步表明增强的HH-GLI可以免除WNT-TCC活性。的转录GLI3公司还被GLI1或shPTCH1型(图2C;S4B系列)，但由与shSMOH公司在测试的多个CC细胞中(图2C;S4B系列)，如预期(例如Varnat等人，2009). 此外，GLI3公司也被dnTCF4阻断WNT-TCF功能所抑制，这与它在中枢神经系统中是WNT-TCF靶点一致（Alvarez-Medina等人，2008).

核心ES-like干细胞特征受HH-GLI而非WNT-TCF调节

类ES-签名成分的表达NANOG公司,SOX2标准,华侨城4号和KLF4型在所有测试的CC中检测到(图2C;S4B系列). 有趣的是，他们被发现需要内源性HH-GLI活性，这一点可以通过阻断shSMOH公司或GLI3R，其水平通过表达GLI1或shPTCH1型(图2C;第4b页). 相反，它们不受dnTCF4阻断内源性WNT-TCF信号传导的影响(图2C;S4B系列). 我们得出结论，HH-GLI而非WNT-TCF调节人类CC的ES-like干细胞特征。

cMYC公司由WNT-TCF和HH-GLI调节，并与GLI1建立正回路体外

cMYC公司已被描述为小鼠肠道肿瘤形成所需的关键WNT-TCF靶点（Sansom等人，2007). 因此，我们分析了其在人类CC中的表达以及WNT-TCF或HH-GLI途径调节后其mRNA水平的变化。阻断WNT-TCF或HH-GLI信号传导强烈降低了cMYC公司通过qRT-PCR测量(图2C)，表明HH-GLI和TCF在体外cMYC有趣的是，GLI1通常可以抑制cMYC公司通过dnTCF4(图2C;S4B系列)与菌落分析救援一致(图2A)以及通过GLI1或shPTCH1型增强cMYC公司mCC11细胞中的水平(图2C).

表型(图2A和B)和基因表达(图2C)上述分析提出了WNT-TCF和HH-GLI并行作用的可能性体外，可以进行功能交互。为了验证这一观点，我们首先分析了cMYC，一种WNT-TCF-和HH-GLI调节基因（见上文）对GLI1的影响，因为cMYC可以调节GLI1Gli1公司在小鼠NIH3T3细胞中（Zwerner等人，2008). 通过转染cMYC公司CCs中的cDNA质粒导致GLI1型qRT-PCR测定的水平(图2D). 更重要的是，我们可以证明GLI1型CC细胞中的表达体外需要内源性MYC活性，如用显性负结构（dncMYC）阻断内源性cMYC所示(图2D). 这些结果，以及cMYC不通过外源性GLI1影响GLI萤光素酶报告基因活性的发现(图S5)表明GLI1和cMYC形成正转录调控环，但cMYC不影响GLI1蛋白的活性。不同于GLI1型,GLI2型表达基本上没有变化，而GLI3公司被cMYC抑制，被dnMYC解除，与真正的CC-cMYC靶点的抑制程度相似p21蛋白(图2D).体外因此，cMYC似乎通过上调GLI活性GLI1型mRNA水平，但也通过抑制GLI3公司mRNA表达以及由此衍生的GLI3R。

βCAT诱导GLI1活性并与GLI3R相互拮抗

除cMYC外，我们还分析了HH-GLI与其他CC癌基因可能的功能性相互作用，这些癌基因以βCAT开始，βCAT是CC的典型癌基因。在GLI-结合位点荧光素酶报告物分析中，整体和磁激活细胞分选（MACS）CD133中致癌βCAT诱导的GLI1活性的表达均呈剂量依赖性增强⁺CC干细胞群(图3A和B;S6A和B). 在dnTCF存在的情况下也观察到这种效应(图3B;S6B系列)提示βCAT对GLI1的作用与TCF功能无关。癌基因βCAT同样增强了核SV40NLS-GLI1融合的活性，但没有增强VP16-GLI1锌指结构域融合的活性（Ruiz i Altaba，1999)或全长GLI3弱激活剂(图3C). 这些结果很重要，因为它们表明了核作用和特异性。

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图3

调控HH-GLI和WNT-TCF相互作用以及CC癌基因和抑癌基因对GLI1活性的调节

A、 B。纯化CD133中GLI依赖性荧光素酶的检测⁺wt或突变（mGBS）报告物显示的mCC11（A）和Ls174T（B）细胞。CC14及其CD133的检测⁺人口显示为图S6如图所示，此面板和其他面板中的三角形显示随着第二个质粒浓度的增加而产生的剂量依赖性效应(例如A左三角形下方的GLI1+βCAT的βCAT数量增加，GLI1质粒数量不变）。

C、。GLI依赖性萤光素酶测定显示βCAT（bCAT）对嵌合GLI1蛋白的作用。详见正文。

D。如CD133所示，使用wt（TOP）或突变体（FOP）报告子进行TCF依赖性萤光素酶报告子测定⁺mCC11细胞。CC14、CD133的类似结果⁺CC14和Ls174T细胞如所示图S7A–C.

E.公司。GLI依赖性荧光素酶报告子检测致癌KRAS（KRAS）对GLI1活性的调节^V12G版本)，甲基乙基酮1（p45MAPKK^S222D型)和AKT1（N-肉豆蔻酰化AKT1）。CD133中的类似结果⁺mCC11单元格如所示图S8.

F、。用U0126抑制内源性MEK1活性或用SH6抑制内源性AKT活性（10µM，48 h）后，通过qRT-PCR测定CC14和mCC11中关键HH-GLI和WNT-TCF途径基因的表达变化。用看家基因对表达值进行标准化，如图1并显示了实验细胞与对照模拟处理细胞的比率。白色方框表示0.7–1.4范围内的值。值等于或小于0.5的蓝色框。数值等于或大于1.5的红色框。

G.公司。依赖GLI的荧光素酶报告者通过增加外源性p53和抑制内源性p53活性来检测GLI1的调节shp53基因如前所述，还使用了突变（mt）报告子。

H。所确定的CC细胞中WNT-TCF、HH-GLI、致癌基因和肿瘤抑制因子之间的拟议相互作用方案体外.

除非用三角形标注，否则质粒以类似浓度进行核感染，其中,第二位质粒的比例为1/1。显示了与GLI1值相关的百分比变化（等于100%，均在肾小球内部控制标准化后）（A–C、E和G）。与βCAT值相关的百分比变化如（B和D）所示。ns：行末样本之间的差异不显著。星号表示有效(对<0.05）学生的变化t吨-测试。误差条代表标准误差。

尽管之前的研究表明GLI1型TCF的活动（Akiyoshi等人，2006)，我们无法重现这种效果(图2C、3A和B；S4B和S6). 其他研究也强调了GLI3R和βCAT之间的拮抗作用（Ulloa等人，2007). 在这种情况下，我们可以揭示它们对TCF活性的剂量依赖性相互拮抗，如TCF结合位点游离酶（TOP）报告子分析和CD133中所示⁺人口(图3D;S7A–C型).

作为对照，我们发现CCs中也存在内源性HH-GLI1活性（Varnat等人，2009)，并在荧光素酶报告基因测定中测量了内源性TCF活性，发现mCC11细胞中的活性是背景的2倍，CC14细胞中的活性是背景的3倍(图3D;S7C系列). CC14 CD133中TCF活性低或缺失⁺与未分类人群相比，在未分类人群中，细胞受到dnTCF的抑制(图S7A和D). 其他对照组显示突变GLI（GLImut）或TCF（FOP）报告子不活跃(图3A、B、D、E和G;第5-8页).

综上所述，我们的数据表明，βCAT可以独立地诱导肿瘤体及其CD133中的TCF和GLI1阳性活性，并拮抗任何GLI3R功能⁺干细胞(图3H).

CCs中GLI1活性受RAS-MEK/AKT、PTEN和p53调节

除了βCAT外，肿瘤抑制因子p53的功能丧失和致癌性KRAS突变的增加也是CC进展期间的常见事件（Vogelstein等人，1988). 为了测试这些事件是否会像影响其他癌细胞一样影响CC细胞中的GLI1活性（Stecca&Ruiz i Altaba，2010; Stecca等人，2007)，我们测试了增强致癌KRAS（KRAS）表达的效果^V12G版本)和下游组件MEK1（p45MAPKK^S222D型)和AKT1（N-肉豆蔻酰化AKT1）对GLI1活性的影响，使用GLI-荧光素酶报告物分析。RAS、MEK和AKT以剂量依赖性方式增强不同CC及其CD133中GLI1的活性⁺亚种群(图3E;第8节). 作为对照，GLI3R完全抑制致癌KRAS-、AKT-和MEK-诱导的GLI1活性水平，突变报告基因不活跃(图3E;第8节).

为了测试CC细胞内源性GLI1活性是否需要内源性RAS-MEK信号，我们用小分子抑制剂U0126阻断MEK1的活性，或用SH6抑制剂阻断AKT的活性，这两种处理均在10µM下持续48小时GLI1型,PTCH1型,HIP（热等静压）和cMYC公司用qRT-PCR检测CC14细胞中的这些蛋白，而mCC11细胞中的MEK阻断仅能抑制这些蛋白，所有这些都与对照DMSO处理的细胞相比(图3F). 此外，MEK和AKT抑制剂均抑制上皮-间充质转化（EMT）和CC转移细胞标志物蜗牛1仅在转移性mCC11细胞中(图3F). 这些处理并不影响SHH公司或WNT-TCF签名(图3F)支持致癌RAS下游内源性MEK/AKT信号传导对CC内源性GLI1功能的特定需求。一直以来，外源性GLI1活性也被PTEN抑制，PTEN是AKT的主要抑癌剂和抑制剂(图3E;第8节).

与PTEN一起，p53是一种重要的CC肿瘤抑制因子，在其他情况下调节GLI1活性（Stecca和Ruiz i Altaba，2009,2010). 内源性p53基因敲除shp53基因增加而外源性p53降低CD133中GLI1活性⁺GLI-荧光素酶报告检测显示Ls174T（p53 wt）细胞呈剂量依赖性(图3G). p53和shp53基因使用突变报告基因对GLI1无效(图3G). 因此，GLI1的水平和活性可以通过CC细胞中多种致癌和抑癌物质的输入进行调节(图3H).

微环境对WNT-TCF和HH-GLI的差异调节

上述结果来自具有高WNT-TCF特征的细胞(图1). 然而，患者中晚期CC和肝转移的WNT-TCF信号水平受到抑制，这增加了微环境可能影响通路使用的可能性。为了测试这个想法，我们比较了体外上述基因表达特征与免疫低下小鼠移植的同胞细胞中的基因表达特征相同。分析都是用分类的CD133进行的⁺和CD133⁻之后的单元格体外培养物和解剖的异种移植物。

对HT29、Ls174T、DLD1 CC细胞系和原代mCC11 CC细胞的分析表明，WNT-TCF特征成分的高表达(例如LGR5,SOX4系统,AXIN2型,CD44细胞,cMYC公司)隐窝/腺瘤的特征（van de Wetering等人，2002)被普遍压制体内与生长的同胞细胞中的相同特征相比体外，尤其是CD133⁺单元格(图4A–C;第9部分). 相反，扩展的HH-GLI签名(GLI1型,GLI2型,HIP（热等静压）,蜗牛1,PTCH1型,嘘)和核心ES-like(NANOG公司,华侨城4号,SOX2标准)签名普遍增强体内与体外与HH-GLI对ES-like干细胞信号的调控一致，但与WNT-TCF无关，CD133的表达水平差异也最大⁺细胞（～3–8倍）(图4A–C;第9部分). WNT-TCF的相反变化与HH-GLI和ES-like干细胞特征在CD133中单个特征的平均基因表达水平图中清晰显示⁺单元格，其中体外正常化的值等于1(图4D). 与体外-至-体内WNT-TCF高低转换，WNT-LRP抑制剂的表达DKK1（丹麦克朗）也增加了（约2–4倍）体内与体外，而βCAT和TCF4类未显示一致的更改体外与体内(图S9).

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图4

WNT-TCF和HH-GLI通路成分在CC细胞中的差异表达体外与体内异种移植

A–C。用qRT-PCR测定CD133的单个基因表达变化直方图⁺（红色条）和CD133⁻（蓝色条）单元格，在标准化后，如中所示图1，显示用于HT:HT29中的选定WNT-TCF（A）、HH-GLI（B）和ES样干性基因（C）；Ls:Ls174T；mCC:mCC11细胞。v：体外文化；x；体内异种移植。其他基因的分析如所示图S9.不包括s.e.m.的误差条，以提高清晰度。然而，星号表示重要(对<0.05）学生的变化t吨-每种情况下使用PCR三倍进行检测。ns：不显著。

D。CD133中平均基因表达变化的对数标度表示⁺培养的细胞（细胞系Ls174T和HT29以及原代mCC11）体外与体内在异种移植中。主要数据来源于（A）和图S9HH-GLI、βCAT/TCF和ES-like干细胞特征的值代表了正常化后的平均值GLI1型,GLI2型,HIP（热等静压）和PTCH1型对于HH-GLI，共LGR5级,SOX4系统,AXIN2型,cMYC公司和CD44细胞WNT-TCF，和NANOG公司,SOX2标准和华侨城4号如面板A-C和图S9.体外水平等于1以规范化图形，并且体内相应地调整了水平。星号表示有效(对<0.05）相同单元格/特征平均值之间的变化体外与体内.ns：差异不显著。注意CD133中的明显差异⁺细胞。

这些意想不到的结果表明体外微环境对晚期和转移性CC细胞施加了不适当的隐窝/腺瘤/早期CC状态。因此，上述途径和分子相互作用体外适用于具有早期非转移性（TNM1,2）特征的CC。数据还表明，相比之下，晚期和转移性CC（TNM3,4）以及肝转移的状态只能得到忠实的维持体内在异种移植物中，其特征与患者转移性肿瘤的特征相似(图1).

TCF活性对CC细胞系衍生肿瘤的生长不是严格要求体内

患者样本中WNT-TCF隐窝/腺瘤特征的一般抑制(图1)和异种移植与体外试验相比文化(图4)提出了WNT-TCF信号可能不太集中的可能性体内比怀疑的结果体外分析。探讨CC细胞WNT-TCF活性的需要体内，我们首先利用两个已建立的CC细胞系来证明TCF功能的关键作用体外：Ls174T-dnTCF4^道克斯和DLD1-dnTCF4^道克斯（van de Wetering等人，2002). Ls174T是一个含有活化βCAT的近二倍体细胞系，而DLD1是一个带有突变APC的微卫星不稳定细胞系。选择这些细胞是因为它们具有代表大多数CC的互补表型。它们是稳定的克隆，仅在添加强力霉素（dox）后显示出均匀的dnTCF4表达。Ls174T-dnTCF4^道克斯移植的细胞体内显示TCF靶点抑制水平与体外，与未经处理的细胞对照组相比，显示出同等效力和诱导系统的正确操作体外和体内但这对肿瘤生长没有影响(图5A-C)：Ls174T-dnTCF4引起的肿瘤^道克斯细胞或亲代Ls174T细胞经和不经dox处理后显示出相似的生长曲线和肿瘤外观(图5A和B). 这与同等程度的抑制作用一样显著体外导致生长完全停滞(图2A;第3章).

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图5

dox诱导的TCF4抑制对小鼠CC-Ls174T和DLD1细胞系异种移植物生长的影响

A、 B、D、E。异种移植生长曲线（A和E）和代表图像（B和D）控制（Ctrl）和dnTCF4^道克斯用强力霉素（DOX）处理过表达Ls174T（A和B）或DLD1（D和E）细胞的（dnTCF4）体内.（A和E）中指向下方的箭头表示开始接受dox治疗的时间体内肿瘤出现后。（E）中向上的箭头表示终止dox治疗的时间+dox->-dox in（D下部面板）表示去除dox后肿瘤的生长。概述了（D）中的肿瘤。n个=每种情况8个肿瘤。星号表示重要(对<0.05）学生的变化t吨-测试。误差条代表标准误差。

C、。dox诱导的dnTCF4诱导Ls174T和DLD1细胞基因表达的变化体外和体内显示为不含dox的实验细胞与对照细胞的比率，所有这些细胞均经过标准化处理，如图1。白色方框表示0.7–1.4范围内的值。值等于或小于0.5的蓝色框。数值等于或大于1.5的红色框。

F、。从第49天开始（E），单个复发DLD1异种移植瘤的生长曲线。一个肿瘤未经治疗（蓝线），继续生长，动物被安乐死。另外三只再次接受dox治疗的小鼠显示肿瘤生长受阻，肿瘤体积缩小。为了简化比较，在重新开始dox治疗前的第49天，肿瘤体积均等于1，以使所有肿瘤共享相同的起点。第49天的实际平均肿瘤体积如（E）所示。

G.公司。CD133型⁺/CD133型⁻DLD1细胞的基因表达率体内与体外，通过qRT-PCR测定，归一化后如图1正如我们发现的其他CC细胞（Varnat等人，2009)，DLD-1 CD133⁺细胞富集了CD133型与CD133相比的mRNA水平⁻电池（6.7倍体内和7.6倍体外). CD133型⁺细胞更丰富体内比体外(16%与分别为.5%）。盒子的颜色如（C）所示。

DLD1至dnTCF4^道克斯用dox处理的细胞也将TCF靶点抑制到相同的水平体外和体内与未经处理的细胞相比，但肿瘤出现后TCF阻断确实抑制了生长，肿瘤在1周内消失(图5C-E).

测试TCF阻断是否能抑制所有致瘤DLD1-dnTCF4^道克斯对可能造成复发威胁的细胞，dox治疗在～1个月后终止，此时未检测到肿瘤，并对小鼠进行肿瘤复发生长检查。停止dox治疗后，DLD1-dnTCF4^道克斯肿瘤迅速生长(图5E; 5/8例）。复发不是由于逃逸者，因为新的dox治疗再次抑制肿瘤生长(图5F). 这些结果证明了dnTCF4的有效性体内.

如Ls174T的情况(图4)，发现DLD1细胞含有CD133⁺HH-GLI和ES-like干细胞特征成分水平增加的亚群：GLI1型,NANOG公司,华侨城4号,SOX2标准和体内与体外DKK1(图5G). 这些细胞还显示TCF靶点水平降低：AXIN2型,LGR5级和EPHB3型,体内与体外，与CD133相比⁻单元格(图5G).

因此，虽然DLD1细胞对TCF抑制反应正常，但Ls174T细胞未受影响，这表明WNT-TCF对CC生长不是严格要求体内.

主要CC不需要TCF活动体内它的阻断可以促进肿瘤生长

为了扩展和进一步控制这些发现，我们使用了Ls174T和含有dnTCF4的原代CC36、CC14和mCC11细胞^ERT2系统在这种情况下，dnTCF4融合到TAM诱导的雌激素受体模块（见上文）。此外，为了绕过克隆dnTCF4的潜在问题^道克斯细胞系，我们使用混合dnTCF4^ERT2系统或对照组（仅ERT2）稳定转染CC细胞。然后将不同的细胞移植到皮下，并在检测到可触及的肿瘤后口服TAM或玉米油载体对照品。

Ls174T-dnTCF4的异种移植^ERT2系统细胞在有TAM的情况下比没有TAM的条件下生长得同样好，完美地模拟了Ls174T-dnTCF4的结果^道克斯(图5A和B；6A和B). 在非转移性CC14或转移性mCC11中，dnTCF4活性不影响肿瘤生长、细胞增殖、外部或组织学外观(图6A-D)而TCF靶点在所有细胞中的抑制程度与体外(图6E). TAM处理对Ls174T-ERT2对照细胞无影响(图6A).

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图6

TAM诱导的TCF4阻断对小鼠移植Ls174T和原代人CC的影响

答：。携带dnTCF4的Ls174T、CC14、mCC11或CC36细胞移植瘤的生长曲线^ERT2系统或ERT2单独使用（+）或不使用（−）TAM治疗，如图所示。绘图显示对数Y（Y）-轴刻度。当肿瘤可见时，箭头指向TAM添加的开始。生长曲线重叠，CC36除外。ns：在学生中不显著t吨-测试。误差条代表标准误差。

B。Ctrl（ERT2，+TAM）或dnTCF4（dnTCF5）异种移植瘤的代表性图像^ERT2系统，+TAM）。

C、 D。（B）所示异种移植物的组织切片显示BrdU掺入（顶部两行细胞核为棕色，C）或H&E染色后的形态学（底部一行，C），以及细胞增殖定量（D）。星号表示有效(对<0.05）学生的变化t吨-测试。ns：不显著。误差条代表标准误差。

E.公司。用TAM（+）或类似于（A和B）中所示的载体（-）连续治疗8-12d后采集的人类CC异种移植物的RT-qPCR分析。这些值是表达dnTCF4的肿瘤正常化后人类特异性基因表达水平的比值^ERT2系统仅在含有或不含有TAM的情况下表达控制ERT2部分。在没有TAM诱导的情况下，比率为～1。白色方框表示0.7–1.4范围内的值。值等于或小于0.5的蓝色框。数值等于或大于1.5的红色框。

比例尺=5 mm（B），100µm（C）。

与TCF阻断无效的Ls174T、CC14和mCC11相比，CC36-dnTCF4^ERT2型与未处理的细胞相比，用TAM处理的细胞显示BrdU掺入增加了约2倍，产生的肿瘤体积增加了约8倍(图6A-D). 基因表达分析体内证实了TCF靶点的抑制程度与其他初级CC相同，并揭示了TCF的上调DKK1（丹麦克朗）和HH-GLI途径(图6E). 此外，它揭示了cMYC公司来自TCF活动体内(图6E). 因此，初级人类CC在小鼠中的生长通常不需要WNT-TCF活性，令人惊讶的是，其抑制甚至可以促进肿瘤生长。

CC36 CD133⁺具有细胞自主TCF阻断的细胞胜过竞争性同胞细胞体内

测试CD133⁺CC36中的干细胞受到TCF阻断的影响，为了辨别这种影响的细胞自主性，我们使用了我们开发的一种新的“红/绿”竞争分析（Varnat等人，2009; Zbinden等人，2010). 本试验使用混合荧光红（RFP⁺)和绿色荧光蛋白（GFP⁺)转导的肿瘤细胞可以通过体内CD133在肿瘤分离和MACS分类后的成像和FACS分析⁺从而跟踪CD133的行为⁺干细胞群体。

CC36-dnTCF4型^ERT2系统; GFP公司⁺与wt兄弟RFP竞争测试的电池⁺红/绿试验中的细胞显示TCF抑制GFP⁺细胞通过添加TAM（+TAM肿瘤图7)导致总体绿色dnTCF4增加^ERT2系统; GFP公司⁺与对照、兄弟RFP相关的人口⁺人口。这在整个肿瘤图像和分析分类CD133的人群大小的FACS图中都可以看到⁺; GFP公司⁺ 与CD133型⁺; 招标书⁺细胞，总是与未经TAM治疗的相同肿瘤相关（−TAM肿瘤；图7). 而CD133有相似的种群⁺+TAM中的单元格与−TAM肿瘤（15%与.12%），CC36-dnTCF4^ERT2系统; GFP公司⁺; CD133型⁺TCF活性受到抑制后，干细胞数量增加了3.5倍，始终与RFP相关⁺对照人群。这表明WNT-TCF活性限制了CC36干细胞的扩增体内以细胞自主的方式。

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图7

体内竞争显示CD133增强⁺TCF阻断后的CC干细胞群

用RFP转导的CC36细胞⁺（红色）慢载体，或CC36-dnTCF4^ERT2系统用GFP转导⁺（绿色）慢载体以相似的数量混合（FACS绿红比为0.8）体外也存在未转导的细胞（FACS图中的黑细胞）。将这种混合物皮下注射到免疫缺陷小鼠体内。他们每天用TAM（+TAM）或仅用玉米油载体（−TAM）治疗一次，持续8天，导致MACS分类CD133的绿/红比率增加3.5倍⁺与对照肿瘤（−TAM）相比，用TAM治疗的肿瘤中的细胞。在没有TAM的肿瘤中，绿细胞比红细胞增多，可能是由于系统的轻微泄漏导致了没有TAM时的少量dnTCF4活性。然而，+TAM肿瘤比−TAM肿瘤绿色，后者呈黄色，这是因为绿色和红色细胞数量接近相等，如底部面板中的显微照片所示。n个=每个样品2个。平均比率显示在FACS图中。比例尺=4 mm。

体外文化强加了早期CC身份，增强了WNT-TCF并降低了HH-GLI特征水平

我们发现CC细胞生长的微环境决定了WNT-TCF和HH-GLI途径的水平和使用。对这一令人惊讶的发现的赞赏对于理解为什么之前未经测试但被广泛接受的WNT-TCF成瘾性腺瘤向转移性CC和肝转移的延伸并不合适至关重要：

1. 的特征和签名早期的,非转移性（TNM1,2）CCs低HH-GLI和高WNT-TCF强加于生长时晚期转移性CC和CC肝转移细胞体外阐明CC细胞增殖和存活的分子机制体外例如CC癌基因和我们描述的GLI1-cMYC调节环对GLI1活性的增强，因此与TNM1,2肿瘤相关，并与肿瘤的进展有关。
2. 相反晚期和转移性（TNM3,4）CC仅得到忠实维护体内异种移植物中HH-GLI高、WNT-TCF（和cMYC公司)低。WNT-TCF成瘾丧失体内因此与转移性CC和肝转移有关。

两者都没有体外回顾过去，无论是培养还是异种移植物都被发现是患者肿瘤行为的完美预测因素。然而，我们的数据表明，检测转移性CC和转移性CC可能具有的WNT-TCF的功能是不合适的体内使用体外文化。相反，我们的结果表明体内对小鼠进行的HH-GLI和WNT-TCF信号的分析更紧密地概括了患者肿瘤的情况。一直以来，在本文修订期间发表的一项研究表明，分泌因子对CC中WNT-TCF活性的影响（Vermeulen等人，2010). 这也表明CC干细胞具有高WNT-TCF活性，但不幸的是，它们的关键移植试验依赖于未指定TNM阶段的细胞，这些细胞被选为高TCF-结合位点-GFP表达者体外由于我们发现在生长的CC细胞中WNT-TCF活性较高，因此不清楚实际测量的是什么体外可以是虚构的。

转移性CC和肝转移通常需要WNT-TCF体外但不是体内

体外因此，在具有非转移性特征的CC中（适当的阶段或征税由体外微环境），我们发现WNT-TCF和HH-GLI都是CC细胞增殖和生存所必需的，这与以前的工作完全一致(例如van de Wetering等人，2002; Varnat等人，2009).

WNT-TCF的此类要求体外在所有CC中-独立于原件同一性导致了公认的普遍观点，即晚期和转移性CC维持并需要一个隐窝/腺瘤/早期CC WNT-TCF计划(例如Chen等人，2009; Huang等人，2009; van de Wetering等人，2002).

体内，我们表明WNT-TCF活性不是CC生长的一般必要条件，使用两种不同的方式激活TCF阻断。此外，我们提供证据支持以下观点：内源性的WNT-TCF活性实际上可以对抗肿瘤生长和转移生长。这些发现与所有预期背道而驰，但重要的是，它们并不反驳或否认任何先前的发现实验的结果。这个体内在晚期转移性CC中，TCF活性的要求刚刚被假定，但从未在保持其身份的条件下进行实际测试。

我们发现只有一个细胞系被检测体内肿瘤生长需要TCF活性，但重要的是，所测试的初级CCs都没有。此外，在所有分析的病例中，抑制TCF活性都会促进转移生长。虽然未来对其他初级CC的研究将解决这些表型的外显率以及与其他参数的可能相关性(例如DLD1，但不是Ls174T，细胞是微卫星不稳定的），我们的数据已经表明TCF功能不是高级CCs的一般要求体内，而不是体外（这项工作；van de Wetering等人，2002). 此外，他们认为WNT-TCF活性的抑制，如转移患者样本中所见，会促进转移行为。

HH-GLI和WNT-TCF相互作用

在本研究中，我们还探讨了HH-GLI与WNT-TCF以及CC中关键致癌和抑瘤输入的可能相互作用，试图阐明可能推动早期TNM1,2 CC向转移状态发展的机制。

我们在这里描述的转移转移时，HH-GLI1的上调和早期隐窝/腺瘤样CC WNT-TCF信号的下调似乎是相关的：通过实验增强的HH-GLI对TCF信号的下调，可以再现转移性CC的低WNT-TCGF/高HH-GL特征。相反，HH-GLI通过实验性TCF阻断而增强。

在具有非转移性特征的CC和生长的转移性CC中体外在微环境施加非转移状态的情况下，HH-GLI和WNT-TCF可能在多个水平上相互作用：通过共同调节cMYC公司通过对抗的方式GLI3公司.因为我们发现WNT-TCF调节GLI3公司转录，其阻遏功能（GLI3R）可能介导WNT-TCF对GLI1的限制性活性。然后，这种情况将通过增强HH-GLI信号消除，HH-GLI信号抑制GLI3公司和WNT-TCF签名级别。

相反，我们提供的证据表明，CC生长所需的βCAT（Roh等人，2001)，可在CCs及其CD133中独立于TCF负调节GLI3R和正调节GLI1外源性活性⁺干细胞群体。这些结果与以前关于βCAT与GLI3R结合的数据一致（Maeda等人，2006; Ulloa等人，2007)也可能是GLI1（Liao等人，2009)在其他单元格中。综合起来，数据表明HH-GLI和WNT-TCF在非转移性CC中存在交互平衡，在不同水平上存在交叉调节(图2H).

GLI1活性由癌基因和CC进展特征的肿瘤抑制因子的丢失促进

然后是什么驱动高-低WNT-TCF和低-高HH-GLI途径水平开关，最显著但不限于CD133⁺CC干细胞处于转移过渡期？除了βCAT促进GLI1活性外（见上文），我们还发现cMYC、致癌KRAS-MEK/AKT以及PTEN和p53的缺失也可以增强GLI1转录活性。这些积极影响在整体和CD133中都能检测到⁺CC细胞群，支持干细胞中GLI1的调节至关重要的观点。GLI1同样可以通过致癌KRAS上调βCAT和丢失p53间接增强（Janssen等人，2006; Sadot等人，2001).

虽然GLI1调节的机制才刚刚开始被理解，并且可能与环境有关（Lauth等人，2010; Stecca&Ruiz i Altaba公司，2010; Zbinden等人，2010)最终结果是，随着时间的推移，以不可逆的方式促进GLI1活性的事件逐渐累积。这些发现支持并扩展了一个模型(图9; Ruiz i Altaba等人，2002,2007)在这种情况下，GLI1通过累积致癌负荷升高到临界阈值以上，从而驱动转移转变的分子开关，部分是通过驱动上皮-间充质转变（Varnat等人，2009)，隐窝样WNT-TCF抑制和增强ES-like特征。转移转移发生后，早期非转移性肿瘤中存在的一些调节相互作用将停止，例如GLI1和cMYC之间的正反馈调节。

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图9

转移转移的分子机制模型和癌症干细胞通过重新编程的进化

1. 非转移性肿瘤中通路使用的变化示意图与转移性CC，通过体外转移性CC的条件和体内异种移植条件。重点介绍了WNT-TCF和HH-GLI相互作用。
2. 当GLI1的活性水平（由多个癌基因和肿瘤抑制事件（癌基因负荷）的损失增强）达到阈值时，GLI1驱动转移转移的拟议作用模型。该模型概括了形态发生梯度解释，从而导致发育过程中不同的细胞命运。癌症干细胞的重编程被认为是GLI1在转移转移过程中驱动的。

肿瘤重编程与肿瘤干细胞向晚期和转移状态的进化

随着CC发生转移，HH-GLI依赖性ES-like信号的两个成分的水平，KLF4型和SOX2标准，CD133均增加⁺和CD133⁻细胞。尽管这一结果尚不清楚，但我们已经知道，正如首次在胶质瘤中发现的那样，几种类型的晚期人类肿瘤显示出类ES-信号（Clement等人，2007)以及后来的其他癌症（Ben-Porath等人，2008)至少SOX2（Gangemi等人，2009)和NANOG（Zbinden等人，2010)对胶质母细胞瘤干细胞和致瘤性至关重要体内因此，一种可能是具有增强的ES-like特征的CC干细胞变得更原始。

有趣的是，类ES-干细胞基因NANOG公司,华侨城4号,SOX2标准和KLF4型（i） 在晚期CC中存在和/或上调（本研究），（ii）均由CC和其他癌症中的HH-GLI1活性诱导并需要HH-GLI活性（Clement等人，2007; Stecca&Ruiz i Altaba公司，2009; Zbinden等人，2010; 这项工作）和（iii）形成一个模拟细胞重编程的队列（高桥和山中，2006; Yu等人，2007). 因此，我们认为癌干细胞从器官特异性（CC的隐窝样）进化到更原始（ES-like）和转移状态，这是通过GLI1驱动的表观遗传事件，类似于达到GLI1活性阈值后的重新编程(图9).

免疫细胞化学

细胞增殖通过BrdU掺入法测定48 h，然后用抗BrdU抗体（BD Biosciences）和辣根过氧化物酶（HRP）、异硫氰酸荧光素（FITC）或RITC结合二级抗体（Molecular Probes）染色。用蔡司Axiocam光学显微镜对标记细胞成像。

质粒，慢载体，CD133⁺选择、转染、菌落分析和PCR

GLI质粒如所述（Ruiz i Altaba，1999). β接触网N′Δ45克隆聚合酶链反应（PCR）并将NotI/BamHI插入pFLAG-CMV2载体（Sigma）。dnTCF4型^ERT2系统ERT2结构是E.Batlle和G.Whisell（巴塞罗那）赠送的礼物。KRAS公司^V12G版本是M.Phillips（纽约）的一份礼物。致癌MEK1和AKT1如（Stecca等人，2007). cMYC和dnMYC（OMOMYC）是A.Trumpp（海德堡）和S.Nasi（罗马）（Soucek等人，2002)分别是。透镜和CD133⁺MACS选择如所示（Varnat等人，2009). 10⁶总数或CD133⁺将CC细胞的选定细胞群与5µg总脱氧核糖核酸（DNA）混合，并用Nucleofector（Amaxa）转染。16小时后，转染效率为70-90%，细胞收集在500µl Trizol（Gibco）中进行RNA提取，或在35 mm培养皿中进行菌落形成分析。3周后，对甲酚紫染色菌落进行计数。RT-qPCR反应条件如（Varnat等人，2009).

小鼠异种移植、转移和“红/绿”竞争分析

6至8周龄雌性NMRI小鼠接受每两次10⁵–10⁶每个人背部都有人类CC细胞。一旦发现肿瘤（1-2 mm），立即给予TAM（口服剂量为2 mg/天）或dox（饮用水中5%蔗糖中的2 g/L加上每2天一次500 mg的IP注射），并用卡尺定期测量肿瘤大小。在肿瘤接近法定大小限制之前，将小鼠处死。对于转移检测，10⁶Ls174T-dnTC4^ERT2系统将细胞注射到尾静脉中，并从注射后2周开始给予小鼠TAM或生理盐水1.5个月。肺部全部用X-Gal染色（Stecca等人，2007; Varnat等人，2009). 按照Varnat等人(2009)和Zbinden等人(2010).

我们感谢H.Clevers、M.Scott、A.Duquet、E.Fearon、N.Dahmane、C.Mas、A.Carleton、A.Melotti、A.Lorente-Trigos和所有Ruiz i Altaba实验室成员对手稿的讨论和/或评论。我们感谢E.Batlle和G.Whisell（巴塞罗那）提供dnTCF4^ERT2系统ERT2结构体，H.Clevers（乌得勒支）和J.Behrens（柏林）用于细胞，S.Nasi（罗马）、A.Trumpp（海德堡）和M.Phillips（纽约）用于结构体。ISC是人类前沿科学项目长期奖学金的获得者。这项工作得到了来自日内瓦Départment D’Instruction Publique的机构资金以及瑞士国家科学基金会、瑞士癌症联盟和Jeantet and Swissbridge Foundation向ARA提供的赠款的支持。

EMBO分子医学在线提供了支持信息。

利益冲突：ARA是Phistem的顾问并持有该公司股票。