介绍
在脑缺血等病理条件下，细胞内钙（[Ca2+]我)引发神经组织的剧烈变化，导致凋亡和坏死细胞死亡以及反应性胶质增生[1],[2]有大量证据表明2+]我振荡和传播2+]我局灶性缺血诱发的波可以通过星形胶质细胞合胞体长距离传播，导致中枢神经系统远端区域的损伤[3]尽管有大量研究描述了急性脑损伤引起的星形胶质细胞钙内流现象，但有关参与这一事件的离子通道和受体的分子身份的数据更为难以捉摸。有人认为星形胶质细胞中大量且不受控制的血浆钙2+缺氧/缺血后的进入可能由电压门控钙的激活介导2+通道[4]，NMDA受体[5]、P2X7和P2Y嘌呤能受体[6]Na/Ca的反向操作2+交换器[7]可能还有Ca2+渗透性阳离子通道，如瞬时受体电位（TRP）通道[8]以前的研究表明，在大脑中，TRP通道主要在神经元中表达。利普斯基及其同事[9]已证明TRPM2/TRPM7和TRPV3/TRPV4在海马CA1亚区神经元中的表达，并表明它们参与氧化应激。此外，曹和合著者[10]揭示了TRPV1和TRPV4在背根神经节（DRG）神经元胞体中的共同表达，并发现4-α-卟啉-12，13-二癸酸酯（4αPDD）诱导[Ca2+]我在DRG神经元共培养物中。不同TRP通道在胶质细胞中的表达也被描述。许多研究人员已经证明，TRPC1-、TRPC3-、TRPC4-和TRPC5通道的异多聚物复合物在胚胎培养的星形胶质细胞和刚从大鼠皮层分离的星形胶质胶质细胞中的表达，以及它们参与调节储存操作的钙2+入境活动[11]–[13].
特别令人感兴趣的是香草醛亚家族TRPV4通道的一个成员，该通道在大脑中广泛表达[14]TRPV4通道可被多种刺激物激活，如中等热量、内源性激动剂，如花生四烯酸或合成配体4αPDD[15]–[17]在星形胶质细胞中，TRPV4也对低渗敏感，通过与水通道蛋白形成分子复合物，它可能参与调节细胞体积恢复[18]–[20]有证据表明，原代培养的星形胶质细胞以及大鼠大脑皮层的皮质星形胶质细胞强烈表达TRPV4通道[21]典型的TRPV4电流被4αPDD或低渗激活，并被Ca阻断2+-在培养的星形胶质细胞中发现了游离溶液或TRPV4抑制剂钌红（RR）。最近对幼年海马器官型切片的研究证实了星形胶质细胞中TRPV4通道的表达，并揭示了它们参与氧化应激诱导的细胞死亡[8].RR或Gd的应用3+减少星形细胞损伤，因此提示TRPV4通道参与星形胶质细胞病理生理学。然而，据我们所知，星形细胞TRPV4通道在体内缺血性损伤尚未确定。
本研究旨在探讨TRPV4通道在成年大鼠星形胶质细胞中的病理生理作用。通过双侧阻断颈动脉，结合缺氧条件诱导脑缺氧/缺血（H/I），然后再灌注，研究海马星形胶质细胞中TRPV4通道的功能表达。通过免疫细胞/组织化学和蛋白质印迹分析，以及单细胞微量荧光法和电生理学技术，我们对假手术大鼠以及H/I（再灌注急性期）后1小时和H/I（再灌注晚期）后7天的TRPV4表达进行了表征。我们发现，缺血后星形胶质细胞中TRPV4的表达和活性上调，表明该通道可能参与[Ca]2+]我缺血性损伤导致星形胶质细胞合胞体升高。
材料和方法
道德声明
所有涉及实验动物使用的程序均按照1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）和捷克共和国科学院实验医学研究所动物护理委员会于2009年4月17日批准的动物护理指南执行；批准号85/2009。
大鼠脑缺氧/缺血的诱导
成年雄性Wistar大鼠（200至250 g）预先服用阿托品（100µg/kg，s.c.；Biotika，斯洛伐克共和国），并用戊巴比妥钠麻醉（PTB，65 mg/kg，i.p.；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）。如前所述，双侧颈总动脉闭塞15分钟，再加上缺氧条件，可导致缺氧/缺血[22],[23]大鼠通过插管插管（爱尔兰斯莱戈Abbott Abbott-T 16G），并用33.3%氧气进行机械通气2和66.6%氮2在颈动脉闭塞前和再灌注前60分钟，使用CIV-101动物呼吸机（美国俄亥俄州哥伦布市哥伦布仪器公司）持续15分钟（频率为60周/分钟，捷克共和国布拉格林德气体公司）。使用加热垫控制体温，并在整个手术过程中保持在37±1°C。暴露双侧颈动脉并用动脉瘤夹封堵15分钟。在闭塞期间，大鼠用6%的氧气进行通风2和94%N2（林德天然气公司，捷克布拉格）。H/I 15分钟后，取下夹钳，恢复血流。在作为对照的假手术大鼠中，颈总动脉暴露但未闭塞。大鼠在缺氧/缺血后存活1小时（1H H/I）或7天（7D H/I）。这些动物被单独饲养，并允许食物和水随意.
用于电生理学的急性脑切片制备
再灌注期后，用亚致死剂量的PTB（100 mg/kg，i.p.）对大鼠进行深度麻醉，并用冷（4°C，40 ml）隔离液经心灌注，该隔离液包含（mM）：110 NMDG-Cl，2.5 KCl，24.5 NaHCO三，1.25钠2高功率放大器4，0.5氯化钙2，7氯化镁2，20葡萄糖（pH 7.4，渗透压290 mOsm/kg）。斩首后，大脑被迅速解剖出来，并用3 M Vetbond组织粘合剂固定在切割盘上（美国佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司）。然后将大脑转移到含有冷（4°C）隔离溶液的切片室中，隔离溶液中通入95%的氧气2和5%CO2。使用HM 650 V振动切片机（德国Walldorf，Thermo Scientific Microm）切割横向220µm厚切片。随后，将切片在隔离溶液（34°C）中培养30分钟，然后保存在人工脑脊液中，也称为aCSF（参见)在室温下至少1小时。
表1
钙的细胞外和细胞内溶液的组成2+成像和拼接灯测量。
| 用于[Ca的细胞外溶液2+]我测量在体外和就地
|
| 氯化钠 | 氯化钾 | 氯化镁2
| 氯化钙2
| 碳酸氢钠三
| 纳2高功率放大器4
| 葡萄糖 | 毫奥斯米/千克 | |
|
aCSF公司
| 122 | 三 | 1.3 | 1.5 | 28 | 1.25 | 10 | 305±5 | |
|
aCSF公司Ø钙
| 122 | 三 | 1.3 | – | 28 | 1.25 | 10 | 305±5 | |
|
用于全细胞补丁灯记录的胞外溶液
在体外
和
就地
|
|
氯化钠
|
氯化钾
|
氯化镁
|
氯化钙2
|
庚烯
|
CsCl公司
|
葡萄糖
|
毫奥斯米/千克
|
酸碱度
|
|
分机1
| 140 | 4 | 2 | 2 | 10 | – | 5 | 315±5 | 氢氧化钠 |
|
分机2
| – | – | 2 | 10 | 10 | 122 | 5 | 315±5 | 氢氧化铯 |
|
分机2Ø钙
| – | – | 2 | – | 10 | 122 | 5 | 315±5 | 氢氧化铯 |
|
用于全细胞补丁灯记录的细胞内解决方案
在体外
和
就地
|
|
CsGluc公司
|
CsCl公司
|
氯化钾
|
氯化钙2
|
氯化镁2
|
EGTA公司
|
庚烯
|
毫奥斯米/千克
|
酸碱度
|
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国际1
| – | – | 130 | 0.5 | 2 | 5 | 10 | 280±5 | KOH公司 |
|
国际2
| 100 | 26 | – | – | 2 | 1 | 10 | 300±5 | 氢氧化铯 |
海马CA1区分离星形胶质细胞原代培养的制备
原代培养的星形胶质细胞取自所有实验组大鼠：假手术大鼠和缺氧/缺血后1小时和7天的大鼠。如上所述进行经心灌注和切片制备，而冠状切片的厚度为700µm。将海马CA1区从切片中分离出来，切成小块，放入Falcon试管中，加入4 ml Dubelcco改良鹰培养基（DMEM，Gibco-Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），其中含有15%的胎牛血清（FBS，PAA Laboratories GmbH，Pasching，Austria），然后以2000 rpm离心3分钟。丢弃上清液，用微量移液管在含有0.05%胰蛋白酶和2 g/l乙烯二胺四乙酸（EDTA，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）的2 ml溶液中分离组织。3分钟后，将解离的细胞转移到含有2ml FBS溶液的Falcon管中，以阻断胰蛋白酶作用。离心（2000 rpm下3 min）后，去除上清液，添加新鲜培养基（含15%FBS的DMEM）至6 ml。将细胞重新悬浮，并将其以0.5 ml的体积涂布在12个涂有聚赖氨酸（PLL，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）的盖玻片上。细胞在含有15%FBS的DMEM中培养，培养箱（100%湿度，5%CO2)在37°C下，第4天进行介质交换。4-5天后，将细胞用于免疫细胞化学、斑贴和[Ca2+]我测量值。
溶液和试剂
解决
我们的实验中使用了各种细胞外和细胞内溶液，它们列于.
用于细胞内钙（[Ca2+]我)在体外和就地细胞外溶液aCSF和aCSFØ钙使用了。用于星形胶质细胞的电生理特征就地和在体外使用细胞外溶液aCSF和细胞内溶液Int1，而如Benfenati和合著者之前所述，使用细胞外液Ext1和细胞内液Int2获得TRPV4通道特性的记录[21]为了便于隔离TRPV4电流，Na+和K+通过替换Na消除了电导+和K+带Cs+在细胞外（Ext2）和细胞内溶液（Int2）中。在细胞内溶液中，Cl-被葡萄糖酸部分替代以减少星形胶质细胞Cl的活化-电导[24]所有化学品均购自美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich。
激动剂和拮抗剂
TRPV4活化剂4-alpha-phorbol 12，13-didecanate（4αPDD，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）以5µM的浓度涂抹于在体外和5-10µM就地研究。将细胞暴露于4αPDD中6-8分钟。将4αPDD保存在−20°C的二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）中的等分试样中。在二甲基亚砜中也制备了等分的钌红（RR，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）和RN1734（Tocris Bioscience，Bristol，UK）。等分样品在−20°C下储存，并在使用前立即制备溶液（二甲基亚砜的最终浓度小于0.03%）。
补丁灯记录
在切片中的全细胞结构以及原代培养的星形胶质细胞中，使用斑贴技术记录膜电流。使用P-97 Brown-Flaming微量移液器（Sutter Instruments，Novato，CA，USA）从硼硅酸盐毛细血管（0.86 ID，美国加利福尼亚州诺瓦托Sutter仪器公司）中制成尖端电阻为8-12 MΩ的记录移液管。为了可视化所记录的细胞，细胞内溶液中含有Lucifer Yellow（LY，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）或Alexa-Ffluoro hydrazide 488/594（Molecular Probes，Carlsbad，CA，US）。LY标记细胞用于进一步的记录后免疫细胞化学鉴定。因为TRPV4是一个中度热敏通道[16]，电生理实验在28±2°C下进行。电生理数据使用由TIDA或PatchMaster软件（HEKA Elektronik，Lambrecht/Pfalz，Germany）控制的EPC10放大器以10 kHz采样频率进行测量，并使用贝塞尔滤波器在2.9 kHz下进行过滤。将带有原代星形胶质细胞培养物的急性脑切片或盖玻片转移到配备电子微操作器（德国拉廷根Luigs&Neumann）和高分辨率AxioCam HRc数码相机（德国蔡司）的立式Axioscop显微镜（德国哥廷根蔡司公司）的记录室。
静息膜电位（V休息)和膜电容（C米)如前所述进行测量[25]输入电阻（IR）由膜去极化诱发的电流确定，在去极化开始后40 ms，从−70 mV到−60 mV。使用TIDA和Fitmaster软件（德国兰姆勒支HEKA）分析电生理数据。使用JPCALCW软件对记录的膜电位进行液结电位校正[26].
细胞内钙水平的微荧光分析
在37°C的培养箱（100%湿度，5%CO）中，在含有3.3µM Fluo-4 AM和0.07%Pluronic F-127（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）的1.5 ml DMEM+15%FBS培养基中培养带4-5天细胞培养物的盖玻片1小时2). 然后将盖玻片转移到显微镜灌注室，在每个盖玻片上进行两次测量，测量区域之间保持足够的距离。测量后，对GFAP进行免疫细胞化学染色，以确认被测细胞的星形胶质细胞特性。
现场在放射层海马CA1区，位于切片表面以下10–20µm处。如前所述，使用振动切片机在4°C隔离溶液中切割220µm厚的横向脑片。然后将其在含有95%O气体的隔离溶液中培养20分钟2和5%CO2在34°C下含有1µM磺胺罗丹明101（SR-101，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）。然后将切片置于培养皿中的尼龙网上（3 ml体积），并在室温下在含有4µM Fluo-4 AM和0.01%Pluronic F-127的CSF中培养60分钟。在孵育过程中，培养皿处于黑暗环境中，并使用95%的O气体2和5%CO2然后将切片安装在显微镜的灌注室上，并在它们之间足够的距离上进行两次测量。为了验证被测细胞是否为星形胶质细胞，使用了SR-101染色，因为星形胶质细胞优先使用这种荧光染料[27].
在测量过程中，以2.5 ml/min的流速向显微镜灌注室持续灌注aCSF。在整个实验过程中，使用ThermoClamp-1（AutoMate Scientific，Inc.Berkeley，CA，USA）将温度保持在28±2°C。溶液通过距离测量区域0.5–1 mm的毛细管（内径250µm）施加，并连接到由ValveBank II控制器（美国加利福尼亚州伯克利AutoMate Scientific公司）控制的灌注压力套件加压应用系统（流速600µl/min）。由于TRPV4通道对拉伸敏感[28]在施用4αPDD之前和之后，以相同的流速施用aCSF，以验证反应不受施用本身的影响。Fluo-4荧光是用安装在蔡司Axioskop 2 FS Plus显微镜上的TILL光子成像系统检测的，该显微镜配备了10×长距离物镜（Achroplan 0.3 W，Ph 1，Zeiss，Germany）用于测量在体外或远距离40倍物镜（IR Achroplan 0.8 W，Zeiss，德国）进行测量就地数字相机（PCO Sensicam，Kelheim，Germany）由TILLvisION软件控制。激发光（488 nm）由Polychrome V（TILL Photonics GmbH，Gräfelfing，Germany）产生，由BP 450–490激发带通滤波器过滤，由FT 510分束器反射，发射光由LP 515长通滤波器过滤（滤波器组09，Zeiss，German）。以0.83 Hz的频率采集图像并进行离线分析。在细胞体中测量荧光强度（F），并表示为（F−F0)/F类0背景校正后，其中F0是用药前的基线荧光强度。Ca的阈值2+响应在体外是F的120%0，以及瞬态峰值的阈值振幅就地是噪声信号振幅的200%。SR-101（570 nm）的激发光由BP565/30带通滤光片过滤，由FT585分束器反射，发射光由620/60带通滤光器过滤（滤光片组31，德国蔡司）。
免疫细胞化学/免疫组织化学
原代培养星形胶质细胞在培养的第4-5天，将PLL涂层盖玻片固定在0.2M磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.4）中的4%多聚甲醛溶液中8分钟，并在4°C下保存在10mM磷酸盐缓冲盐水（PBS）中以进行进一步处理。盖玻片在含有5%Chemiblocker（Millipore，Billerica，MA，USA）和0.5%Triton X-100（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA。然后将它们与兔抗TRPV4抗体（1∶200；Novus Biologicals，Littleton，CO，USA）在含有0.2%Triton X-100的PBS中在4°C下孵育过夜。隔夜培养后，用PBS进行三次10分钟洗涤，然后用Alexa 488-共轭山羊抗兔IgG-（1∶200；GAR-488，Molecular Probes，Carlsbad，CA，USA）在4°C下培养2小时。为了进行双重标记，随后应用针对GFAP并与Cy3结合的小鼠单克隆抗体（1∶800；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA），并在4°C下培养过夜。然后，在PBS中清洗盖玻片三次，每次10分钟。为了观察细胞核，将盖玻片与300 nM 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）在PBS中在室温下孵育5分钟。最后，使用Aqua Poly/Mount（Polysciences Inc.，Eppelheim，德国）安装了盖玻片。
大脑切片由对照大鼠和H/I后1H和7D的大鼠制备。用亚致死剂量的PTB（100 mg/kg，I.p.）麻醉动物，并经心灌注70 ml 0.9%生理盐水和肝素（2500 IU/100 ml），（捷克共和国布拉格泽蒂瓦），然后灌注70 ml 4%多聚甲醛溶液于PBS（PFA/PBS）。将解剖的大脑在4%PFA/PBS中固定过夜，在0.2M PB中加入10%、20%和30%蔗糖系列溶液冷冻数小时，然后在冠状面（30µM厚）进行切片。为了提高免疫染色的效率，将切片在80°C的柠檬酸缓冲液（10 mM柠檬酸，0.05%吐温20，PB，pH 6.0）中培养20分钟。在PB中洗脱后，将切片进一步在含有2%正常山羊血清（NGS、Millipore、Billerica、MA、USA）、5%Chemiblocker、1%牛血清白蛋白（BSA、Sigma-Aldrich、St.Louis、MO、USA和0.5%Triton X-100）的封闭溶液中培养2小时，温度为4°C。将表位特异性兔抗TRPV4抗体（1∶500）和Cy3-结合小鼠抗GFAP抗体（1比800）稀释在5%化学锁定剂中，并与切片在4℃孵育过夜。孵育后，用PBS进行三次10分钟洗涤，去除未结合抗体。应用Alexa 488-共轭山羊抗兔IgG（1∶200）（GAR-488，Invitrogen/Mollecular Probes，Carlsbad，CA，USA），并在4°C下培养切片2小时。然后在PBS中清洗切片，并用含有DAPI（加利福尼亚州伯林盖姆向量实验室）的Vectashide进行贴装，以可视化细胞核。为进行缺氧/缺血后海马的免疫组织化学分析，使用小鼠抗NeuN（1∶100；Millipore，Billerica，MA，USA）和Cy3-偶联小鼠抗GFAP（1∶800）一抗。为了在斑贴灯记录后进行细胞鉴定，用Alexa Fluor 488酰肼或LY填充被测细胞，方法是用斑贴吸管溶液透析细胞质。记录后，用4%PFA将盖玻片和切片分别固定在100 mM PB中8分钟或1小时。在含有5%Chemiblocker和0.5%Triton X-100的封闭溶液中于10 mM PBS中孵育后，在4°C下施用Cy3-共轭小鼠抗GFAP（1∶800）2小时。如前所述，脉络丛中的强TRPV4免疫染色证实了TRPV4染色的特异性[8],[16]。然后使用LSM 5 DUO光谱共焦显微镜（德国蔡司）检查切片/盖玻片。
Western印迹
在H/I（1H、6H、1D、3D、7D）后，从大鼠、误操作动物（6H、3D）或完整动物中分离出用于Western blot分析的海马样本。用PTB（100 mg/kg，i.p.）对大鼠进行深度麻醉，用冷冻隔离液经心灌注并斩首。将大脑解剖并切割成500µm厚的切片。从每个切片中切除海马CA1区，并使用超声波均质器在含有10%甘油和1%十二烷基硫酸钠（SDS）的Tris缓冲液（pH 6.8）中均质。匀浆中的总蛋白质含量由Micro BCA™蛋白质分析试剂盒（ThermoFisherScientific，Rockford，IL，USA）测定。组织匀浆在100°C下用0.5%二硫苏糖醇加热5分钟。在6%SDS-聚丙烯酰胺凝胶（用于TRPV4蛋白）或10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶（对于GFAP和β-肌动蛋白）上分离等量的蛋白质，然后使用TE 70XP半干法转移装置（美国马萨诸塞州霍夫市霍利斯顿）将其电转移到硝化纤维素膜上。在室温下，用5%的非脂肪干乳在PBS–吐温缓冲液（0.05%吐温）中封闭膜1小时。用稀释在含有1%非脂奶粉、0.05%吐温和0.1%NaN的PBS中的一级抗体进行培养三在4°C下过夜，然后在室温下用山羊抗兔IgG结合过氧化物酶（Sigma–Aldrich，St.Louis，MO，USA）孵育2小时。使用以下主要抗体：兔抗GFAP（1∶600，Sigma–Aldrich，St.Louis，MO，USA）、兔抗TRPV4（1∶300；Alomone Labs，Jerusalem，Israel）和兔抗β-actin（Abcam，Cambridge，UK）。使用SuperSignal West Pico化学发光底物（美国伊利诺伊州罗克福德市赛默飞世尔科学公司）制备Western印迹。为了量化TRPV4蛋白含量的变化，使用Quantity One软件（美国加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad Laboratories）对1-D电泳凝胶进行成像和分析。使用3个独立的蛋白质印迹分析进行定量(图S1).
定量PCR分析
解剖后立即将3只非手术大鼠和3只缺血大鼠（H/I后1H）的海马CA1区放入RLT缓冲液中（Qiagen，Gemany）。使用RNeasy Mini试剂盒提取总RNA，包括DNA酶处理（Qiagen，德国）。使用NanoDrop ND-1000分光光度计（NanoDrop Technologies）测量RNA浓度。使用SuperScript III（生命技术），按照最近的描述执行逆转录[29]使用Biorad CFX（Bio-Read Laboratories，Hercules，CA，USA）和95°C的温度曲线进行实时PCR测量，持续3分钟，然后在95°C下进行40次循环，持续15秒，60°C持续15秒和72°C持续20秒。10毫升反应包含iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad Laboratory，Hercles，CA，US）每种底漆400 nM（德国Metabion）。使用的引物序列为：Trpv4型_转发：TTTGCTCTTATTCTACTCCC公司和Trpv4型_反向：GCTGGCTTAGGTGACTCC公司参考基因使用小鼠内源性控制基因小组（瑞典TATAA生物中心）和NormFinder进行评估。所有数据均按照β2-微管蛋白标准化(B2M）使用ΔΔCq方法计算表达的相对变化[30].
数据分析与统计
数据表示为平均值±S.E.M.（平均值的标准误差）n个细胞。学生的未婚t吨-使用多重比较的检验或单向方差分析来确定实验组之间的显著差异。*p<0.05的值被视为显著，**p<0.01非常显著，***p<0.001非常显著。
结果
海马星形胶质细胞中TRPV4免疫反应性的增加与星形胶质细胞病的发展相一致
为了研究TRPV4通道在星形胶质细胞中的表达及其对缺氧/缺血诱导的星形胶质细胞反应性的可能贡献，我们对对照组和缺血组大鼠的海马进行了免疫组织化学分析(
)如Anderova和合著者之前所述[22]缺氧/缺血损伤的特征是，缺氧/缺血（H/I）后3-7天内发生神经元丢失导致NeuN免疫反应性降低，H/I后7天内星形胶质细胞增生导致GFAP免疫反应性增加(). 在对照海马切片中，TRPV4和GFAP抗体的双重免疫染色显示神经元TRPV4免疫反应金字塔层CA1区和仅有少数TRPV4阳性星形胶质细胞放射层控件的(
)然而，随着H/I反应性胶质增生的进展，星形胶质细胞中TRPV4免疫反应性逐渐增强，在CA1锥体神经元中随着神经元细胞持续死亡而下降。在再灌注7天内，我们观察到TRPV4免疫反应从神经元向反应性星形胶质细胞转变（数据未显示）,导致TRPV4仅在反应性星形胶质细胞中表达(
)再灌注7天后，CA1海马区未发现TRPV4阳性的锥体细胞。为了验证H/I后TRPV4的分子表达，我们对对照大鼠和H/I后1小时（1H）、6小时（6H）、1天（1D）、3天（3D）和7天（7D）的海马CA1区提取的蛋白裂解物进行了蛋白质印迹分析。在H/I后1H，随着TRPV4蛋白水平的增加，检测到分子量～120 kDa的TRPV4阳性条带，而H/I之后1D和7D，TRPV4的整体表达下调(
和图S1)此外，定量实时PCR分析显示，与假手术大鼠海马CA1区的mRNA含量相比，H/I后1小时TRPV4 mRNA的含量增加了2.4倍(
).正如星形胶质细胞反应性增加所预期的那样，缺血后GFAP在3D和7D逐渐增加(
和图S1)免疫细胞化学和Western blotting之间TRPV4表达的明显差异可能是由于H/I后神经元活性降低，这可能是海马CA1区总细胞裂解物中观察到的TRPV4蛋白水平总体下降的原因。
缺氧/缺血后再灌注大鼠海马的免疫组织化学分析。(A类)用神经标记物（NeuN）和星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）对假手术大鼠（CTRL）和缺氧/缺血（H/I）后7天（7D）的大鼠海马冠状切片进行免疫染色。与对照组相比，右侧组织切片的放大显示H/I后7D海马CA1区锥体细胞丢失和反应性胶质增生形成。(B类)海马CA1区TRPV4免疫染色。对照组和缺血大鼠的冠状切片标记TRPV4（绿色）和GFAP（红色）。注意，在对照组中，在锥体细胞中检测到TRPV4免疫反应，在星形胶质细胞中更为罕见。随着星形胶质细胞增生症的发展，星形胶质细胞中TRPV4免疫反应增强。H/I后7天，在锥体细胞中未检测到TRPV4表达，而在星形胶质细胞中显著增加。使用以下缩写：H/I（缺氧/缺血）、CTRL（假手术大鼠）、1H（1小时）、缺氧/缺血后7D（7天）、s.p.（金字塔层）、s.r.（放射层）。
缺氧/缺血后海马CA1区TRPV4蛋白的Western blot和PCR分析。(A类)缺氧/缺血后1小时（1H）、6小时（6H）、1天（1D）、3天（3D）和7天（7D）假手术大鼠海马CA1区TRPV4、GFAP和β-actin蛋白表达的时间依赖性变化。注意，GFAP的表达在缺血后3天和7天逐渐增加。β-actin作为负荷对照。(B类)TRPV4蛋白水平的时间依赖性变化表明，H/I后TRPV4蛋白质1H显著增加。数据来自3个独立的Western blot分析。(C类)定量RT-PCR显示，与假手术大鼠相比，H/I后1H TRPV4 mRNA水平显著增加。数据来自海马CA1区总mRNA的3次独立分离。采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验计算统计显著性*p<0.05显著，**p<0.01非常显著。
反应性星形胶质细胞中TRPV4介导的反应增强现场缺氧/缺血后
在证明了TRPV4在星形胶质细胞中的表达随着H/I的反应而增加后，我们接下来试图通过分析[Ca]的变化来阐明缺血损伤对海马CA1区星形胶质细胞TRPV4通道活性的影响2+]我信号。微荧光[Ca的典型图像2+]我星形胶质细胞的测量就地如所示自发瞬变[Ca2+]我在非缺血大鼠的星形胶质细胞中，可以典型地观察到aCSF中测得的峰值(
，蓝色轨迹，CTRL，n=35）。这些自发瞬态Ca的振荡频率2+随着再灌注时间的延长，峰值显著增加(
,H/I后——绿色迹线，n=27；H/I后7D-红色痕迹，n=30），与对照组相比，H/I后天星形胶质细胞7D增加约20倍(
).随后应用选择性TRPV4激动剂5µM 4αPDD[31]导致峰值频率增加(
)在H/I后1H的少数星形胶质细胞和H/I之后7D的大多数星形胶质细胞中，4αPDD诱发[Ca2+]我信号(
).虽然最初4αPDD应用诱发[Ca2+]我与对照组或H/I后1H的星形胶质细胞中观察到的振荡相似，H/I延长暴露于4αPDD后7D的星形胶质胶质细胞中的振荡导致持续钙的生成2+条目。4αPDD在细胞外钙缺乏时的应用2+（aCSFØ钙)立即几乎完全废除了Ca2+尖峰活性，在重新添加Ca后恢复2+在洗脱过程中，在H/I后7D的一些星形胶质细胞中，升高的信号振幅恢复，但不再检测到明显的峰值。在新型TRPV4抑制剂10µM RN1734存在下应用5µM 4αPDD[32]，废除了约70%的Ca2+H/I后7D星形胶质细胞的棘波活动，在aCSF中洗脱后未恢复(
)我们还发现H/I后7D的自发Ca2+瞬变部分由TRPV4通道介导，因为RN1734的应用阻断了这种自发Ca的～45%2+瞬态(
)有趣的是，H/I 4αPDD后7天不仅增加了自发Ca2+瞬态，但也导致持续的Ca2+如中所示的条目（红线），表示基线荧光强度增加。如此持久的钙2+在缺乏细胞外钙的情况下，其始终被完全阻断2+，在对照组中罕见（35个细胞中有1个细胞）；然而，它随着再灌注时间的延长而增加：H/I后271H中有4个细胞检测到它，H/I之后307D中有17个细胞检测出它。令人惊讶的是，RN1734仅阻断Ca2+瞬态；我们从未观察到钙的持续下降2+针对该抑制剂的条目(
，红线)缺血后星形胶质细胞中4αPDD特异性反应的发生率增加；只有56%的对照组星形胶质细胞表现出4αPDD诱发的[Ca2+]我，振荡，而分别有78%和84%的星形胶质细胞在H/I后1小时和7天对4αPDD应用有反应。这些结果表明，TRPV4在缺血星形胶质细胞中的表达/免疫反应增强伴随着TRPV4介导的Ca增强2+振荡。
TRPV4激动剂4αPDD触发Ca2+海马CA1区星形胶质细胞的振荡。(A–D)负载钙荧光探针Fluo-4 AM的急性大鼠海马脑片中的星形胶质细胞对TRPV4通道激动剂4αPDD（5µM）的应用产生荧光增强反应。（A） 在aCSF中应用4αPDD之前的细胞(B类)在4αPDD应用期间(C类)在不含Ca的aCSF中应用4αPDD期间2+（aCSFØ钙)和(D类)在用CSF冲洗时。注意B中箭头指示的荧光增加(E类)装有磺胺罗丹明101（SR-101）的细胞，以验证被测细胞是否为星形胶质细胞。(F类)缺氧/缺血后1小时（1H H/I）和7天（7D H/I。(G公司)应用4αPDD（aCSF）前、应用4αPD（4αPDP）期间和应用4αPDF期间每小时平均细胞内钙瞬变的直方图Ø钙aCSF中的（4αPDDØ钙)洗脱后（aCSF），在缺氧/缺血后1小时（1H H/I）和7天（7D H/I。(H（H）)响应细胞数量的直方图（n=所有分析细胞的数量）。这些值表示为平均值±S.E.M.使用单向方差分析计算统计显著性*p<0.05，显著***p＜0.001，非常显著。
TRPV4拮抗剂RN1734降低4αPDD诱导的和自发的Ca2+缺血7天后海马CA1区星形胶质细胞的振荡。(A类)在应用4αPDD（aCSF）之前，在缺氧/缺血7天后，在应用5µM 4αPDC期间，在应用10µM RN1734的5µM 4αPDT期间，以及在洗脱（aCSV）之后，从非手术大鼠（CTRL）和大鼠（7D H/I）制备的切片中，海马星形胶质细胞的代表性荧光痕迹。(B类)施用4αPDD（aCSF）前、施用5µM 4αPDD+10µM RN1734期间、以及在aCSF中洗脱后，在假手术大鼠（CRTL，n=43）和缺氧/缺血后7天（7D H/I，n=40）。(C类)应用RN1734（aCSF）之前和应用10µM RN1734期间每小时平均自发细胞内钙瞬变的直方图，在缺氧/缺血7天后从急性海马脑片中测量星形胶质细胞（7D H/I，n=10）。数值表示为平均值±S.E.M.使用（B）中的单向方差分析和（C）中的配对t检验计算统计显著性***p<0.001极显著，**p<0.01极显著。
接下来，我们研究了H/I对星形胶质细胞中TRPV4介导的电流的影响就地在Ext1中，通过将星形细胞膜从−100 mV到+100 mV以20 mV的增量进行超极化和去极化，以保持电位（V小时)−70毫伏时(
)一般来说，成熟的海马星形胶质细胞表现出被动电流模式，以时间和电压依赖性电流为特征，主要由K携带+通道，以及它们的被动膜特性列于.与我们之前发布的数据一致[23]H/I后7天，CA1海马星形胶质细胞轻微去极化。为了更准确地分离TRPV4特异性阳离子电流，在细胞内和细胞外溶液中进行进一步记录，其中K+和Na+被替换为Cs+
[21]在这些实验条件下，超极化和去极化电压诱发的膜电流从−100 mV阶跃至+100 mV（V小时−40 mV）减少(
)为了激发TRPV4介导的电流，星形胶质细胞就地在Ext2溶液中记录，并涂抹10µM 4αPDD 6–8分钟。细胞被夹在V小时0 mV，500 ms电位阶跃至−100 mV后，电压从−100 m V上升至+100 m V（500 ms）。只有25%的对照组星形胶质细胞表现出4αPDD诱发电流，而H/I后反应性星形胶质细胞的发生率增加了1H（52%）和7D（59%）(
)在+/-100 mV电压下，4αPDD电流反应的阈值为控制斜坡电流的120%（在应用激动剂之前）(
)，在激动剂应用开始后延迟1–3分钟，具有相当线性的电流-电压关系(
).然而，4αPDD诱发电流振幅与对照星形胶质细胞或H/I后记录的相比没有显著差异(图S2)暴露于4αPDD后，反转电位从−15.1±2.2 mV变为−5.9±1.7 mV（ΔE转速 = 9.1±1.7 mV，n=13），这与阳离子电流的发展一致。在缺乏细胞外钙的情况下2+（分机2Ø钙)4αPDD诱发电流振幅降低68.7±18.3%（n=4，). 最后，在细胞外应用非特异性TRP通道抑制剂钌红（RR，10µM）[33]或RN1734（10µM）分别使4αPDD诱发电流降低73.3±15.7%（n=4）和56.9±15.0%（n=4）(
).这一发现进一步有力地表明TRPV4参与了4αPDD的当前反应。这三个实验组的药理学特征在质量上完全相同。这些结果与TRPV4在培养的星形胶质细胞中的功能性表达所描述的结果重叠[21]，它们强烈表明TRPV4通道也在功能上表达就地在CA1区的海马星形胶质细胞中，并且在H/I后上调。
4αPDD引起星形胶质细胞膜电导增加现场。
(A类)星形胶质细胞的典型电流模式就地H/I后7天在海马CA1区记录，保持电位为−70 mV(左侧，细胞外液Ext1含有K+和Na+)以及在−40mV时(正确的，K（K）+和Na+被Cs取代+细胞外溶液Ext2）。(B类)来自假手术大鼠（CTRL）和H/I后1H和7D大鼠的海马星形胶质细胞对10µM4αPDD有反应的百分比（n=细胞数量）。4αPDD电流响应的阈值为控制斜坡电流的120%（在应用激动剂之前），电压为+/-100 mV。这些值表示为平均值±S.E.M。使用单向方差分析计算统计显著性*p<0.05，显著**p<0.01，非常显著。(C类)对照组（蓝色方块）星形胶质细胞和H/I后星形胶质细胞1H（绿色三角形）和7D（红色圆圈）的ramp协议测得的4αPDD诱发电流的时间进程。根据电压斜坡刺激协议，在−100 mV（白色箭头）和+100 mV（黑色箭头）下测量电流（参见插图）。(D类)之前（Ext2溶液中，虚线）和应用4αPDD期间（全线），在对照组（左侧）和H/I后1H（中间）和7D海马星形细胞中记录的稳态电流（与C中的细胞相同）的代表性痕迹。稳态电流的代表轨迹是在C中的蓝色方块、绿色三角形和红色圆圈所示的时间获得的。白色和黑色箭头表示施加的电压斜坡和相应的电流轨迹（参见C中的插图）。
海马星形胶质细胞中4αPDD诱发的电流就地被无钙细胞外溶液钌红或RN1734还原。(A–C，左侧)H/I（电压协议见插图）后，在4αPDD（10µM）用药之前和期间，以及去除细胞外Ca后，根据斜坡协议在星形胶质细胞7D中测得的4αPDD-诱发电流的时间进程2+（分机2Ø钙,A类)或使用TRPV4抑制剂后，如钌红（RR，10µM，B类)或RN1734（10µM，C类). (A-C，右侧)Ext2溶液（黑线）、4αPDD施用期间（红线）和去除细胞外Ca后获得的稳态电流（与左图中的细胞相同）的痕迹2+（分机2Ø钙,A类)或使用TRPV4抑制剂后，如钌红（RR，10µM，B类)或RN1734（10µM，C类)，用蓝线表示。在由相应颜色的星号指示的时间获得稳态电流的代表性轨迹。
表2
假手术（CTRL）大鼠脑片及H/I后1H和7D记录的海马星形胶质细胞膜特性。
| V（V）休息（毫伏） | 红外（兆欧） | C类米（pF） | n个 |
|
CTRL键
| −75.3±1.2 | 65.1±9.7 | 25.8±3.7 | 16 |
|
1小时H/I
| −72.3±1.4 | 66.8±6.7 | 24.9±3.6 | 16 |
|
7D H/I型
| −69.1±1.5** | 89.4±9.6 | 20.4±2.6 | 14 |
从缺血海马CA1区分离的原代培养星形胶质细胞中TRPV4介导的活性增强
众所周知，星形胶质细胞中的记录就地受其较大的被动K影响+电导和与其他星形胶质细胞的功能耦合。此外，我们的就地实验中，我们不能排除TRPV4介导的电流主要在神经元中诱发，因此可以触发Ca2+进入星形胶质细胞。为了解决这个问题，我们研究了从假手术大鼠海马CA1区分离的单个初级星形胶质细胞中的TRPV4反应，以及H/I后1H和7D的星形胶质细胞，并培养了4-5天。在所有实验组中，用抗GFAP和GLAST抗体对原代培养的星形胶质细胞进行免疫细胞化学染色，显示出两种不同的形态星形胶质细胞：即具有扁平多边形或细长胞体的星形细胞和具有非扁平小卵形胞体和多个长突起的星形细胞(
)测定对照组、H/I后1H和7D中GFAP阳性扁平和非扁平星形胶质细胞的数量，并以GFAP阳性细胞总数的百分比表示。有趣的是，这两种形态不同的星形胶质细胞的比例随着H/I的改变而改变(
)从对照组大鼠获得的星形胶质细胞培养物包含56±3.6%的扁平星形胶质细胞（盖玻片数量，n=17），而在缺血动物获得的培养物中，H/I后1H分离培养物中星形胶质细胞的数量显著下降至31±3.9%（n=17，H/I后7D分离培养物的数量显著降低至17±4.3%（n=21）。相反，非扁平星形胶质细胞的百分比随着缺血损伤而增加。尽管如此，它们的被动膜特性与在扁平星形胶质细胞中观察到的无显著差异。
海马CA1区分离培养星形胶质细胞的免疫细胞化学鉴定。(A类)从非手术大鼠或缺血海马CA1区分离出的星形胶质细胞的独特形态：培养4-5天的扁平星形胶质细胞（顶部）和非扁平星形细胞（底部）。这两种类型的星形胶质细胞都表达GFAP和GLAST，并且TRPV4也呈阳性。(B类)对照组（CTRL）和H/I后从CA1海马区1H和7D分离的星形胶质细胞中扁平和非扁平星形胶质细胞的发生率（n=盖玻片的数量）。这些值表示为平均值±S.E.M.使用单向方差分析计算统计显著性*p<0.05，显著***p<0.001，极显著。
微荧光实验在体外显示[Ca增加2+]我在对照动物（n=92）分离的星形胶质细胞以及H/I后分离的1H（n=72）和7D（n=38）中应用5µM 4αPDD后(
).[加利福尼亚州]2+]我与其他两组相比，H/I后7D从动物身上分离的星形胶质细胞的增加明显更高(
左栏）.加州2+当4αPDD应用于aCSF时，信号强烈减弱Ø钙不同的4αPDD介导的Ca2+H/I后动物7D分离的星形胶质细胞的反应也可以通过反应细胞数量的增加来证明(
顶部）以及对4αPDD应用的反应更快(
底部）此外，该组对4αPDD的反应开始的陡度也较高。这些[Ca的差异2+]我在星形胶质细胞中观察到的信号参数在两个形态不同的亚群中是相同的。
细胞内钙2+分离自海马CA1区的培养星形胶质细胞的测量。（A–D）培养海马星形胶质细胞中5µM 4αPDD引发的典型荧光反应。（A） 在应用4αPDD之前，aCSF中有两个星形胶质细胞，（B）在应用4βPDD期间，（C）在应用aCSF时Ø钙和（D）在用CSF冲洗时。（E） 胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫细胞化学染色以验证星形胶质细胞的特性。（F） 在H/I后1小时（1H H/I）和7天（7D H/I。注意，在3种条件下，4αPDD激发与荧光增强开始之间的延迟。（G） 荧光强度dF/F变化直方图0描述了在aCSF中施用4αPDD后的最大强度（4αPDP），以及在aCSF4αPDC施用最后一分钟内的平均强度Ø钙aCSF中的（4αPDDB.2钙)以及冲刷期间的最大强度（aCSF）。（H） 响应细胞数量的直方图（顶部）和4αPDD响应时间延迟的直方表（底部）。注意，在H/I后7天（7D）的星形胶质细胞中，TRPV4介导的Ca2+与对照组相比，输入增强，响应单元格的数量更高。这些值表示为平均值±S.E.M.使用单向方差分析计算统计显著性*p<0.05，显著**p<0.01，非常显著***p<0.001，极显著。
为了确定这两种类型星形胶质细胞的当前模式在体外，生理Na+-和K+-使用了含有的溶液(). 在膜片钳记录过程中，用LY或Alexa-Fuoruoruo hydrazide标记的细胞通过抗GFAP抗体被鉴定为星形胶质细胞(
)记录星形胶质细胞膜电流，以响应超极化和去极化电压阶跃，电压阶跃范围为−160 mV至+20 mV小时培养4-5天的分离星形胶质细胞显示出两种不同的电流剖面，正如Zhou和Kimelberg在新分离星形胶质胶质细胞上所描述的那样[34]扁平星形胶质细胞的主要特征是被动K+电流(
右侧）而非扁平星形胶质细胞显示出“复杂”的电流分布(
左）由于每个实验组扁平和非扁平星形胶质细胞的被动膜特性没有显著差异，因此将它们合并在一起(
).微荧光测量也没有发现4αPDD诱发的[Ca2+]我每个实验组扁平和非扁平星形胶质细胞之间的信号，因此两种类型的星形胶质细胞都用于电生理分析。
分离于海马CA1区的培养星形胶质细胞中的4αPDD诱导电流。(A类)一张装有路西法黄（LY）的星形胶质细胞的图像，在拼接灯记录和(B类)用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫染色鉴定相同的星形胶质细胞。叠加图显示了GFAP与LY的共同定位(C类)星形胶质细胞中的“复杂”和“被动”电流模式在体外由膜去极化和超极化诱发，保持电位为−70 mV。用K记录电流+-和Na+-包含内部和外部溶液（Int1和Ext1）。电压步进协议如插图所示。(D类)电压步进法在培养的星形胶质细胞中诱发的电流模式（见插图），记录在细胞内和细胞外溶液中，其中K+和Na+被Cs取代+（内部2和外部2）。注意膜电导显著降低。(E类)对照组星形胶质细胞（蓝色正方形）和星形胶质细胞H/I后1H（绿色三角形）和7D（红色圆圈）中根据斜坡方案测量的4αPDD诱发电流的时间过程。根据电压斜坡刺激协议，在−100 mV（白色箭头）和+100 mV（黑色箭头）下测量电流（参见插图）。(F类)在（Ext2溶液中，虚线）之前和4αPDD应用期间（全线），在对照组培养的星形胶质细胞（左侧）和H/I后的1H（中间）和7D中记录的稳态电流（与E中的细胞相同）的代表性痕迹。稳态电流的代表轨迹是在E中的蓝色方块、绿色三角形和红色圆圈所示的时间获得的。白色和黑色箭头表示施加的电压斜坡和相应的电流轨迹（参见E中的插图）。
表3
假手术（CTRL）大鼠海马CA1区分离星形胶质细胞的膜特性以及H/I后1H和7D。
| V（V）休息（毫伏） | 红外（兆欧） | C类米（pF） | n个 |
|
CTRL键
| −71.3±1.9 | 296.3±78.2 | 18.5±2.4 | 9 |
|
1小时H/I
| −77.2±1.4 | 211.8±58.8 | 26.6±1.2** | 25 |
|
7D H/I型
| −71.3±2.7 | 265.3±55.0 | 19.7±2.7 | 8 |
类似于就地实验中，使用K+和Na+被铯取代。在这些实验条件下，从−100 mV到100 mV的超极化和去极化电压阶跃所诱发的膜电流强烈减弱(
).4αPDD（5µM）的应用使对照组以及H/I后1H和7D的星形胶质细胞的膜电导增加，当电压从V增加到-100 mV至+100 mV时小时0毫伏(
)暴露于4αPDD导致E的正移转速从−5.8±1.1毫伏到−1.1±0.9毫伏（ΔE转速 = 4.7±0.9毫伏，n=19）。通过省略[Ca，4αPDD应用后斜坡电流的增加减少了74.0±11.9%（n=6）2+]e（电子）被RR（10µM）或RN1734（10μM）分别抑制79.7±10.5%（n=8）和69.8±18.7%（n=9）(
).值得注意的是，H/I后从大鼠海马7D分离的星形胶质细胞中，4αPDD诱发的外向和内向电流振幅和密度显著增加(
).
星形胶质细胞中4αPDD诱发的电流在体外被无钙细胞外溶液钌红或RN1734还原。(A–C，左侧)在应用4αPDD（5µM）之前和期间以及去除细胞外Ca后，H/I（电压协议见插图）后7D海马分离的星形胶质细胞中根据ramp协议测得的4αPDD-诱发电流的时间进程2+（分机2Ø钙,A类)或使用TRPV4抑制剂后，如钌红（RR，10µM，B类)或RN1734（10µM，C）。（A–C，右）Ext2溶液（黑线）、4αPDD应用期间（红线）和去除细胞外Ca后获得的稳态电流（与左侧细胞相同）的痕迹2+（分机2Ø钙,A类)或使用TRPV4抑制剂后，如钌红（RR，10µM，B类)或RN1734（10µM，C类)，用蓝线表示。在相应颜色的星号指示的时间内，获得了稳态电流的代表性迹线。
TRPV4介导的电流对缺氧/局部缺血的反应变化。4αPDD诱发电流振幅变化的直方图（A顶）和电流密度（A底部）+100 mV和电流振幅（B顶部）和电流密度（B底部）对照组星形胶质细胞（CTRL）和H/I后1H和7D大鼠分离的星形胶质细胞在−100 mV时的平均值为±S.E.M。使用单向方差分析计算统计显著性*p<0.05，显著**p<0.01，非常显著。
总之，这些结果支持这样一个原则，即TRPV4通道在培养的CA1原代星形胶质细胞中表达，并且在H/I后7天，从缺血CA1区分离的星形胶质细胞的活性显著上调。
讨论
在本研究中，我们首次证明了TRPV4通道在CA1海马星形胶质细胞中的功能性表达就地此外，这是首次描述全球脑缺血影响的研究体内TRPV4介导的电流与细胞内钙2+海马星形胶质细胞的信号传导。我们发现，在缺氧/缺血损伤诱导星形胶质细胞增生的过程中，成年大鼠海马CA1区星形胶质细胞中TRPV4通道的活性显著增加。
以前的研究表明，TRPV4在大脑中广泛表达，特别是在锥体海马层神经元以及皮层和海马星形胶质细胞中[9],[16],[21]然而，没有数据表明TRPV4通道在星形胶质细胞中的功能性表达就地在生理或病理生理条件下，如缺血。与之前的研究一致[8],[16]，我们在对照大鼠海马锥体神经元和海马CA1区星形胶质细胞中显示了TRPV4蛋白的表达。此外，我们发现缺血1小时后海马星形胶质细胞中TRPV4免疫反应增强，再灌注7天后达到最大水平。我们的免疫组织化学分析显示，假手术大鼠和大鼠在H/I后1小时，而不是H/I后7天，CA1锥体神经元都表达TRPV4。随着时间的推移，神经元TRPV4表达的减少显然是由于海马CA1区的广泛凋亡，抹去了大部分CA1锥体神经元[22]手术后动物的海马星形胶质细胞显示出非常低的TRPV4表达，主要在包裹血管的星形胶质细胞过程中检测到。值得注意的是，TRPV4免疫反应在H/I后1小时和7天显著增加。我们的Western blot分析显示，缺血1小时后TRPV4总蛋白含量增加，而且定量RT-PCR分析检测到TRPV4 mRNA增加了约2.4倍。先前曾描述过一个类似的发现，即星形胶质细胞乙酰胆碱酯酶（AChE）基因表达迅速增加（缺血后1小时内，AChE的通读量增加了两到三倍）[35]这些作者认为，应激诱导的AChE释放增加是由于功能性通读-AChE亚型表达上调，尽管缺血后1小时AChE释放增加可能归因于AChE mRNA转录稳定性的增加以及AChE转录速率的增加。此外，H/I后1H观察到的TRPV4蛋白水平增加可能至少部分是由于缺氧/缺血应激后数小时内TRPV4转录后修饰增强所致。这可能导致在1H和6H后出现与TRPV4不同亚型相对应的额外带，这些亚型以前在星形胶质细胞中检测到，并由Benfenati和合著者显示[21]然而，我们假设，较慢的TRPV4蛋白质降解或蛋白质稳定也可能有助于H/I后1H TRPV4蛋白量的增加。
奇怪的是，在H/I后的第1天，TRPV4蛋白的总含量开始下降。由于此时神经元大量死亡，海马CA1区不再存在神经元，因此海马CA1区域TRPV4蛋白质的水平可能会下降，因此，TRPV4蛋白的剩余表达几乎只存在于反应性星形胶质细胞中。值得注意的是，TRPV4表达增强与GFAP最大表达、星形胶质细胞肥大和星形胶质细胞增殖增加相一致[22]这可能表明TRPV4介导的Ca2+信号传导在胶质瘢痕适应性反应的形成中起着重要作用。然而，我们不能排除TRPV4活性的增加也可能与延迟星形细胞死亡的启动有关，正如Cao和合著者所描述的那样[36].
考虑到TRPV4的生理作用主要与其渗透钙的能力有关2+
[37]TRPV4在星形胶质细胞中功能表达的任何研究就地必须包括对TRPV4在星形胶质细胞[Ca2+]我发出信号。在对照组星形胶质细胞中，我们记录到自发瞬变[Ca的低频率2+]我而在H/I后1小时和7天，星形胶质细胞的振荡分别增加了7倍和20倍。在生理条件下，类似的低频自发瞬变[Ca2+]我主要由钙释放介导的振荡2+在星形胶质细胞中发现了来自内部存储的就地
[38]在脑缺氧/缺血期间，已知星形胶质细胞损伤可由[Ca的快速增加引起2+]我
[2]，结果与我们的数据一致，表明增强的自发[Ca2+]我缺血星形胶质细胞中的瞬变就地.我们的结果也与以前的数据一致，这些数据显示，自发[Ca2+]我啮齿动物其他缺血性损伤模型中的振荡（综述见[39])，在癫痫患者的人类星形胶质细胞中[40]在拉斯穆森脑炎等病理生理条件下[41]由于脑缺血后星形胶质细胞中有功能性NMDA受体亚型2B的表达体内和缺氧在体外
[42]，我们不能排除自发钙增加的可能性2+脑片中缺血后星形胶质细胞的振荡可能部分是由于花生四烯酸介导的NMDA受体通道电流增强所致，如之前在小脑颗粒细胞中所证明的那样[43]然而，阻断自发钙2+RN1734的振荡证实，这些振荡也部分由TRPV4通道介导。H/I后再灌注的持续时间也改变了[Ca2+]我动力学。在对照组和H/I后1H的星形胶质细胞中，[Ca2+]我观察到短暂的变化，而缺血7天后，我们还检测到持续的钙2+57%的星形胶质细胞在应用4αPDD后进入，而Ca完全阻断2+-游离细胞外液(
); 然而，它对特异性TRPV4抑制剂RN1734不敏感(
)在对照组和H/I后1H，只有3%和15%的星形胶质细胞显示持续钙2+条目。我们假设TRPV4介导的Ca2+进入可能引发额外的Ca2+通过激活其他膜蛋白（如钠钙交换器（NCX））流入[44]这些作者表明，缺氧也会诱导钙2+/纳+通过TRPC1、3、6通道内流，导致NCX逆转，从而导致细胞内Ca升高2+在PC12细胞中。TRPV1-TRPV4是非选择性阳离子通道，对Ca具有中等渗透性2+，具有渗透率(对
钙
/P（P）
纳)介于～6–10之间[45]这种假设得到了数据的支持，这些数据表明NCX的反向模式有助于实验性创伤性脑损伤后的星形胶质细胞和神经元病理[46].NCX介导的钙通量2+在星形胶质细胞中发现正向和反向模式在体外以及那些就地
[47],[48]此外，星形胶质细胞离子性受体或谷氨酸转运体的激活导致细胞内钠的显著升高+，这也将交换器切换到反向模式[47],[49],[50]NCX的逆转也可能由轻度去极化触发[51]由于Kir4.1下调而在反应性星形胶质细胞中发生[23].
问题是：TRPV4在增强[Ca中的作用是什么2+]我缺血后星形胶质细胞中发现的信号。TRPV4在提高钙离子频率中的可能意义2+H/I后星形胶质细胞的振荡是合理的。在以前的研究中，TRP通道在病理生理学[Ca2+]我有人建议神经元数量增加[52]–[55]特别是，TRPM7和热敏TRPV3被证明可以介导缺血后[Ca2+]我最终导致神经元死亡的升高[9]我们的数据表明，增加的自发[Ca2+]我缺氧/缺血后1小时和7天星形胶质细胞的振荡与4αPDD诱导的Ca增加2至3倍平行2+大量涌入。我们发现自发Ca2+H/I对比大量证据证明钙参与星形胶质细胞7D中TRPV4通道的振荡2+星形细胞内钙的细胞内储存释放2+振荡而不是Ca2+通过膜的流入[39].TRPV4是一种多模通道，由不同的细胞内信使激活/调制，包括IP三
[56]，磷酸化[57]内外钙的变化2+浓度、PLC活性和AA代谢物[31]，通过PLA2途径生成。值得注意的是，在天然纤毛上皮细胞中，IP三-TRPV4介导的敏化通过已知的PLA2二级信使环氧乙酸三烯酸积极调节其对渗透胁迫的反应能力[56]已知后一信号通路在缺血后上调，并参与增加[Ca2+]我振荡。有趣的是，在同一研究中，与TRPV4和细胞内Ca的功能偶联2+通过IP存储三信号显示触发振荡[Ca2+]我天然纤毛上皮细胞中的信号[56].TRPV4参与增加自发[Ca2+]我通过观察特异性TRPV4激活物4αPDD增加[Ca2+]我瞬变和促进持续Ca2+H/I后7天进入。
TRPV4上调的另一种解释可能源于TRPV4在不同细胞类型（包括星形胶质细胞）中作为机械感受器或渗透感受器的拟议作用[18],[58]在本研究中，我们发现并非所有海马星形胶质细胞对对照大鼠的TRPV4激动剂都有反应，但缺血后反应细胞的数量显著增加(
,
). 自从我们以前的研究表明星形胶质细胞就地对低渗应激的反应不同，低渗应激是一种模拟缺血后经常观察到的细胞肿胀的状态[59]或氧-葡萄糖剥夺[60]可以设想，在生理条件下，只有更能调节细胞体积的星形胶质细胞亚群表达TRPV4。因此，缺血后TRPV4的上调可能与缺氧/缺血时星形胶质细胞体积控制所需的增加有关，缺氧/缺血是一种以胶质细胞体积稳态受损为特征的病理状态[61]此外，星形胶质细胞通过钙释放各种生物活性物质2+-和可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）依赖性胞吐，其在胶质细胞-神经元信号传导中起主要的星形胶质细胞通路的作用[62]–[64]因此，我们认为反应性星形胶质细胞中TRPV4通道的增加表达/激活也可能导致Ca2+-细胞因子或生长因子的依赖性释放。然而，对缺血后星形胶质细胞胞吐的机制仍知之甚少，利用转基因TRPV4缺陷小鼠进行的进一步研究可能会阐明这种多模传感器在缺血星形胶质细胞中的作用。
我们的研究清楚地表明，TRPV4介导的[Ca2+]我信号转导与H/I后再灌注时间呈正相关。TRPV4通道激活的改变，可能通过钙调素（CaM）结合位点或PLA2激活途径，如前所述[31],[65]，可能会涉及。事实上，这些酶的活性在缺氧时会增加[66]然而，增加的TRPV4电流振幅和[Ca2+]我这些信号与海马CA1区星形胶质细胞中TRPV4的免疫染色增强相平行，因此表明蛋白表达的升高可能至少部分解释了TRPV4介导的[Ca]上调2+]我缺血后观察信号。
尽管我们就地实验显示TRPV4特异性钙2+进入星形胶质细胞，可以认为这些钙2+海马神经元TRPV4的激活可能间接诱发短暂性反应。事实上，众所周知，星形胶质细胞通过细胞内钙的升高对增强的神经元活动作出反应2+
[67]然而，TRPV4介导的电流/Ca2+当神经元丢失达到最大值时，如缺血7天后，进入显著增加，而缺血1小时后，变化不太明显。然而，选择性在体外从手术和缺血大鼠分离的成年原代星形胶质细胞中的星形胶质细胞TRPV4反应特征证实，TRPV4介导的电流和Ca2+进入是星形细胞特异性的，表现出与这些类似的行为就地值得注意的是，我们对星形胶质细胞进行的分析在体外证实4αPDD诱发Ca2+进入是由于TRPV4在星形细胞膜上的直接激活，并显示4αPDD诱发Ca2+H/I后7天进入量也显著增加。最后，我们观察到4αPDD电流增加就地，在用Alexa Fluor hydrazide或LY复染的细胞中，并且我们已经通过免疫组织化学明确鉴定为星形胶质细胞。
我们的电生理数据与之前的TRPV4介导的星形胶质细胞电流的药理学特征一致在体外以及在异源表达系统中进行的关于TRPV4通道对细胞外钙敏感性的研究2+减少和钌红抑制[21]我们的数据也与海马神经元中描述的TRPV4特异性电流的药理学特性相比较[16]在这里，我们还使用了一种新的TRPV4特异性拮抗剂RN1734，它可以阻断4αPDD诱发的电流[32]有趣的是，成人星形胶质细胞的4αPDD诱发电流就地
(
)以及那些在体外
(
)显示出相当线性的电流-电压关系，类似于纹状体神经元和瞬时表达大鼠TRPM2的HEK293细胞[68]; 然而，这些通道在星形胶质细胞中不表达[8]即使对电流轨迹进行点对点数字减法，也显示星形胶质细胞中4αPDD电流的电流-电压关系呈线性或弱整流就地和在体外(图S3).在突变的TRPV4通道中也证明了类似的电流-电压关系[69]TRPV4孔区的两种天冬氨酸均被中和，导致外向整流显著减少。此外，在表达人TRPV4的HEK293细胞中也显示出适度的外向/内向整流[70]人气道上皮CFT1-LCFSN细胞[71]由于成人星形胶质细胞中线性TRPV4电流-电压关系的基础尚不清楚，我们假设翻译后修饰、TRPV4蛋白质构象变化或蛋白质-蛋白质相互作用可能会促成这种电流行为。
一般来说，我们在4αPDD应用期间观察到TRPV4通道活性存在明显的异质性，即使是在假手术动物或H/I后的星形胶质细胞中。前面描述了星形胶质细胞对4αPDD-应用的异质性反应[21]最近，兰西奥蒂和合著者[72]两组在TRPV4介导的钙激活/失活方面表现出显著差异2+记录的星形胶质细胞群体内的进入和反应开始。TRPV4通道活性的这种多样性可能源于细胞外/细胞内Ca的改变2+在星形细胞膜附近，因为这些已被证明能强烈调节TRPV4通道[31],[45]在一些星形胶质细胞中，4αPDD诱发电流显示快速激活和快速失活，据报道在高细胞外钙中发生2+浓度[31]，或电流衰减速率较慢，这可能归因于[Ca2+]我水平。此外，发现TRPV4通道的C端和N端之间的相互作用控制Ca2+-通道的依赖性增强[73]以及不同剪接变异体的存在，其TRPV4蛋白的同质化/异构化或翻译后修饰也可能导致H/I后TRPV4通道激活/脱敏的多样性。到目前为止，还没有公开数据描述大鼠TRPV4剪接变种；然而，人类TRPV4通道中存在5种不同的剪接变体[74]此外，4αPDD可能更有效地作用于脂质环境在体外比就地从而对TRPV4信道进行差分调制。这种脂质调节的激活机制与其他机械门控通道具有生理相关性[75]最后，海马CA1区内星形胶质细胞的异质性可能是观察到TRPV4反应变化的原因。最近出现的一些出版物显示，即使在单个CNS区域内，星形胶质细胞也具有明显的异质性，具有不同的星形胶质细胞偶联或离子通道、谷氨酸转运体或受体的表达[29],[60],[76]此外，缺血后组织中的反应性星形胶质细胞可能不仅来源于增殖的星形胶质细胞[22]也来自多树突细胞[77]这可能进一步加剧了反应性星形胶质细胞群体的异质性。
与我们的Ca一致2+成像数据和电生理分析也证实H/I星形胶质细胞显示TRPV4电流增加.TRPV4电流振幅的这些变化并不显著就地
(图S2).然而，这一结果并不令人惊讶，因为星形胶质细胞中被动电导的表达就地使这些电池中的不同电流很难隔离[23]重要的是，我们发现TRPV4介导的星形胶质细胞电流在体外H/I后7天显著增加；然而，4αPDD诱发的Ca2+H/I后1H，从海马CA1区分离的星形胶质细胞的进入/电流没有增强。我们假设，在再灌注急性期分离的星形细胞在转移到培养基后可以恢复，因此它们对4αPDD的反应与对照组相似。相反，H/I后7D，反应性星形胶质细胞的变化是相当持久的，因此通过培养是不可逆的。
此外，我们发现，随着再灌注时间的延长，星形胶质细胞对4αPDD反应的发生率增加，CA1区单个反应性星形胶质细胞的TRPV4免疫反应性显著增加，与再灌注期间海马CA1区TRPV4阳性星形胶质细胞数量增加密切相关(
,
,
,
). 虽然我们无法检测到TRPV4电流振幅的显著增加就地缺血后细胞内钙2+影像显示Ca2+H/I后1小时和7天，TRPV4通道介导的进入在星形胶质细胞中显著增加。与斑贴灯记录相比，细胞内钙成像分析的细胞数量显著增加就地这可能导致TRPV4介导的Ca2+入口和电流振幅。与细胞内钙相反2+在记录相对完整细胞的测量中，全细胞结构中的斑贴技术显著影响星形细胞的细胞内环境，可能会稀释增强TRPV4活性所需的调节分子。
总的来说，获得的数据在体外验证就地分析，从而确定TRPV4是参与病理生理学[Ca2+]我缺血性星形胶质细胞的信号。然而，星形细胞TRPV4通道在生理或病理生理条件下是如何被激活的仍然不确定。一般来说，星形胶质细胞在离子/神经递质和水的稳态中发挥着重要作用，因此，神经活动导致钾的增加+/星形胶质细胞摄取谷氨酸并导致包裹突触的星形胶质细胞突起肿胀可能是TRPV4激活的初始触发因素，因为这些通道充当机械感受器。此外，星形细胞膜附近细胞外离子浓度的细微变化可能导致TRPV4在生理条件下激活，因为这些通道充当渗透感受器。最近的数据表明星形胶质细胞含有TRPV4/AQP4复合物[18]通过充当渗透压传感器，将渗透压耦合到下游信号级联，构成中枢神经系统容量稳态的关键要素。此外，一些离子通道，如Kir通道（特别是Kir4.1）、AQP4和TRPV4，在星形细胞末端共同表达[78]–[80]指出了与细胞外钾相关的膜微域的膜蛋白相互作用的重要性+缓冲/谷氨酸吸收和水稳态。因此，通过PLA的星形细胞肿胀2激活，AA从膜磷脂中释放出来，随后细胞色素P450环氧合酶依赖的AA代谢产生5′，6′环氧碳三烯酸，可能作为TRPV4通道激活剂。在病理生理条件下，组织损伤和炎症导致释放促炎介质，进而激活细胞内信号通路和下游激酶，如PKC和PKA，从而通过磷酸化增强TRPV4离子通道的激活[57].
总之，我们表明TRPV4通道参与了[Ca的增加2+]我成年大鼠海马星形胶质细胞脑缺氧/缺血后发生的信号转导。TRPV4介导的[Ca2+]我升高至少部分是由于TRPV4蛋白表达增加，并且在缺血损伤后随着时间的推移进一步增加。因为[Ca的变化2+]我星形胶质细胞的动力学与生理和病理生理过程的调节有关（综述见[81],[82])我们的研究确定了一个新的分子靶点，以揭示缺血再灌注后星形胶质细胞的信号转导，并更清楚地定义星形胶质细胞介导的急性脑疾病的发病过程。
