Leigh小鼠模型的致命呼吸功能障碍综合征

通过MRI和胶质增生检测KO小鼠的脑损伤。

T2加权MRI显示水肿区域是一个高信号，是主要的LS的诊断标志。在5只被检查的KO小鼠中，2只处于中期，2只属于晚期（如方法部分定义）小脑深部有高信号病变顶核（FN）、小脑叶（主要是后叶，如VIII、，九、 X，但在晚期动物中延伸至前叶），外丛状嗅球（OB）层，以及矢状或背侧髓质对照组小鼠没有看到的冠状视图（图​（图1A）。1A） ●●●●。延髓背侧的病变似乎在前庭核内（VN）（图​（图1B）。1B） ●●●●。神经胶质增生进行性发展用抗体进行免疫染色显示检测胶质细胞反应性。例如，胶质标记物的免疫染色显示KO小鼠VN中广泛的双侧神经炎症（图​（图1C）。1C） ●●●●。具有细胞质空泡和畸变的神经元含有浓缩嵴的线粒体以及充血的小胶质细胞在同一大脑的超微结构水平上观察到细胞质残留地区(23). 严重的脑病导致寿命缩短，P50死亡率超过90%（图​（图1D）。1D） ●●●●。

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图1

KO小鼠的MRI和组织病理学改变。

(A类)对照组和晚期KO小鼠的T2加权体内MRI。控制（CT）鼠标和后期KO鼠标显示的矢状面MRI（顶部面板）对照小鼠侧脑室的高信号区（白色区域），而KO小鼠的OB外丛和背表面有明显的损伤脑干伴广泛小脑损伤（白色箭头）中脑低信号改变（星号）。对照组和对照组的冠状动脉成像KO小鼠第四脑室区仅显示中等T2加权MRI强度而中期KO小鼠（右下图）的延髓背侧（VN，白色箭头）和小脑第十叶（黑色箭头）。(B类)根据Franklin和Paxinos的VN图(60). 圈出VN。4v，第四心室。(C类)Iba1（小胶质细胞标记物）和GFAP染色对照组（左上）和KO组（右上）小鼠VN中的（星形胶质细胞标记物）显示存在充满丰富小胶质细胞和与对照组小鼠相比，KO中被GFAP阳性反应性星形胶质细胞包围。比例尺：1000μm。（下一行）VN的特写图像（如图所示中的星号C类)GFAP和Iba1强度增加KO小鼠胶质细胞的形态学变化。比例尺：250μm。(D类)KO小鼠存活曲线(n个= 101).

KO小鼠有异常的呼吸反应。

KO小鼠体型较小，表现出体温过低、共济失调、嗜睡和感觉障碍异常(22,23). 小脑和VN病变很容易解释共济失调，但其他症状和死亡的根本原因仍不得而知直到我们观察到间歇性的呼吸不规则。KO小鼠失去了大部分头发大约P20，这有助于观察呼吸不规则包括换气不足或过度换气和喘气（补充视频1；补充本文在线提供的材料；数字对象标识：10.1172/JCI62923DS1). 气喘吁吁的插曲的出现很常见例如，当处理老鼠时，在压力更大的条件下观察到。

为了描述KO小鼠的呼吸反应，我们使用气压、全身、流量容积描记术，用于记录无感觉、自由移动KO和对照小鼠（图​（图2A）。2A） ●●●●。常压下条件（20.9%O₂)、新生儿（P8–P12）及以上（>P30）KO小鼠呼吸频率正常(fR（飞行参考）);然而，它们的潮气量明显较高(V（V）_T型)和分钟通风(V（V）_E类=fR（飞行参考）×V（V）_T型)与相同的对照小鼠相比年龄（图​（图2，2、B和C）。KO小鼠有间歇性呼吸暂停发作（周期时间[T型_TOT公司]超过平均长度的两倍）和期间fR（飞行参考）根据不规则性得分（IS）衡量，非常不规则(24). 这些异常随着年龄的增长而增加(第页²= 0.50;P（P）=0.02（对于呼吸暂停次数和IS，第页²= 0.64;P（P）< 0.01; 图​图2，2，D和E）。缺氧反应（10%O下5分钟₂)，有一个首字母呼吸增强后抑郁。新生儿和老年KO小鼠呼吸增强，但在V（V）_T型和V（V）_E类与…相比对照小鼠（图​（图2F）。2F） ●●●●。尽管是可变的，一些KO小鼠对过量CO也有异常反应₂（高碳酸血症；55%CO时的分钟数₂). 13只（新生儿和成年）KO小鼠中有6只未能显示在所有6只对照小鼠中观察到的过度换气反应。有趣的是，剩下的7只KO小鼠与对照组小鼠（补充表1）。

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图2

KO小鼠的异常呼吸模式。

(A类)46天龄自由活动小鼠的30秒呼吸记录由气压、全身、流量容积描记法记录的呼吸与对照组相比，KO小鼠（底部轨迹）的不规则性和呼吸暂停室友（顶部痕迹）。轨迹中的向上偏转表示吸气移动。(B类和C类)新生儿呼吸参数(B类)和成人(C类)对照组和KO组小鼠。这个V（V）_T型和V（V）_E类是KO小鼠显著高于对照小鼠*P（P）<0.05; **P（P）<0.01，学生的t吨测试。(D类和E类)呼吸暂停的发展(D类)呼吸频率不规则(E类)控制和KO小鼠与年龄显著相关。(F类)呼吸变化新生儿对照组和KO小鼠暴露于缺氧5分钟（10%O₂;灰色区域）。KO小鼠在暴露量显著大于对照小鼠*P（P）<0.01，双向方差分析，Bonferroni的事后检验。显示数据平均值±SEM。

我们还测量了患者的呼吸频率、心率和动脉血氧饱和度光学光谱法测定疾病进展不同阶段的对照和KO小鼠在被束缚的动物身上。与容积描记法一样，呼吸频率是可变的，但用这种方法，KO小鼠的发病率明显低于对照小鼠（～150 vs.～220次呼吸/分钟，KO vs.对照组；P（P）< 0.001). 方法之间的差异可能是由约束引起的应力解释。此外，呼吸减少发病率在疾病后期更为明显（图​（图3，三、A和B，P（P）< 0.05). 同样，心脏KO小鼠的发病率低于对照小鼠（～500 vs。～650次/min，KO vs.对照；P（P）< 0.01),尤其是在疾病的晚期（图​（图3，三、C和D，P（P）< 0.05). 与低层一致呼吸和心率、晚期KO小鼠通常低于99%，这在对照小鼠中未观察到（～95%vs.～99%，KO vs.对照，P（P）<0.05; 图​图3，三、E和F）。

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图3

KO小鼠的呼吸、心率和氧饱和度降低。

测量是使用一个连接在裸颈上的脉搏血氧计进行的控制(n个=7）和处于不同疾病阶段的KO小鼠进展（总计n个= 11;n个=2、3和6只小鼠，早期、中期和晚期）。对于KO在小鼠中，随着时间的推移，这些值经常出现显著波动；平均的绘制测量期间的速率。(A类)呼吸频率在中晚期KO小鼠中含量较低*P（P）<0.05，单向方差分析，Tukey的后测。(B类)代表性痕迹对照组和早期和晚期KO小鼠(C类)心率疾病进展阶段明显少于对照组。*P（P）<0.05，单因素方差分析，Tukey的后验。(D类)控制和早期和晚期KO的代表性痕迹老鼠。(E类)动脉血氧饱和度变化在晚期KO小鼠中显著降低。(F类)代表性痕迹对照组和早期和晚期KO小鼠。数据点代表单个老鼠。数据显示为平均值±SEM。

KO小鼠中前Bötzinger复合体的异常反应。

延髓腹侧的前Bötzinger复合体（preBöt C）是对呼吸节律产生至关重要(25,26)并可能在缺氧反应(27,28). 脑干切片的细胞外记录包含preBötC来自P8–P10 KO小鼠及其对照室友。在控制条件下（95%O₂，5%一氧化碳₂)，这些切片显示破裂的频率和规律没有显著差异活动。应对缺氧（95%N₂，5%一氧化碳₂)，隔离preBötC产生一个初始增强阶段，其特征是爆破频率增加，然后出现爆破频率下降返回或低于基线活动。在这个反应中，吸气突发放电从“虚拟睡眠”切换到“虚幻的喘息”(29). KO小鼠切片的初始增强阶段没有差异与对照室友相比（图​（图4，A–F），4,A–F），但在抑郁期间，虚拟喘息的幅度为与对照组相比，KO小鼠显著减少（图​（图4，4，A–F）。虚构的频率对照组和KO组小鼠的喘息没有统计学差异，但100%对照组小鼠的切片在10分钟内持续虚幻地喘息缺氧时，KO小鼠30%的切片停止了虚喘。

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图4

KO的PreBötC的异常胞外和胞内记录老鼠。

(A类–E类)同时胞内全细胞（下迹线，全电池电压；Vm）和多单位群体记录（上跟踪、集成和校正多单元记录；VRG）包含KO和对照小鼠脑干切片中的PreBötC对缺氧条件（95%氮₂/5%一氧化碳₂,A类).在假性呼吸困难期间的细胞内记录显示APs/突发(B类)和较低的AP频率(D类)KO小鼠(n个=8）与对照小鼠相比(n个= 5).在缺氧条件下，对照组小鼠降至56.96%±47.04%基线(C类,n个=5），而KO小鼠(E类,n个=8）在10分钟缺氧结束时停止激发AP暴露。(F类)KO小鼠种群记录(n个=10） 显著地显示(P（P）<0.05）简化虚拟与对照组小鼠的喘息比较(n个= 10). (G公司)切片中吸气细胞的静息电位无显著差异与对照组小鼠进行比较。数据点代表单个单元格。(H（H）)驱动电位示例（上迹线、整个电池电压；Vm）（较低记录道、集成和校正多单元）记录VRG）。(我)去极化与KO小鼠切片中的网络破裂显著减少（5.51±0.59毫伏，n个=7）与对照小鼠（10.13）相比±1.30毫伏，n个= 5,P（P）=0.005）以下常压条件。此外，KO小鼠的低氧激发下的潜在去极化（5.51±0.59至0.52±1.36毫伏，n个= 7,P（P）=0.0012），而对照组小鼠没有表现出显著的降低（10.13±1.30毫伏至6.09±6.43毫伏）*P（P）<0.01. 数据显示为平均值±SEM。

细胞外记录的人口活动无法深入了解确定振幅。因此，我们使用KO切片中前BötC吸气神经元的细胞内记录和对照小鼠。细胞放电与细胞外爆发同步测量，每波动作电位（APs/波）的数量和频率为量化。在控制条件下，静息电位与对照组和KO组小鼠；然而，与网络突发同步的去极化是KO小鼠显著降低（5.51±0.59 mV，n个= 7)与对照组相比（10.13±1.30 mV，n个= 5,p<0.01，图​图4，4，G–I）。KO小鼠的AP/爆发和放电频率显著低于对照组室友（图​（图4，4、B和D）。过渡时从对照组到缺氧状态，对照组和缺氧组静息电位的变化KO小鼠与之相似。然而，KO小鼠的缺氧时去极化（从5.51±0.59到0.52±1.36毫伏；n个= 7,P（P）< 0.01),而对照组小鼠没有表现出显著的降低（10.13±1.30至6.09±6.43 mV，图​图4，G–I）。4,G–I）。KO小鼠的AP/爆发次数显著下降，7只中有2只缺氧超过5分钟后，切片停止呼吸，而对照切片，观察到AP/爆发相对轻微的减少，所有对照切片持续喘气（图​（图4，4、C和E）。有趣的是，在低氧条件下KO切片中观察到的呼吸不足是浴敷甲布他胺（ATP敏感钾通道）后恢复（K）_{列车自动防护系统})抑制剂（补充图1），表明前BötC神经元的生理缺陷，这可能有助于KO小鼠的呼吸变化。

虽然呼吸障碍是KO小鼠的临床症状之一，但小胶质细胞在任何一个经典的呼吸中心都很少观察到激活，例如臂旁内侧核、孤束核或预BötC。然而，在晚期KO小鼠中，小胶质细胞的激活是在延髓中缝（中缝苍白球和暗纹），一个对呼吸控制很重要的大脑区域(30). 在某些情况下，小胶质细胞的激活延伸到投影，伴有前BötC轻度微胶质增生通过神经激肽1受体免疫标记鉴定（补充图2，A–D），表明这些神经元的改变是不够的引起严重的继发性炎症反应。没有退化变化在后梯形的化学感受性Phox2B免疫反应神经元中检测到原子核(31,32).

VN中Ndusf4的选择性失活导致神经变性和呼吸异常和增加死亡率。

preBötC对体内呼吸至关重要(25)它受到大量神经输入的影响包括来自VN的内容（参见讨论）。因为VN是KO小鼠的胶质增生和神经变性，我们选择性地灭活恩杜夫斯4通过双侧注射成人，只在该细胞核中存在基因恩杜夫斯4^{液氧/液氧}腺相关病毒小鼠（类型1） 表达Cre-GFP（AAV1-Cre-GFP）以产生AAV-VN–KO小鼠。作为一个控制，恩杜夫4^{液氧/液氧}给小鼠注射AAV1编码非功能Cre（AAV1-CreΔ-GFP）以生成AAV-VN–CT小鼠。之后，在VN内观察到广泛的GFP表达双向病毒转导（图​（图5A）。此外，5A） ●●●●。此外，AAV-VN–KO小鼠产生了广泛的小胶质细胞活化1手术后一个月，通过Iba1标记物染色进行评估（图​（图5A）。5A） ●●●●。Iba1染色依赖于恩杜夫斯4因为没有显著的小胶质细胞激活在AAV-VN–CT小鼠的VN中观察到（图​（图5A）。5A） ●●●●。

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图5

Ndufs4失活后的组织病理学和行为学改变越南。

(A类)（左面板）转导程度的代表图像（GFP-阳性细胞）在载体交付后进行VN。（右面板）Iba1染色（红色）注射非功能性Cre-expressing（CreΔ-GFP，AAV-VN–CT鼠标，右上角）或功能性Cre-expressing（Cre-GFP，AAV-VN–KO小鼠，右下）的VN中的AAV1载体恩杜夫斯4^{液氧/液氧}老鼠。比例尺：500μm（左面板）；250μm（右侧面板）。(B类)AAV-VN–CT生存曲线(n个=17）和AAV-VN–KO小鼠(n个=21）VN注入后。*P（P）<0.05，Gehan-Breslow-Wilcoxon试验与AAV-VN–CT。(C类)之后体重变化的百分比AAV-VN–CT注射(n个=10）和AAV-VN–KO型(n个=15）只小鼠。第0天被视为基线（BL）（100%）***P（P）<0.001，基因型，双向方差分析。(D类)注入后旋转杆性能的变化AAV-VN–连续油管(n个=6）和AAV-VN–KO(n个=7）小鼠*P（P）< 0.05;**P（P）<0.01，双向方差分析，Bonferroni's事后测试对比AAV-VN–CT。(E类)呼吸变化AAV-VN–CT的(n个=14）和AAV-VN–KO(n个=6）暴露于5分钟缺氧（10%O）的小鼠₂;灰色区域）。(F类)AAV-VN–CT呼吸变化(n个=14）和AAV-VN–KO(n个= 6)暴露于5分钟高碳酸血症（5%CO）的小鼠₂; 灰色区域）。*P（P）< 0.05; **P（P）<0.01与AAV-VN–CT；双向方差分析，Bonferroni的事后检验。数据显示为平均值±SEM。

停用恩杜夫斯4VN内的双侧导致体重减轻（图​（图5C），5C） ，运动协调缺陷为通过旋转试验进行评估（图​（图5D），5D） 、和死亡率增加（图​（图5B）。5B） ●●●●。作为行为在恶化的小鼠中，我们观察到AAV-VN–KO偶尔喘息老鼠。容积描记术显示他们对缺氧有正常反应（5分钟含10%O₂)（图​（图5E），5E） ，但一个钝性高碳酸血症（5分钟，含5%CO₂)通气反应（图​（图5F）。5F） ●●●●。此外，AAV-VN–KO小鼠有呼吸更加不规则（IS=21.2±2.30 AAV-VN–CT小鼠，n个=14对IS=36.6±6.10 AAV-VN–KO老鼠，n个= 7;P（P）< 0.05). 注入AAV1-Cre-GFP进入条件td番茄报告基因（Ai14系）小鼠的VN(33)没有出现任何观察到的症状当病毒被注射到恩杜夫斯4^{液氧/液氧}老鼠（不是如图所示）。Cre诱导的td番茄报告基因荧光分析证实了细胞的转导仅限于VN，并且该细胞核向前BötC附近的延髓腹侧发送投射物（补充图3）如前所述(34).

临床评分。

按照描述评估疾病进展(23). 简单来说，生理（体重、体温、呼吸模式）和行为（运动活动、运动协调、步态/姿势改变）参数评估如下：0～1，症状前阶段；2-4，早期；5–8,中期；9-12，后期。

基于AAV的矢量生成和传递。

AAV-CRE-GFP和AAV-CREΔ-GFP已在其他地方描述(57,58).通过克隆小鼠产生AAV-Ndufs4-IRES-GFP载体恩杜夫斯4控制下IRES-GFP质粒中的基因CMV-鸡β-肌动蛋白（CBA）启动子。病毒是在用蔗糖和CsCI梯度纯化的AAV1外壳血清型HEK293细胞离心步骤，然后在HBSS中以2×10⁹病毒基因组/微升。对于病毒输送，1μl在坐标系下，将病毒的（内侧[ML]=±1.25，前后[AP]=–6.00，背腹[DV]=-3.90）。注射了病毒在进行行为测试前，动物双侧恢复2周。

MRI。

用1.5%异氟醚麻醉小鼠，并在在加热垫上强制加热空气的实验。在MRI会议期间，鼠标被安装在一个线圈中，这样信号就会集中在头部区域。用几条胶带把老鼠固定住。近似值使用的参数如下：自旋回波型参数3000/40ms周期延迟/回波时间，2平均，12分钟采集时间。成像后，老鼠在返回笼子之前进行监测以确保完全恢复。

脉搏测定法和血氧测定法。

用Nair脱毛膏去除小鼠颈部的毛发5分钟应用；然后用湿纸巾彻底清除奶油。在至少24小时后，测量血氧饱和度、呼吸频率和心率使用MouseOx（Starr Life Sciences）光学光谱仪和软件。经过5分钟的驯化以适应手的束缚，一个衣领夹被放在老鼠脖子上。录音时间为10到20分钟。在录制过程中，轻微的移动或挣扎的恢复通常会导致一个或多个参数中的信号或错误。仅包含完整每个测量参数的无误差信号用于分析。对于每只鼠标，收集了至少6个持续6秒的不同时间点总计至少1分钟的数据，稍后用于统计分析。

全身容积描记术。

在不受限制的情况下，通过全身容积描记术评估通气功能条件（Buxco研究系统）。简单地说，常氧/常压空气被替换为超碳酸空气（CO₂5%）或缺氧空气（O₂10%）用于5分钟。我们测量了功能恢复（每分钟循环，最小c.min^–1)V（V）_T型（μl）归一化为比率V（V）_T型除以体重(V（V）_T型μl。克^–1)V（V）_E类（ml.g）^–1最小值^–1)，呼吸暂停次数每分钟超过2个正常呼吸周期（呼吸暂停>2吨_TOT公司)表示为呼吸暂停指数（AI）和IS（连续5个周期的呼吸周期持续时间）(59). 在（a）对照期间进行测量空中，在挑战之前，（b）挑战的第三分钟，（c）第五分钟挑战分钟，（d）挑战后阶段（挑战后的前2分钟挑战结束时，正常氧或正常呼吸恢复体积描记室），以及（e）10至15分钟后。灭活和同时对救援实验进行了分析；因此，相同的控件使用（AAV-VN–CT），两张图中均显示了数值。进一步详见补充方法。

电生理学。

所有实验均采用横向、节律性600至650μm厚髓质脑片，取自8-至12日龄NesKO、KO和对照小鼠。用异氟醚对小鼠进行深度麻醉（吸入）并在C3/C4脊柱水平迅速斩首(59). 细胞外记录用位于腹侧呼吸切片表面的玻璃吸引电极组（VRG）位于preBötC附近或顶部。细胞内配线架使用MultiClamp 700B放大器（分子器件）获得记录，使用600～650μm脑干切片中VRG神经元的盲匹配技术准备工作。更多详细信息请参阅补充方法。

组织学。

按照描述进行组织学检查(23).简单地说，用过量的戊巴比妥灌注PBS麻醉小鼠其次是4%PFA。更多详细信息请参阅补充方法。

统计。

数据显示为平均值±SEM。使用GraphPad Prism v5.0软件用于统计分析。根据实验设计如文中所述。达到统计显著性时(P（P）<0.05被认为是显著的），在文字或图形图例。

这项工作得到了西北线粒体协会（R.D.Palmiter）的资助。A.金塔纳是西班牙Ciencia e Innovación部长的接受者（MICINN）博士后流动计划奖学金。作者感谢Jennifer Stone，RajKapur和Elisenda Sanz在这项研究中的帮助，Glenda Froelick在组织学协助。