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自由基生物医药。作者手稿；PMC 2013年7月15日发布。
以最终编辑形式发布为：
《自由基生物医药》，2012年7月15日；53(2): 289–296.
2012年5月19日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.freeradbiomed.2012.05.007
预防性维修识别码：项目经理3392471
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院379180
PMID：22618020

新型NOX4/NOX1抑制剂GKT137831在体内减轻肝纤维化和肝细胞凋亡

乔伊·X.江，1 陈香玲，1 Nobuko Serizawa公司，1 塞德里克·辛德拉莱维兹（Cedric Szyndralewiez），2 帕特里克·佩奇，2 凯特琳·施罗德，三 拉尔夫·P·布兰德斯，三 斯里德维·德瓦拉吉，4和娜塔莉·托洛克（Natalie Jörök）1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

活性氧（ROS）在慢性肝损伤和纤维化中起着关键作用。NADPH氧化酶（NOX）的同源物是活性氧的主要来源，但单个同源物在肝病中的确切作用尚不清楚。我们的目标是在药物抑制剂GKT137831的帮助下，确定NOX4在胆管结扎（BDL）诱导的肝纤维化中的作用，以及NOX4基因在小鼠中的缺失。GKT136731要么用于BDL的整个疗程（预防组），要么在术后10天开始（治疗组）。对含有和不含BDL的对照小鼠的原代肝星状细胞（HSC）进行分析，并研究NOX4抑制对HSC激活的影响。在野生型和NOX4中研究了FasL或TNFα/放线菌素D诱导的细胞凋亡−/−肝细胞。结果：在HSC中，NOX4通过TGF-β/Smad3依赖性机制上调。NOX4的下调降低了ROS的生成和NOX4活性−/−HSC减弱。氮氧化物4−/−肝细胞对FasL或TNFα/放线菌素D诱导的凋亡更具抵抗力。同样，药物抑制NOX4后，ROS生成、纤维生成标记物表达和肝细胞凋亡均降低。NOX4在2–3期自身免疫性肝炎患者的肝脏中表达。NOX4基因缺失可减轻纤维化。在预防性或治疗性臂中灌胃GKT137831的BDL小鼠显示出较少的ROS产生；显著减轻肝纤维化，减少肝细胞凋亡。总之，NOX4在肝纤维化中起关键作用。GKT137831是一种有效的纤维化和肝细胞凋亡抑制剂；因此，它是未来翻译研究的一种很有前景的治疗剂。

关键词：肝纤维化、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸降低氧化酶4、肝细胞凋亡、星状细胞活化

介绍

导致肝硬化的肝纤维化是全球主要的健康负担之一，目前可用的治疗方法有限[1]. 各种病因的慢性肝损伤导致肝细胞凋亡，随后肝星状细胞转分化为肌成纤维细胞，并上调促纤维化细胞因子如TGF-β[1]以及ECM化合物的产量增加。慢性氧化应激是启动肝脏纤维化过程的重要因素[2]. 我们和其他人之前已经证明吞噬细胞NADPH氧化酶NOX2在HSC中表达，其激活导致早期纤维生成级联反应的诱导[三——4]. 血管紧张素II介导的NOX1诱导也被描述为促纤维化[4]NOX1可促进HSC增殖并加重纤维化[5]. NOX4是一种非吞噬性NOX同系物，在肝脏中表达[6——7]与其他NOX亚型不同，因为它不需要招募细胞溶质结构亚单位来形成活性酶，并且组成上能够生成ROS，主要是过氧化氢。NOX4通过介导肌成纤维细胞的活化在肺和肾纤维化中起关键作用[8——9]. 然而，NOX4在肝损伤和纤维化中的作用；尚未阐明。在肝脏中，NOX4主要在肝细胞、星状细胞和内皮细胞中表达[10]. 已发现NOX4在丙型肝炎中上调，并有助于ROS的形成通过TGF-β诱导[6]. 另一方面，已知NOX4也能介导TGF-β诱导的肝细胞凋亡[11]. 这些观察结果促使我们验证了NOX4是肝脏中一种重要的促凋亡和纤维生成因子的假设。最近，在肺纤维化动物模型中口服小分子NOX4/NOX1双抑制剂，显示出良好的口服生物利用度和耐受性[12]. GKT137831是一种吡唑并吡啶二酮类核心酶活性抑制剂，是目前正在开发的糖尿病肾病新疗法的候选药物。该化合物目前正在进行I期临床试验，并在本研究中用于确定NOX介导的肝损伤和纤维化的作用。

在这项研究中，我们表明NOX4是HSC激活和肝纤维化的关键元素体内GKT137831预防或治疗均能抑制肝细胞凋亡，改善血清ALT，减轻肝纤维化。

材料和方法

人肝组织

来自自身免疫性肝炎患者（2–3期）的肝活检样本来自由NCI资助的UCD癌症中心共享组织库（N=6）。

动物

Sprague-Dawley大鼠和C57/B6小鼠以及NOX4−/−由合著者产生的具有相同背景的小鼠[13]本研究中使用了。如Geerts等人所述，从大鼠或小鼠中分离出HSC和肝细胞[14]，按顺序就地胶原酶和蛋白酶灌注。如前所述，对小鼠进行BDL[三]. 然后用GKT137831（溶于1.2w%甲基纤维素+0.1w%聚山梨酯80水溶液中，60 mg/kg）或溶剂灌胃喂养小鼠，每天一次。治疗在手术后第1天（预防方案，治疗3周）或第10天（治疗方案，治疗1.5周）开始。假手术动物作为对照。三周后，处死小鼠，收集肝脏标本和血清。这些动物被安置在国家卫生研究所批准的设施中。所有程序均由加州大学戴维斯分校动物福利委员会审查和批准。

siRNA转染

按照上述方法培养原代大鼠HSC一天，然后将培养基改为DMEM、0.5%FBS，并将siRNA转染到NOX4（圣克鲁斯生物技术），或根据说明使用RiboJuice转染试剂（德国达姆施塔特EMD Chemicals Inc.）进行打乱siRNA。

腺病毒制剂

腺病毒显性阴性（DN）Smad3和野生型Smad3是Rebecca Wells博士（宾夕法尼亚大学）赠送的。HEK293细胞在37°C下培养24–48小时。感染多重性（MOI）为5–10 pfu/细胞。当80%出现细胞病变时收集细胞。在通过连续冻融循环和离心进行溶解后，收集上清液，并使用ViraBind进一步纯化tm（tm）腺病毒纯化试剂盒（细胞生物实验室）。使用QuickTiter获得腺病毒滴度tm（tm）腺病毒滴度免疫分析试剂盒（Cell Biolabs）。

免疫组织化学

组织样本被切片、去蜡和处理以进行染色。用靶向NOX4（1:200，Novus，St.Charles MO）和αSMA（1:200；Epitomics Inc.，Burlingame，CA）或白蛋白（Novus、Littleton，CO）的一级抗体培养组织。在用适当的AlexaFluor结合二级抗体（Invitrogen）进行检测后，用共焦显微镜检测和分析荧光信号。苏木精-伊红（H&E）染色和苦味酸红染色由加州大学戴维斯医疗集团病理科按照标准方案进行。这些图像由NIH ImageJ软件进行评估。

细胞凋亡研究

主要野生型或NOX4−/−在存在或不存在谷胱甘肽单乙酯（10 mmol/l，钙生物化学）的情况下，用FasL（5 ng/ml，16小时）或TNFα/放线菌素D（28 ng/ml和0.2μg/ml）孵育小鼠肝细胞。放线菌素D通常用作DNA转录抑制剂，以允许TNF-α诱导的凋亡反应[15]. 为了评估抑制剂对细胞凋亡的影响，使用GKT137831（20μM，5小时），然后使用Fas配体（FasL 5ng/ml，16小时）。然后用活性caspase-3抗体对细胞进行染色（Cell Technology，Inc.，Mountain View，CA）。使用荧光显微镜从5个随机视图中对阳性细胞进行计数，并除以总细胞数以获得凋亡率。用上述抗体对溶剂GKT137831处理1.5周（治疗组）和3周（预防组）的BDL小鼠肝组织进行免疫组化，用DAPI共染色标记细胞核，阳性细胞计数同上。

亮精蛋白测定

新鲜肝组织在均质缓冲液（250 mM蔗糖、0.5 mM EDTA、50 mM HEPES和蛋白酶抑制剂，pH 7.4）中的冰上均质。收集扰乱的或NOX4 siRNA处理的细胞，通过碘丙啶评估生存能力(补充图1). 然后将细胞溶解，并在4°C下1500g离心10分钟以澄清细胞。将20μl上清液添加到0.68 ml的荧光素工作溶液中（50 mM KH2PO4、150 mM蔗糖、1 mM EGTA、5μM荧光素、100 lM NADPH、pH 7.0）。每20秒用光度计（新泽西州富兰克林湖BD的3010单光光度计）读取一次荧光素强度，最多10次。根据每个样品中的蛋白质含量调整数据。

羟脯氨酸测定

肝组织在100°C的6N HCl中变性16小时，然后清洗并在H中重新悬浮2O.然后将组织悬浮液与氯胺-T（50mM）混合，并在室温下孵育20分钟。在加入高氯酸（3.15M，Sigma-Aldrich）和20%对二甲氨基苯甲醛（Sigma-Aldrich）后，测量557nm处的吸光度。根据一系列已知浓度的羟基脯氨酸溶液生成的标准曲线计算羟基脯氨酸量。数据表示为每克湿肝中的羟基脯氨酸μg。

蛋白质印迹分析

50μg蛋白质在样品缓冲液中变性并在SDS-PAGE凝胶上分离。将蛋白质转移到硝化纤维素膜上。阻断后，用抗NOX4抗体（1:1000，Pierce，Rockford，Il.）和二级IgG-HRP（1:2000，Santa Cruz Inc.）检测印迹。使用ECL方法对免疫复合物进行可视化（皮尔斯生物技术公司，伊利诺伊州罗克福德）。GAPDH被用作内部控制。

定量RT-PCR

使用RNA纯化试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚QIAGEN）提取肝星状细胞（对照组或TGF-β处理组，4 ng/ml）或肝组织的总RNA。使用基于随机六聚体方法的上标III试剂盒（上标III第一链合成超模用于qRT PCR，Bio-rad，Hercules，CA）进行逆转录。实时PCR反应的引物列于表1.

表1

实验中使用的引物序列。

鼠标Nox4正向：5′-TTGCCTGAAGACCAGT-3′
背面：5′-TCCGCAAAATAAAGGCACAA-3′
小鼠胶原蛋白IA1正向：5′-AGAGGCGAAGACAGTCG-3′
背面：5′-GCAGGCAATGTCC-3′
小鼠/大鼠αSMA正向：5′-TCAGCGCCTCCAGTTCCT-3′
背面：5′-AAAAAAAAA CCACGAGTAAAATCAA-3′
小鼠TGF-β正向：5′-CATGGAGCTGGTGAAACGG-3′
反面：5′-GCCTTTAGTGGAGAGGATCTGG-3′
小鼠β-肌动蛋白正向：5′-ACGGCAGGTCATCACTG-3′
背面：5′-ATACCAGAGAGAGGCTGGA-3′
大鼠Nox4正向：5′-TTACTACTGCCATVAAGC-3′
反向：5′-GAATGATTGGATGTCTGC-3′
大鼠CoUagen IA1正向：5′-TGATCTGTATCTGCACAATG-3′
背面：5′-ACTCTGTCGTCTGGTGATAC-3′
大鼠TGF-β正向：5′-CATGGAGCTGGTGAAACGG-3′
反面：5′-GCCTTTAGTGGAGAGGATCTGG-3′
鼠丛正向：5′-AAGGACCACCTCACCGAGAT-3′
反向：5′-CCCTCTAGGAAGAGAGTGTGTG-3′

统计

所有数据至少代表三个实验，并表示为平均值±SED。使用方差分析（ANOVA）和Dunnett检验比较各组之间的差异。当p<0.05时，假设具有统计学意义。

结果

诱导NOX4表达在体外通过TGF-β和Smad 3依赖机制激活星状细胞期间，以及体内BDL期间

已知原发性肝星状细胞在塑料上镀膜时会自发发生转分化[16],[17]. 为了研究在培养激活过程中是否诱导NOX4，将原代HSC培养8天，并通过实时PCR检测NOX4的表达。与第1天静止细胞相比，转分化为肌成纤维细胞的细胞中NOX4显著上调（p<0.01）(图1A). 由于NOX4是一种转录诱导型NOX，接下来我们测试TGF-β是否在其诱导中起作用(图1B). TGF-β诱导了NOX4的显著上调（p<0.05），而Ad-DNSmad 3可以阻止NOX4上调（p<0.01），表明HSC激活期间NOX4诱导是TGF-α和Smad3依赖性的。在术后不同时间点，还评估了从BDL小鼠分离的HSC中NOX4的表达，并且在转录物中逐渐显著地诱导了NOX4（#p<0.05，*p<0.01）(图1C)和蛋白质(图1D)HSC纤维化过程中的水平。与对照组相比，假手术小鼠未观察到诱导。为了确定是否在肝病患者中诱导NOX4，我们研究了自身免疫性肝炎患者，这种疾病的特征是肝细胞死亡并继发纤维化。对2–3期纤维化患者的对照肝脏和肝活检样本进行免疫组织化学分析。在对照肝脏中，肝细胞中NOX4免疫反应性较低(补充图1). 在自身免疫性肝炎中，肌成纤维细胞表达NOX4(图1Eα-SMA阳性）和肝细胞（白蛋白阳性，补充图1)，通过共焦显微镜进行评估

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TGF-β/Smad 3介导机制诱导培养激活的肝星状细胞和胆管结扎小鼠分离的星状细胞中NOX4的表达

实时PCR评估静止状态（第1天）和培养激活的HSC（第8天）中NOX4的表达。随着HSC激活，NOX4显著上调（图1A；平均值±SED，N=4，*p<0.05）。HSC感染Ad-DNSmad3或wt-Smad3，暴露于TGF-β1，实时PCR检测其表达。TGF-β1显著诱导了对照组和wt-Smad3感染的HSC的表达，而DN Smad3阻止了诱导（图1B；平均值±SED，N=3，*p<0.05，**p<0.01，NT=未转染）。在BDL期间不同时间点分离的HSC的Western blot分析显示，在转录物（图1C，表示为折叠对照，N=4，#p<0.05，*p<0.01）和蛋白质水平（图1D，N=3，平均值±SED）中，NOX4逐渐诱导。在自身免疫性肝炎患者中，NOX4（图1E，绿色，a）与表达αSMA的（红色，b）肌成纤维细胞共定位（叠加图像，c）。研究了2-3期纤维化患者的肝活检样本（N=6），来自3期疾病患者的代表性图像（Bar=30μm）。

NOX4在活性氧生成和HSC激活中发挥作用在体外和体内

为了研究NOX4在原代培养活化HSC产生ROS中的作用，用打乱或NOX4 siRNA转染细胞，并用荧光素化学发光法测定释放的ROS。我们发现NOX4 siRNA显著抑制了ROS的释放(图2A，*p<0.05）。活化的HSC（肌成纤维细胞）表达前胶原α1（I）和αSMA，这是转分化的标志[1]. 我们发现，在野生型细胞中，α1（I）前胶原（9.1倍±0.83，*p<0.001）和αSMA被显著诱导（3.4倍±0.33，*p<0.001−/−高强度混凝土(图2B，**p=0.003，#p<0.05）。对wt和NOX4进行BDL−/−小鼠评估纤维化。NOX4中的前胶原α1（I）和αSMA均下调−/−BDL肝脏与wt肝脏相比（0.37倍±0.02，*p<0.05，以及0.38±0.03，*p<0.05，N=5，图2C)NOX4中αSMA免疫反应性降低−/−BDL小鼠(图2D).

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NOX4在ROS生成和HSC激活中发挥作用

用打乱的siRNA或NOX4 siRNA转染培养激活的HSC（转染后细胞活力没有显著变化，补充数据2A). Lucigenin分析表明，与打乱siRNA处理的细胞（NT，非转染细胞）相比，NOX4 siRNA降低了ROS的生成。（图2A，平均值±SED，折叠控制，N=4*p<0.05）。初级、wt或NOX4−/−HSC培养8天，检测促纤维化基因α1（I）、αSMA和NOX4的表达。培养激活诱导wt细胞中这些转录物显著上调（图2B，数据表示平均值±SED，折叠对照，N=4，*p<0.001），而NOX4中未发现诱导−/−细胞。对wt和NOX4进行BDL−/−qPCR检测小鼠α1（I）前胶原和αSMA的表达。NOX4中这两种转录物均显著下调−/−肝脏（图2C，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001，N=5）。αSMA在NOX4中的免疫反应性降低−/−肝脏（图2D，αSMA：红色，蓝色：DAPI）。

GKT137831抑制活性氧的产生和HSC的纤维化激活

GKT137831是吡唑哌啶二酮家族的成员，在利用异源过表达特定NOX酶亚型的细胞制备的膜进行ROS生成的无细胞分析中，它是Nox4和Nox1亚型的有效抑制剂，Ki在100–150nM范围内。在无细胞试验中，GKT137831对NOX2亚型的抑制活性较弱，在高达100uM的浓度下，不能显著抑制中性粒细胞氧化爆发，也不能抑制固有微生物的杀灭在体外或体内（分别以高达20uM的浓度使用或以100mg/kg的剂量口服时）。此外，GKT137831在10μM下测试时既没有清除活性也没有抗氧化活性，并且不抑制H2O（运行）2使用与NOX分析相同的读数和条件在黄嘌呤氧化酶分析中进行生产[12]. 它对NOX4和NOX1酶具有极好的特异性在体外170种不同蛋白质的脱靶药理学特征，包括ROS产生和氧化还原敏感酶[12]. 为了研究GKT137831的作用，用GKT137831处理原发性HSC，并测量ROS的释放，发现其显著降低。(图3A，**p=0.01）。通过对前胶原α1（I）、αSMA和TGF-β的实时PCR评估，GKT137831也显著减弱了HSC的激活(图3B，**p=0.01，**p<0.01，#p<0.001）。

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使用NOX4/NOX1抑制剂GKT137831减少ROS的生成和肝星状细胞的活化

用GKT137831（20μM）处理的原代培养活化HSC显示出显著降低ROS生成（图3A，数据表示平均值±SED，折叠对照，N=4，**p=0.01）。GKT137831处理的HSC显示促纤维化基因前胶原α1（I）、αSMA和TGF-β的表达显著降低。（图3B，数据表示平均值±SED，折叠控制，N=5，*p=0.01，**p<0.01，***p<0.001）。

NOX4在死亡配体诱导肝细胞凋亡中的作用

FasL和TNF-α是诱导肝细胞凋亡的主要死亡因子，而肝细胞凋亡又反过来触发了它们对HSC的吞噬和成纤维活性[三，18——19]. 评估NOX4在细胞凋亡、原发性wt或NOX4中的作用−/−肝细胞暴露于FasL或TNF-α/放线菌素D（ActD通常用于诱导肝细胞凋亡和TNFα）[15]. 免疫荧光染色检测活性半胱天冬酶3亚单位并评估细胞凋亡率。与wt细胞相比，NOX4细胞的凋亡率显著降低−/−FasL或TNFα刺激的肝细胞/实际D(图4A和B，p<0.05）。在FasL之前，还使用NOX4/NOX1抑制剂GKT137831处理肝细胞，如上所述评估凋亡率。当用抑制剂预处理肝细胞时，FasL的凋亡显著减少（p<0.05）(图4C).

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NOX4在FasL和TNF-α诱导肝细胞凋亡中的作用

主要野生型（wt）或NOX4−/−在GSH酯存在或不存在的情况下，用FasL或TNFα/ActD处理肝细胞以诱导凋亡。进行免疫荧光研究以检测活性caspase-3，并在3个实验中计算5个不同领域的阳性细胞百分比。谷胱甘肽酯降低了细胞凋亡率（**p<0.01）。NOX4肝细胞中−/−与wt小鼠相比，FasL小鼠诱导的凋亡显著减少（图4A，caspase 3活性亚单位阳性细胞的百分比，N=3，*p<0.05）。正如预期的那样，TNFα/ActD诱导了wt肝细胞的显著凋亡，而这在NOX4中被减弱−/−细胞（图4B，*p<0.05）。为了评估GKT137831对细胞凋亡的影响，用FasL处理有或没有GKT137.831预孵育的肝细胞。GKT137831显著降低FasL诱导的细胞凋亡（图4C，N=4，*p<0.05）。

GKT137831降低肝细胞ROS生成和凋亡体内在预防和治疗方案中

评估GKT137831的疗效体内，通过两种方案灌胃给药抑制剂：在整个BDL（预防组）和从手术后10天开始（治疗组），对照动物仅通过溶剂给药。在两个治疗组中，GKT137831治疗小鼠的ROS生成均降低(图5A，p<0.05），并且通过caspase 3活性亚基的免疫荧光评估的凋亡肝细胞数量也有所减少(图5B、和补充数据图3). 此外，我们注意到血清ALT升高的显著减弱，尤其是在服用抑制剂3周的小鼠中(图5C，p<0.05）。与使用溶剂治疗的假手术小鼠相比，接受GKT137831治疗的BDL治疗小鼠的ALT升高不显著。

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NOX4/NOX1抑制剂GKT137831降低ROS生成、肝细胞凋亡和血清ALT水平体内

BDL小鼠每天用60mg/kg GKT灌胃1.5周（手术后第10天开始）或3周。作为对照，使用溶剂（3周）。萤光素分析显示，BDL在溶剂处理组中诱导了ROS的产生（比假手术小鼠高3.1倍），而用GKT137831处理3周将其降低到1.5倍。（平均值±SED，折叠对照，每组N=6只小鼠，p<0.05，图5A）。活性caspase-3亚单位（红色）的免疫荧光显示溶剂处理的BDL肝脏中的肝细胞凋亡。GKT137831处理的肝脏中凋亡细胞数量减少。蓝色：DAPI，核染色（图5B，所示为3w BDL组的溶剂处理数据）。检测血清中的ALT和胆红素值，BDL动物的ALT与胆红素均升高，但在GKT137831治疗3周后降低。与使用溶剂治疗的假手术小鼠相比，BDL GKT137831治疗小鼠的ALT没有显著增加（图5C，平均值±SED，每组6只小鼠，*p<0.05）。

GKT137831减轻肝纤维化体内在预防和治疗方案中

为了研究BDL后的肝纤维化和对抑制剂的反应，采用实时PCR评估成纤维转录物α1（I）、αSMA和TGF-β1(图6A)在肝组织中。两个治疗组的所有纤维化标志物均显著下降（胶原α1（I）1.5 w:0.4倍±0,03，3w:0.9倍±0.02；αSMA 1.5w:0.18倍±0.01，3w:0.28倍±0.01:；TGF-β，1.5w:0.4倍±0.01，3w:0.5倍±0.01（p<0.05）。较高剂量的抑制剂（120mg/kg）也具有良好的耐受性，但不能进一步改善纤维生成标记物。苦味酸染色显示GKT137831治疗的肝脏中胶原较少，两个治疗臂中的羟脯氨酸显著减少，表明胶原沉积减少(图6B、C，*p<0.05，**p<0.01）。

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灌胃GKT137831后BDL可减轻小鼠肝纤维化

实时PCR数据表明，促纤维化基因胶原α1（I）、αSMA和TGFβ的表达被GKT137831显著抑制（图6A，3w BDL组的溶剂处理数据）。使用较高的抑制剂剂量方案并没有进一步改善纤维化标记物。苦味酸红染色（B）显示BDL溶剂组出现显著的肝纤维化，而GKT137831处理的小鼠则减少了纤维化。羟脯氨酸测定（C）显示，GKT137831治疗1.5周和3周后，肝脏中的胶原蛋白量均显著降低（平均值±SED，每组6只小鼠，*p<0.05，**p<0.01）。

讨论

肝纤维化是慢性肝损伤导致伤口愈合的结果[1]. 肝细胞凋亡通过吞噬凋亡小体直接触发星状细胞活化[三，20]或通过产生损伤相关分子模式（DAMP）和诱导星状细胞迁移和活化间接[21——23]. 因此，合理的肝纤维化治疗方法可能包括靶向肝细胞凋亡、星状细胞活化或两者兼而有之的药物。NOX4是一种非吞噬细胞NADPH氧化酶，其诱导主要导致过氧化氢的形成。这种自由基和其他自由基，如过氧亚硝酸盐，被证明是纤维生成信号的关键信号元件[2，24]. 我们之前已经表明，来源于NOX活化的过氧化氢直接诱导I型胶原启动子的转录活化和HSC活化[三]. 此外，我们发现ROS介导的信号传导在纤维化过程中对肌成纤维细胞的存活也起作用[20].

有大量证据表明NOX4参与丙型肝炎介导的损伤[6]此外，它在TGF-β诱导的肝细胞死亡中起作用[11]. ROS的促纤维化作用与肝细胞中NOX4诱导导致细胞凋亡这一事实相结合，进一步触发导致肝硬化的级联事件。因此，NOX4作为治疗靶点尤其具有吸引力，因为这两个关键过程都可以作为靶点。此外，由于该NOX同源物没有已知的抗菌作用，其抑制作用不会干扰宿主防御。氮氧化物4−/−小鼠看起来非常正常，在基线时不表达特定表型，也不明显容易感染（未发表的观察结果）。GKT137831是一种NOX4/NOX1亚型的类药物抑制分子，在几种物种中表现出良好的耐受性，目前正处于I期临床试验中，具有良好的药理学和安全性[12，25]. 在以前的研究中，它被发现在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中比吡非尼酮更有效[25].

在这里，我们研究了NOX4作为纤维化过程中ROS的来源，发现NOX4在纤维化过程中由TGF-β1和Smad3诱导，并且NOX4介导HSC激活过程中的ROS生成。NOX4也在死亡配体诱导的肝细胞凋亡中发挥作用，由于肝细胞凋亡和HSC激活对纤维化的传播是必要的，因此寻找一种可能影响这两个过程的药物可能具有巨大的治疗效用。我们测试了GKT137831，发现它抑制HSC的培养激活和ROS生成，并且对肝细胞具有抗凋亡作用。概括这些发现体内，我们选择了BDL纤维化模型，因为在该模型中，主要的纤维化刺激并非基于直接的肝毒性（与CCl4或硫代乙酰胺相反，其中ROS的释放独立于NOX的激活可能发挥作用）。与体重小鼠NOX4相比−/−小鼠出现轻度纤维化。然而，NOX4的缺乏并不能完全防止纤维化，这可能表明其他NOX在这一过程中也很重要。GKT137831有效降低ROS生成，改善肝细胞凋亡，降低ALT水平和纤维化。抑制NOX4后，TGF-β表达的减少不如前胶原α1（I）和αSMA的明显，这表明TGFβ的调节在很大程度上独立于NOX4；并将NOX4置于TGFβ远端的信号级联中。GKT137831被描述为NOX4/NOX1异构体选择性抑制剂，因此，我们在本研究中观察到的药理作用可能是两种NOX的抑制作用的综合作用。NOX1是一种非吞噬细胞NADPH氧化酶同源物，但也在肝纤维化中起作用，其激活；主要由血管紧张素II诱导[4]. 在Aoyama等人最近的一项研究中，当用GKT137831治疗患有CCl4诱导的纤维化的SOD1突变小鼠时，可以看到纤维化的显著减少，与我们的研究类似[26]. 然而，有趣的是，根据先前的研究，NOX1和NOX4可能在肝细胞凋亡中发挥不同的作用，因为siRNA敲低NOX1可增加caspase-3活性和细胞死亡，而NOX4敲低可减弱肝细胞的凋亡过程[27]表明GKT137831对细胞凋亡的抑制作用主要是由于NOX4的抑制。通过测试GKT137831在预防和治疗模型中的疗效，我们发现纤维化显著减少，尽管每天使用抑制剂21天时更明显。

总之，我们已经证明，NOX4在肝纤维化中起着重要作用，在肝纤维化形成过程中，NOX4-NOX4基因缺失或口服NOX4抑制剂GKT137831可显著减轻肝损伤、凋亡和纤维化。因此，抑制NOX4可能成为肝纤维化转化试验的一种有希望的新策略。

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集锦

  • NOX4是肝纤维化的关键酶
  • 氮氧化物4−/−小鼠减轻了纤维化
  • NOX4抑制剂保护肝脏免受损伤

补充材料

01

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02

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致谢

财务支持：拨款支持：本研究得到NIH DK083283（NJT）的支持

缩略语清单

HSC公司肝星状细胞
NADPH氧化酶（NOX）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原氧化酶
BDL公司胆管结扎术
转化生长因子-β1转化生长因子-β
肿瘤坏死因子-α肿瘤坏死因子α
α形状记忆合金α-平滑肌肌动蛋白
中高音丙氨酸氨基转移酶

脚注

利益冲突：无

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工具书类

1Friedman SL.肝纤维化的机制。胃肠病学。2008;134:1655–1669. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
2Nieto N，Friedman SL，Cederbaum AI.细胞色素P450 2E1衍生活性氧物种介导肝星状细胞旁分泌对I型胶原蛋白合成的刺激。生物化学杂志。2002;277:9853–9864.[公共医学][谷歌学者]
三。Jiang JX、Venugopal S、Serizawa N、Chen X、Scott F、Li Y、Adamson R、Devaraj S、Shah V、Gershwin ME、Friedman SL、Torok NJ。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原酶2在体内星形胶质细胞激活和肝纤维化中起关键作用。胃肠病学。2010 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
4Paik YH、Iwaisako K、Seki E、Inokuchi S、Schnabl B、Osterreicher CH、Kisseleva T、Brenner DA。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）同源物NOX1和NOX2/gp91（phox）介导小鼠肝纤维化。肝病学。2011年；53:1730–1741. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
5Cui W，Matsuno K，Iwata K，Ibi M，Matsumoto M，Zhang J，Zhu K，Katsuyama M，Torok NJ，Yabe-Nishimura C.NOX1/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原型（NADPH）氧化酶促进星状细胞增殖，加重胆管结扎诱导的肝纤维化。肝病学。2011[公共医学][谷歌学者]
6de Mochel NS，Seronello S，Wang SH，Ito C，Zheng JX，Liang TJ，Lambeth JD，Choi J.肝细胞NAD（P）H氧化酶是丙型肝炎病毒感染期间活性氧的内源性来源。肝病学。2010;52:47–59. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
7Spencer NY，Yan Z，Boudreau RL，Zhang Y，Luo M，Li Q，Tian X，Shah AM，Davidson RL，Davidson B，Banfi B，Engelhardt JF.通过葡萄糖6-磷酸脱氢酶和NADPH氧化酶-4控制肝细胞核超氧化物的生成。生物化学杂志。2011年；286:8977–8987. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
8Hecker L、Vittal R、Jones T、Jagirdar R、Luckhardt TR、Horowitz JC、Pennathur S、Martinez FJ、Thannickal VJ。NADPH氧化酶-4介导肌成纤维细胞活化和对肺损伤的成纤维反应。国家医学院。2009;15:1077–1081. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
9Barnes JL，Gorin Y.《纤维化过程中肌成纤维细胞的分化：NAD（P）H氧化酶的作用》。肾脏Int。2011年；79:944–956. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
10Reinehr R，Becker S，Eberle A，Grether-Beck S，Haussinger D.NADPH氧化酶亚型和Src家族激酶参与CD95依赖性肝细胞凋亡。生物化学杂志。2005;280:27179–27194.[公共医学][谷歌学者]
11Carmona-Curenca I、Roncero C、Sancho P、Caja L、Fausto N、Fernandez M、Fabrega I。TGF-β对肝细胞中NADPH氧化酶NOX4的上调是促凋亡活性所必需的。肝素杂志。2008;49:965–976.[公共医学][谷歌学者]
12Laleu B、Gaggini F、Orchard M、Fioraso-Cartier L、Cagnon L、Houngniou-Molango S、Gradia A、Duboux G、Merlot C、Heitz F、Szyndralewiez C、Page P。用于治疗特发性肺纤维化的同类第一、有效且口服生物可利用的NADPH氧化酶亚型4（Nox4）抑制剂。医学化学杂志。2010;53:7715–7730.[公共医学][谷歌学者]
13Katrin Schroder MZ、Benkhoff Sebastian、Mieth Anja、Pliquet Rainer、Kosowski Judith、Christoph Kruse PLd、Ruth Michaelis U、Weissmann Norbert、Dimmeler Stefanie、Ajay M、Shah RPB。Nox4是一种产生血管NADPH氧化酶的保护性活性氧。流通研究。2012[公共医学][谷歌学者]
14Geerts A、Niki T、Hellemans K、De Craemer D、Van Den Berg K、Lazou JM、Stange G、Van De Winkel M、De Bleser P。通过侧面散射活化细胞分选纯化大鼠肝星状细胞。肝病学。1998;27:590–598.[公共医学][谷歌学者]
15Guicciardi ME、Deussing J、Miyoshi H、Bronk SF、Svingen PA、Peters C、Kaufmann SH、Gores GJ。组织蛋白酶B通过促进细胞色素c的线粒体释放，促进TNF-α介导的肝细胞凋亡。临床投资杂志。2000;106:1127–1137. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
16De Minicis S、Seki E、Uchinami H、Kluwe J、Zhang Y、Brenner DA、Schwabe RF。肝星状细胞在培养和体内活化过程中的基因表达谱。胃肠病学。2007;132:1937–1946.[公共医学][谷歌学者]
17Hernandez Gea V，Friedman SL。肝纤维化的发病机制。《病理学年鉴》。2011年；6:425–456.[公共医学][谷歌学者]
18Baskin-Bey ES、Huang W、Ishimura N、Isomoto H、Bronk SF、Braley K、Craig RW、Moore DD、Gores GJ。组成性雄激素受体（CAR）配体TCPOBOP通过改变Bcl-2蛋白减轻Fas诱导的小鼠肝损伤。肝病学。2006;44:252–262.[公共医学][谷歌学者]
19Zhan SS、Jiang JX、Wu J、Halsted C、Friedman SL、Zern MA、Torok NJ。肝星状细胞吞噬凋亡小体可诱导NADPH氧化酶，并与体内肝纤维化相关。肝病学。2006;43:435–443.[公共医学][谷歌学者]
20Jiang JX、Mikami K、Venugopal S、Li Y、Torok NJ。肝星状细胞吞噬凋亡体通过JAK/STAT和Akt/NF-kappaB依赖性途径促进其生存。肝素杂志。2009;51:139–148. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
21Mehal W，Imaeda A.细胞死亡和纤维生成。塞米恩肝病。2010;30:226–231. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
22Mohamad Nejad M、Sohail MA、Watanabe A、Krause DS、Swenson ES、Mehal WZ。腺苷抑制骨髓间充质干细胞的趋化性并诱导肝细胞特异性基因。肝病学。2010;51:963–973. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
23Jou J，Choi SS，Diehl AM。非酒精性脂肪肝的疾病进展机制。塞米恩肝病。2008;28:370–379.[公共医学][谷歌学者]
24Urtasun R、Conde de la Rosa L、Nieto N。氧化和硝化应激及纤维生成反应。临床肝病。2008;12:769–790. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Gaggini F、Laleu B、Orchard M、Fioraso-Cartier L、Cagnon L、Houngniou-Molango S、Gradia A、Duboux G、Merlot C、Heitz F、Szyndralewiez C、Page P.作为新型双Nox4/Nox1抑制剂的原始吡唑啉-吡嗪和-恶嗪二酮衍生物的设计、合成和生物活性。生物有机医药化学。2011[公共医学][谷歌学者]
26青山TPY、渡边S、布伦纳D。肝病学。爱思唯尔；2011.NADPH氧化酶（NOX）在实验性肝纤维化中的关键作用；第184页。[谷歌学者]
27Sancho P、Bertran E、Caja L、Carmona-Curenca I、Murillo MM、Fabregat I。表皮生长因子（EGF）途径的抑制通过诱导氧化应激和NADPH氧化酶（NOX）亚型表达模式的改变，增强TGF-β诱导的大鼠肝癌细胞凋亡。Biochim生物物理学报。2009;1793:253–263.[公共医学][谷歌学者]