核酸研究。2012年7月；40(12): 5569–5576.
CRISPR适应过程所必需的蛋白质和DNA元素大肠杆菌
以色列特拉维夫市特拉维夫大学萨克勒医学院临床微生物学和免疫学系
2011年12月25日收到；2012年2月17日修订；2012年2月18日验收。
- 补充资料
补充数据
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摘要
簇状规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR/Cas）构成了最近发现的原核防御入侵核酸的机制。CRISPR/Cas系统的活性包括三个步骤：（i）将外源DNA序列插入CRISPR阵列，以防止未来的攻击，这一过程称为“适应”，（ii）相关蛋白质的表达，以及阵列的表达和处理，然后（iii）RNA介导的对外来核酸的干扰。这里我们描述了一种稳健的分析大肠杆菌探索迄今为止研究最少的过程，适应。我们在先导序列和阵列中确定了适应步骤所必需的基本基因和DNA元素。通过显示第一个重复作为新插入重复的模板，我们还提供了有关插入重复间隔单元的机制性见解。总之，我们的结果阐明了CRISPR/Cas系统适应过程中的基本步骤。
简介
簇状规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白构成了一个重要的原核防御系统，可抵抗病毒和水平转移的核酸(1–4). 该防御系统由一个CRISPR阵列组成，该阵列通常前面有一个引导序列，并且位于与CRISRP相关联的集群附近(中国科学院)基因(5–7). 从CRISPR阵列转录的RNA由Cas蛋白处理，并将干扰蛋白引导至与重复序列匹配的核酸。这些被称为间隔区的序列通常来源于质粒和噬菌体，因此系统适应性地靶向这些入侵者。
CRISPR系统的适应过程，即在基因组中获取新的间隔物，目前尚不清楚。巴兰古等是第一个向CRISPR阵列报告间隔棒收购的公司嗜热链球菌(2). 他们表明，在噬菌体挑战中幸存下来的细菌使用与来自挑战性噬菌体的小DNA区域相同的间隔物（称为原间隔物）扩展了其CRISPR阵列。太空船的捕获似乎朝着阵列的前端极化。他们的研究没有发现来自特定链的取样原间隔物的偏差，也没有发现对噬菌体DNA中特定区域的偏好。敲出csn2型[之前已注释案例7(8)]显著减少了间隔棒的获取，间接证明了csn2型对于CRISPR阵列的适配至关重要嗜热链球菌后来，范德普洛格（van der Ploeg）描述了体内间隔棒采集变形链球菌他观察到约25%的噬菌体抗性突变体获得了新的间隔物。在这种情况下，获得的间隔物也对应于噬菌体基因组中随机分布的原间隔物链或位置(9). 这些研究没有涉及重复序列、先导和核心Cas蛋白在获得过程中的作用。
假设核心Cas蛋白Cas1和Cas2在获得过程中起主要作用。这一假设基于这样一个事实，即这两种蛋白质在干扰阶段没有作用，但它们在大多数CRISPR基因座中是保守的(2,三,10). Cas1和Cas2参与获取步骤，这两种蛋白质都显示核酸内切酶活性。第1种情况，共种情况铜绿假单胞菌和，共大肠杆菌被证明是一种金属依赖性DNA内切酶(11,12)，和的Cas2硫矿硫化叶菌其他菌株被证明是ssRNA特异性内切酶(13). 然而，尚未提供Cas1和Cas2参与适应过程的直接证据。
DNA序列分析表明，在原间隔区附近发现的短的2–5 bp序列，称为原间隔区邻接基序（PAM），对干扰步骤至关重要(14,15). 干扰阶段对PAM的要求表明，获取新间隔物需要具有PAM的DNA序列。事实上，证明了赋予噬菌体抗性的间隔物与具有PAM的原间隔物的序列相同(2,14). 此外，一些逃避CRISPR/Cas干扰的噬菌体突变体在PAM中含有突变，表明PAM在干扰和适应步骤中都起作用(14).
关于适应过程的见解还来自生物信息学分析。这些分析基于邻近原间隔区的序列保守性确定了六种不同CRISPR类型的PAM序列(15,16)[最新分类系统(8)括号内]：1、2（I-E）、3（I-C）、4（I-F）、7和10（II）。例如，研究确定CRISPR-2型（I-E）大肠杆菌阵列I和II属于，包含序列为5′-AWG的PAM。CRISPR阵列的序列分析也表明，先导序列可能有助于获得新的间隔物，但这些分析没有提供直接的实验证据。
部分由于缺乏研究适应性的强大实验系统，几个主要问题尚未在实验中得到解决：间隔物是如何并入基因组的？哪些蛋白质对这一过程至关重要？领导或重复序列对这个过程重要吗？领导者序列中需要哪些元素？我们描述了一种用于研究适应过程的稳健分析大肠杆菌并提供关于重复间隔单元的基本蛋白质、DNA元素和插入机制的见解。
材料和方法
试剂、菌株和质粒
LB培养基（10 g/l胰蛋白胨、5 g/l酵母提取物和5 g/l NaCl）来自Acumedia，琼脂来自Difco，抗生素、异丙基-β-d日-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）和我-阿拉伯糖来自Sigma-Aldrich。限制性酶来自新英格兰生物实验室。快速结扎试剂盒由罗氏公司提供。本研究中使用的细菌菌株、质粒和寡核苷酸列于补充表S1.
间隔棒采集分析
大肠杆菌将携带pCas1+2质粒的BL21-AI或IYB5101在37°C下在含有或不含0.2%链霉素的50µg/ml链霉素的LB培养基中充气我-阿拉伯糖+0.1 mM IPTG 10至16小时；将培养物稀释至1:300，再培养10–16小时，并重复该程序共三次。将培养物样本用作PCR扩增CRISPR阵列I的模板，分别使用非操作BL21-AI和IYB5101的引物RE10R/MG7F或260 F/IY13R(补充表S1). 对于中的实验,B、 以及，引物WIS75188/RE10R用于检测阵列扩展，RE10R/MG7F除外A、 除了RE10R/MG7F外，还使用了引物WIS75188/MG7F。
最小重复序列对间隔棒采集至关重要。基因工程CRISPR阵列I结构的示意图大肠杆菌BL21-AI。重复标记为菱形，间隔标记为矩形。用于构建不同菌株的卡那霉素抗性盒标记为灰色V字形。父母：非操纵大肠杆菌BL21-AI；2-重复：两个重复之间的一个间隔，其他重复被移除。1次重复：只有一次重复，没有间隔，其他重复被删除。0-rep：用卡那霉素抗性盒替换整个阵列。kan盒上的平行线表明只描述了部分基因。凝胶显示从所示培养物中扩增出的PCR产物大肠杆菌BL21-AI携带质粒pCas1+2，在有或无诱导物（0.2%）的情况下生长我-阿拉伯糖和0.1 mM IPTG），10–16小时，三个循环。凝胶是产生类似结果的两个实验的代表。
先导序列中的区域对间隔采集至关重要。(A类)基因工程CRISPR阵列I结构的示意图大肠杆菌BL21-AI。重复标记为菱形，间隔标记为矩形。Parental：非操作数组；LN:N–第一个完整重复上游nt的数量。kan盒上的平行线表明只描述了部分基因。凝胶显示从所示培养物中扩增出的PCR产物大肠杆菌BL21-AI携带质粒pCas1+2，在有或无诱导物（0.2%）的情况下生长我-阿拉伯糖和0.1 mM IPTG），10–16小时，三个循环。(B类)上述结构示意图。Scram40:40 nt上游的第一个重复加扰，其他核苷酸未被操纵；Scram20:第一个重复序列上游20 nt被置乱，其他核苷酸未被操纵。凝胶显示从所示培养物中扩增出的PCR产物大肠杆菌BL21-AI携带质粒pCas1+2，在有或无诱导物（0.2%）的情况下生长我-阿拉伯糖和0.1 mM IPTG），10–16小时，三个循环。凝胶是产生类似结果的两个实验的代表。
新插入重复序列的DNA模板的测定。的CRISPR I中的亲本和扩展阵列的示意图大肠杆菌BL21-AI。根据核苷酸“标签”，重复标记为黑色或灰色菱形，父间隔符为空白矩形，而新插入的间隔符为灰色矩形，标记为“新”。R*-S-R：第一次重复BL21-AI共识，第二次重复K-12共识；R-S-R*：第一次重复K-12共识，第二次重复BL21-AI共识。指示的培养基大肠杆菌BL21-AI携带质粒pCas1+2，在有或无诱导物（0.2%）的情况下生长我-阿拉伯糖和0.1 mM IPTG）连续10–16小时三个周期，以分离单个菌落。从每个培养物中分离出的五个菌落显示在PCR中插入间隔物，并对其进行DNA测序。如图所示，每种菌株的五分之五的菌落含有标记重复序列。
结果和讨论
采集分析的建立
为了研究适应过程，我们开发了一种检测新间隔物插入CRISPR阵列I的方法大肠杆菌。我们使用的菌株来源于大肠杆菌B（BL21-AI）或K-12（IYB5101），缺乏或编码内源性中国科学院基因，分别(A） ●●●●。这两个菌株都编码T7 RNA聚合酶我-阿拉伯糖诱导的启动子。我们将质粒pCas1、pCas2或pCas1+2引入这些菌株，分别在T7-lac启动子下编码K-12衍生的Cas1、Cas2或两者。由于Cas1和Cas2在几乎所有的CRISPR/Cas系统中都存在，因此对其进行了测试，并且假设由于这些蛋白质在表达和干扰步骤中不需要，因此它们可能在适应步骤中发挥作用(2,三,10). 诱导表达大肠杆菌Cas1和Cas2导致间隔物的获得，这是通过对两个菌株的CRISPR阵列I中与先导末端相邻的重复间隔单元进行PCR扩增确定的(B） ●●●●。每个重复间隔单元的大小为61 bp，因此，从培养物阵列I中诱导的Cas1和Cas2表达的PCR扩增显示出一条带，代表大约此大小的增加(B） ●●●●。通过比较亲本大小带与较高MW带（用新插入的间隔物扩展）的强度，在10–16小时的分析过程中检测到显著水平的捕获。过度表达Cas1和Cas2的细菌的持续生长导致更高的MW带，这表明在Cas1和Cas2过度表达的条件下，CRISPR阵列中甚至可以添加一个以上的间隔物(B） ●●●●。该试验可以检测到小于1%的总细菌悬液中发生的采集事件，这是通过滴定试验确定的，在滴定试验中，用具有亲本阵列的细胞连续稀释已知数量的具有扩增阵列的细胞，并进行PCR分析(补充图S1). 携带单独编码Cas1或Cas2的质粒的菌株（分别为pCas1和pCas2）的阵列没有明显扩张(B） ●●●●。此外，当pCas1+2突变为编码Cas1时，未检测到阵列扩展D221A型，Cas1中报告有残留物铜绿假单胞菌和中大肠杆菌在不损失蛋白质稳定性的情况下消除蛋白质的DNase活性(11,12) (补充图S2A). 携带pCas1或pCas1的菌株D221A型+2或pCas2质粒显示Cas1、Cas1的表达水平D221A型或Cas2类似或高于在含有pCas1+2的菌株中检测到的它们的表达水平，在这种菌株中确实发生了适应性，这表明这些菌株缺乏适应性并不是由于这些蛋白的表达水平较低(补充图S2B). 这些结果表明，Cas1和Cas2对适应过程至关重要，Cas1的DNA酶活性对获得活动至关重要。BL21-AI缺乏适应能力案例ABCDE基因(三,17)以及在这些基因被H-NS沉默的K-12菌株中(18–20)，表明这些基因对于适应步骤是不可或缺的。他们还表明，尽管IYB5101和BL21-AI的CRISPR阵列I的一致重复序列在位置2处存在1nt差异(A） ，Cas1和Cas2可以有效地处理这两个重复。有趣的是，IYB5101包含一个额外的CRISPR阵列，即阵列II，其重复序列和先导序列与BL21-AI中发现的相同。根据Cas1和Cas2有效处理BL21-AL阵列的观察结果，我们观察到IYB5101阵列II的显著扩展，正如预期的那样。另一方面，BL21-AI中的CRISPR阵列II在重复序列上游没有保守的先导序列，因此没有获得新的间隔序列(补充图S3).
获得的垫片分析
PCR扩增CRISPR阵列时检测到较高的MW带，表明在阵列中插入了新的间隔物。然而，这种观察还存在其他可能性。例如，重新排列阵列中的间隔符可以显示这些扩展模式。为了证明扩展阵列中含有新获得的间隔物，并进一步了解其性质，我们对具有扩展阵列的受检菌株进行了DNA测序。我们用两种方法分离DNA进行测序。第一种方法是将经过适配的细菌培养物中的PCR-扩增DNA连接到质粒载体中，然后对DNA插入物进行转化和测序。另一种方法是在琼脂平板上对培养物进行划线，以分离单个克隆，然后对单个克隆的DNA进行测序，以显示CRISPR阵列的扩增（参见补充方法). 两种方法都获得了总共94个新间隔区的DNA序列。新间隔物的来源来自pCas1+2，也来自基因组DNA，这是一个预期的观察结果，因为这些是培养物中唯一的DNA来源。A显示了质粒DNA上的原间隔区位置和方向，而补充表S3提供了所有已排序垫片的详细列表。由于未知原因，来自质粒DNA的序列在新的间隔区中高度过度表达。质粒衍生间隔物与基因组衍生间隔物的预期比率为～1:100，因为质粒平均每个细胞有10个拷贝(21)其长度为4711 bp（总长度为～4.5×104 bp）与约4.5×10的基因组长度相比6 bp。然而，BL2-AI和IYB5101的质粒衍生间隔区的观察分数分别为42/57和24/37，比预期高出约200倍。这一结果表明，一种积极的机制选择性地从染色体外DNA中获取间隔物，或者从基因组中获取间隔物质会杀死细菌，从而减少基因组间隔物的显著出现。新获得的基因组间隔物不能在BL21-AI和IYB5101中使用CRISPR/Cas系统杀死细菌，因为前者中没有中国科学院基因，而在后者中hns公司在基因组中沉默系统的活动(18–20). 在插入单个垫片的所有情况下，它都位于引线旁边的第一个位置。在少数情况下，我们观察到最多有三个间隔棒膨胀，这些间隔棒在所有情况下都位于与导杆相邻的第一、第二和第三个位置，如在其他系统中观察到的那样(2). 大多数间隔物的长度为32–33 bp，与CRISPR阵列中可观察到的间隔物长度一致，只有一个49 bp的间隔物（克隆17，补充表S3). 根据报道的基序，观察到的PAM为AWG(16)根据Weblogo分析(22) (B） ●●●●。然而，PAM的前两个碱基AW的保守性明显低于第三个碱基G。对原间隔区和10 nt侧翼的基序分析表明，在其他位置没有明显的对话。我们无法确定从任何DNA链中获取间隔物的偏差(A、，补充表S3)表明在试验条件下，钢绞线的选择是随机的。pCas1+2过表达10小时后获得新间隔区的克隆数量分别为121/207和105/278大肠杆菌分别为BL21-AI和IYB5101。观察到的高捕获率证实了扩增带与PCR分析中的亲本带相比的强度B.这种稳健的分析使我们能够研究采集机制的几个方面，如下所述。
原间隔区在质粒DNA上的位置和方向以及原间隔区邻接基序（PAM）的分析。(A类)与测序间隔物匹配的原间隔物根据其位置和方向（蓝色箭头指向顺时针，红色箭头指向逆时针）标记在pCas1+2质粒图谱上。原间隔物根据间隔物测序的克隆进行编号，如表S3。序列数组中的分隔符位置与克隆号之间用句点隔开（如果适用）。(B类)Web徽标(22)用于分析32 bp长的序列间隔物中的PAM。原间隔体的第一个nt位于位置0。原间隔区以灰色突出显示。显示了原间隔棒的Weblogo以及原间隔棒上游和下游的10nt。相对字母大小表示该位置的基频。
重复中对获取至关重要的元素
我们想定义对采集至关重要的最小重复次数。因此，我们删除了大多数重复项，将其中的0、1或2保留在数组中(). 使用上述分析测试构建菌株获取新间隔物的能力。结果表明，间隔棒采集过程需要至少重复一次(). 此外，适应具有一个或两个重复序列的阵列的效率与亲本阵列相似。这些结果表明，重复序列中的特定DNA序列对适应至关重要（可能是采集机器识别的基序），但重复本身并不需要。引人注目的是，如凝胶所示，插入到单重复序列（1-rep）中的重复间隔单元的大小为～61 bp（插入重复间隔单元大小），尽管该序列中没有间隔。这表明，确定间隔区长度的机制并不依赖于阵列中先前的间隔区重复单元，这表明蛋白质机制中的固有机制决定了间隔区的大小。间隔区获得的逆过程——间隔区缺失可能通过DNA聚合酶在复制过程中的重组或滑移发生，并且需要至少两次重复(10,23). 如果间隔子的缺失是通过重复序列的重组发生的，那么从理论上讲，一个缺失事件可能导致阵列中只剩下一个重复序列。适应不需要多次重复，这一事实解释了即使所有的CRISPR间隔物都被这样的事件删除，CRISRP阵列仍可能扩展，因此，这一观察具有生理意义。
领队序列中对采集至关重要的元素
先导序列可以促进CRISPR阵列的转录(18)并被假定为指导新获得的间隔棒的方向(2). 我们想测试领头序列是否确实对适应过程至关重要，并确定领头体内获取新间隔物所需的基本DNA元素。的前导序列大肠杆菌BL21-AI和K-12在第一个重复序列的～90 nt上游具有广泛的相似性，因此我们假设在这些序列中发现了间隔区捕获的关键区域(A） ●●●●。因此，我们在这90 nt中以较短的间隔系统地删除了先导序列的DNA片段，在前100 nt上游以50 nt的较大间隔删除。最初，第一重复序列上游20、40、60、80、100和150 nt的片段在大肠杆菌BL21-AI，在这些位置的正上游插入卡那霉素抗性盒(A） ●●●●。然后，我们使用我们开发的分析方法分析采集能力。对BL21-AI衍生序列进行的采集分析结果表明，在测试间隔内，60 bp是采集所需的最小长度：40和20 bp的先导序列显示根本没有采集(A） ●●●●。值得注意的是，（-10）-TATA框的缺失[第一次重复上游的位置（-61）-（-66）(A中(18)]转录阵列所需的，并没有降低获取效率，这表明转录对于适应过程可能不是必需的。
为了确定第一个重复序列上游60-bp片段内的元素是否是必需的，我们用打乱的原始DNA序列替换了与重复序列相邻的先导序列3′端的40和20 bp。这产生了一个与父级长度相似但顺序不同的引线(B） ●●●●。出于技术原因，我们在包含单个重复的CRISPR数组中构造了这些，该数组与完整数组一样具有功能(). 在这种情况下，即使测试了20 bp的替代物，也没有观察到采集。这表明，第一重复序列上游20 bp片段中至少有一些元素对获得至关重要，仅存在长度相似的类似核苷酸不足以获得。考虑到该区域BL21-AI和K-12先导序列之间的高序列保守性（～65%），预计会出现该结果(A） ●●●●。
重复序列的插入模式
为了进一步阐明重复序列的插入模式，我们利用了功能重复序列存在两种变体的事实，一种是从序列5′-GAG开始的（例如重复序列1和大多数重复序列大肠杆菌BL21-AI），和一个以5′-GTG开始的（例如大肠杆菌BL21-AI和中的大多数重复大肠杆菌K-12）(A） ●●●●。这些变体被用作双重复序列的遗传标签(). 标记重复序列使我们能够确定哪个重复序列用作复制新插入重复序列的模板，以及模板的序列或其在数组中的位置是否影响结果。从这些实验中可以推断出的另一个见解是新的重复序列是否被合成德诺沃或者可能是从阵列以外的基因源合成的。如果重复总是从阵列中的单个位置复制，则当位置切换时，新重复的标签应更改。在标记两个可能位置的两个重复序列后，我们对每个菌株的五个随机选择的菌落进行测序，显示PCR扩增中插入了一个重复间隔单元。对所有10个菌落进行测序表明，无论阵列中第三个重复序列的标签是什么，与扩展阵列中领头序列相邻的第一个重复序列和第二个重复序列总是带有相同的标签(). 这表明新的重复总是从重复#1（从引线端开始）复制而不是生成“德诺沃“或来自另一个遗传库（例如重复序列#2或CRISPR阵列II的重复序列）。
总的来说，我们的分析为研究适应过程提供了一个强有力的工具；使用此工具，我们定义了流程的最低要求。我们提供了以下方面的第一个直接证据：Cas1和Cas2对于CRISPR阵列的有效适应都是必不可少的，领导者在间隔物获取中起着直接作用，并且一次重复就足以获取间隔物。此外，我们还演示了插入的重复总是从最靠近前导的数组中的第一个重复中复制的。我们相信，这些见解将极大地促进对大肠杆菌因此也存在于其他原核生物中。
补充数据
补充数据参见NAR Online：补充方法、补充表1-3、补充图1-3、质粒pCas1+2的DNA序列和补充参考文献[18,23-26]。
基金
开放获取费用资助：以色列科学基金会(611/10); 两国科学基金会(2009218); 以及玛丽·居里国际重返社会补助金(皮尔加-2009-256340).
利益冲突声明。未声明。
鸣谢
我们感谢尼尔·奥舍洛夫对手稿的批判性阅读，感谢卡米尔·沃因斯坦对专业语言的编辑。
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