Bcl-2、Bcl-x_L（左）和Bcl-w在淋巴和白血病细胞中不是ABT-737和navitoclax（ABT-263）的等效靶点

微阵列和预测模型

集成电路₅₀数值为3个独立实验的平均值；使用XLFit通过4参数拟合生成曲线。通过微阵列评估了10个Bcl-2家族成员的mRNA表达水平，并与39个非霍奇金淋巴瘤（NHL）细胞对ABT-263的耐药性相关。每个基因的相关系数用线性预测因子ABT-263 Dx表示，正号表示抗性标记，负号表示敏感标记。每个基因的系数大小与其在预测因子中的重要性相关。线性预测因子由惩罚拉索回归（glmnet R包中的cv.glmnet函数）生成，基于5倍交叉验证，使用Bcl2家族成员的标准化表达强度（Z分数）。ABT-263 Dx可以指定为：ABT-263Dx=-0.07+0.27 Z_Mcl-1型-0.6 Z_Bcl-2型-0.14 Z_诺克斯-0.05Z_生物燃料.

公共可用的DLBCL患者数据集从GEO数据库下载({“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE10846”，“term_id”：“10846”}}GSE10846标准，HGU133plus2）。然后将线性回归预测因子应用于Z评分标准化患者微阵列数据，以预测每个患者的ABT-263-Dx评分。使用Kaplan-Meier曲线进行生存分析，该曲线根据ABT-263-Dx评分和Cox比例风险绘制了3个均匀划分的患者组，Cox比例危险将Dx评分作为连续变量进行拟合（生存率，R包）。

两个微阵列数据集均使用稳健多阵列平均值进行标准化。

细胞系、FACS分析和细胞存活分析

表达小鼠Bcl-2或Bcl-x的小鼠DO11.10 T杂交瘤细胞_L（左）亚克隆到哺乳动物表达载体pEF-FLAG PGK-puro²⁵在含有10%FCS的DMEM中培养。Mcl-1型^{飞行/飞行}/E类μ-Myc公司从2个独立的肿瘤中分离淋巴瘤细胞，并在含有20%FCS，2mM的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）中培养我-谷氨酰胺，100 ng/mL鼠干细胞因子，10 ng/mL IL-3（Peprotech）。用基于pMSCV-IRES绿色荧光蛋白（GFP）的表达载体转导这些细胞，⁷用4-OHT处理3天，然后用二甲基亚砜（DMSO；0.1%）或ABT-737（雅培）再处理24小时。对于初级淋巴细胞亚群，从胸腺、脾脏或骨髓（BM）制备单细胞悬浮液，并用分级浓度的ABT-737、ABT-263、足叶乙甙或地塞米松培养。通过流式细胞术对不含碘化丙啶（PI）染色的细胞进行定量分析，5μg/mL。结果归一化为未经处理24小时的细胞的活性。用与异硫氰酸荧光素、R-藻红蛋白（R-PE）、别藻蓝蛋白偶联的单克隆抗体进行免疫荧光染色，然后进行流式细胞术分析，确定白细胞亚群：RA3-6B2（抗B220）、11-26C（抗IgD）、333.12或5.1（抗Ig M）、YTS169（抗CD8）、H129或YTA321（抗CD4）。

造血重建

来自野生型（WT）或比姆^−/−收获胚胎，培养24小时（在含有100ng/mL干细胞因子、10ng/mL IL-6、10ng/mL Flt-3L和50ng/mL血小板生成素的培养基中），并用编码Bcl-x的逆转录病毒感染_L（左）pMSCV-IRES-GFP载体中的Bcl-2、Mcl-1（人类）或Bcl-w（小鼠）。将逆转录病毒转导的细胞注射到致死性辐射（2×550 rads）受体小鼠体内，8周后对重组小鼠的造血系统进行分析。

免疫沉淀和蛋白质印迹

如前所述进行协同免疫沉淀²¹并使用Bim的鼠单克隆抗体（3C5，Enzo Biosystems）或仓鼠单克隆抗人Bcl-2（3F11）。抗FLAG（克隆9H1）、抗Bim（14A8或3C5；Alexis）、抗Bcl-2（BD Pharmingen）、抗Bcl-x_L（左）Western blotting采用BD Bioscience）、抗-Mcl-1（Rockland）、反-Bcl-w（Stressgen）或抗肌动蛋白（Sigma-Aldrich）抗体。

亲和力测量

重组小鼠Bim、小鼠NoxaA、Bim的亲和力^诺克斯如前所述，使用Biacore 3000仪器通过溶液竞争分析测定小鼠Bcl-2或小鼠Mcl-1的人类Noxa。²⁶肽购自Mimotopes Pty。肽序列为：mBim DLRPEIRIAQELRRIGDEFNETYTRR；比姆^诺克斯DAELPPEFAAQLRKIGDKVYCTWTRR公司；mNoxaA RAELPPEFAAQLRKIGDKVYCTWSAP公司；hNoxa PAELEVECATQLRRFGDKLNFRQKLL公司。

细胞蛋白质再分布测定

生成编码荧光标记蛋白的基因，并将其克隆到pFIT载体中，如前所述，生成稳定的T-REx 293细胞系中的Flp-In。²⁷如前所述进行细胞培养、成像和蛋白质再分配。²⁸

高Bcl-2水平也使正常细胞对ABT-263和ABT-737敏感

As高架BCL-2型淋巴瘤细胞中ABT-263敏感性的表达(图1)，我们研究了增加的Bcl-2是否也会使其非转化对应物敏化。我们专注于vavP–Bcl-2转基因小鼠，在所有有核造血细胞中过度表达人类BCL-2。¹⁸正如预期，¹⁸Bcl-2过度表达vavP–Bcl-2对地塞米松等淋巴毒剂高度耐药的淋巴细胞(图2A） 和依托泊苷(图2B） ●●●●。

在单独的窗口中打开

图2

Bcl-2高表达可保护淋巴细胞对抗地塞米松或足叶乙甙，但对ABT-737/263敏感。BM过渡性B细胞重量和vavP–Bcl-2将转基因小鼠在（A）地塞米松、（B）足叶乙甙、（C）ABT-737或ABT-263存在下按指定剂量分离培养24小时。（D） BM过渡性B细胞vavP–Mcl-1小鼠对ABT-737具有耐药性。显示了过渡性B细胞（每个基因型3只小鼠）的存活数据，这些数据是3个独立实验的结果，每个实验均进行了三次。面板C和D中描述的实验同时进行。数值代表平均值±SEM。

与之形成鲜明对比的是，从胸腺或骨髓中分离出的多个淋巴亚群vavP–Bcl-2转基因小鼠对ABT-263或ABT-737的敏感性明显更高，而不是更低(图2C） ●●●●。这对于通常对这些BH3模拟物具有耐药性的淋巴样人群来说最为明显，例如BM过渡性B细胞（IgM^你好免疫球蛋白D^医学博士)或未成熟B细胞（IgM^你好免疫球蛋白D^洛). 这种致敏不是前生存蛋白过度表达的一般结果，因为从vavP–Mcl-1转基因小鼠¹⁹对ABT-737高度耐药(图2D） ●●●●。ABT-737治疗后，Bcl-2、Bim、Mcl-1或Bcl-x的表达没有明显变化_L（左）在分析的细胞中（补充图1）。

Bim的缺失，或Bax和Bak的联合缺失，使淋巴细胞对ABT-737产生耐药性

我们接下来研究了当比姆、诺克萨、彪马，或生物燃料被删除，因为相应的BH3-only蛋白是淋巴细胞凋亡的关键调节器。²²Noxa、Puma或Bmf的缺失对ABT-737的敏感性影响最小，而Bim的缺失使所有淋巴亚群对ABT-73高度耐药(图3A；实际值见补充表A）。为了确定Bim对ABT-737诱导的Bcl-2过度表达细胞的细胞死亡是否也至关重要，我们用对照或表达Bcl-2的逆转录病毒载体转导了不同基因型的胎肝细胞，并用受感染细胞重建了致命照射小鼠的造血系统。引人注目的是，Bim的缺失，而非Noxa或Puma的缺失，完全抵消了Bcl-2过度表达对ABT-737增强的敏感性(图3B） ●●●●。

在单独的窗口中打开

图3

Bim在对ABT-737的反应中起着重要作用。（A） 胸腺细胞和骨髓源性B细胞重量,比姆^−/−,诺克斯^−/−,彪马^−/−,生物燃料^−/−,Bax公司^−/−,贝克^−/−，或Bax公司^−/−贝克^−/−小鼠在没有或存在增加剂量的ABT-737的情况下培养，24小时后测定其生存能力。欧盟委员会₅₀值表示为热图。蓝色代表灵敏度，红色代表电阻。（B） 致命辐射小鼠的造血系统用重量,比姆^−/−,诺克斯^−/−,彪马^−/−，或Bax公司^−/−贝克^−/−用空载体或编码Bcl-2的载体逆转录胎肝细胞。重建八周后，在培养基中分析产生的细胞对几剂ABT-737治疗的反应活性，如图2; n=每组3只小鼠，3个独立实验（除Bax公司^−/−贝克^−/−n=1，因为很难获得活的动物）。数值代表EC的平均值₅₀±SEM，详见补充表2。

正如预期，⁷Bax和Bak的联合损失使所有细胞对ABT-737完全耐药(图3A） 即使Bcl-2水平很高(图3B） ●●●●。然而，值得注意的是，Bax或Bak的损失仅对某些细胞类型的影响最小。

Bcl-2过度表达导致Bim积聚

这些研究证明了Bim在ABT-737诱导的细胞凋亡中的关键作用。因为比姆mRNA表达不能预测对ABT-263的敏感性(图1)接下来，我们检测了14个被归类为敏感（IC）的NHL细胞系中Bim蛋白的表达₅₀<1μM）或电阻（IC₅₀≥5μM）至ABT-263。值得注意的是，所有ABT-263敏感细胞系的Bim和Bcl-2水平均高于耐药细胞系(图4A） ，与之前的观察结果一致。¹⁵Bim蛋白水平在vavP–Bcl-2淋巴细胞比野生型淋巴细胞多(图4B） ●●●●。此外，Bim的半衰期在vavP–Bcl-2与WT电池进行比较（补充图2A）。这些观察结果表明，与Bcl-2结合可以防止Bim降解。

在单独的窗口中打开

图4

致敏性vav-Bcl-2型ABT-737的淋巴细胞需要Bim与Mcl-1结合。（A） 高水平或低水平非霍奇金淋巴瘤细胞系的Western blot分析Bcl-2型RNA微阵列分析(图1). 那些表达较高水平Bcl-2蛋白的人对ABT-263敏感，并且表达较高水平的Bim。（B） Bcl-2和Bim在vavP–Bcl-2/Bim^+/+,vavP–Bcl-2/Bim^提单,vavP–Bcl-2/Bim^无、和vavP–Bcl-2/Bim^市盈率免疫印迹法检测胸腺细胞。（C） 制备胸腺细胞裂解物，并通过免疫沉淀和蛋白质印迹分析蛋白复合物。（D） 使用Biacore光学生物传感器通过溶液竞争法测定Bim和Noxa BH3肽对小鼠Bcl-2和小鼠Mcl-1的亲和力。括号中的数字表示n=2到4个实验的标准偏差。（E） 测量了所示基因型的BM衍生的B细胞和胸腺细胞对ABT-737的敏感性，数据用热图表示，如图2结果表示每个基因型至少3个独立实验的平均值（详见补充表1）。限制Bim与Bad的结合特异性，使所有细胞类型都对ABT-737产生耐药性，而不管Bcl-2是否过度表达。作为对照，Bim的BH3突变不影响vavP-Mcl-1阀–ABT-737转基因细胞–诱导细胞死亡(vavP–Mcl-1/Bim^提单和vavP–Mcl-1/Bim^不适用). （F） 胸腺细胞来自vavP–Bcl-2/Bim^+/+在Bim免疫沉淀之前，用ABT-737（1μM）处理小鼠5小时。蛋白质复合物的组成通过Western blotting分析。

为了进一步测试，我们穿越了vavP–Bcl-2使用Bim-BH3“敲除”小鼠的小鼠(比姆^提单,比姆^无，或比姆^市盈率)表达突变的Bim蛋白，其天然BH3结构域被小鼠Bad、小鼠NoxaA或小鼠Puma（Bim^坏，比姆^诺克斯和Bim^彪马)并展示其结合特性。²¹与Bcl-2结合是驱动Bim在表达vavP–Bcl-2转基因，Bim^坏和Bim^彪马和WT Bim一样高(图4B） ●●●●。比姆^诺克斯水平升高到较低的程度，反映了天然NoxaA对Bcl-2的亲和力较低。³⁵Bcl-2与WT Bim、Bim的强关联^坏和Bim^彪马经联合免疫沉淀证实(图4C） ●●●●。值得注意的是，Bim的弱亲和力^诺克斯用于Bcl-2(图4D） ，在比姆^无淋巴细胞(图4B） ，足以累积Bcl-2/Bim^诺克斯Bcl-2高表达时的复合物。相比之下，WT Bim和Bim^诺克斯在vavP–Mcl-1转基因细胞（补充图2B），而Bim的水平^坏，不绑定Mcl-1，²¹与对照小鼠的细胞相当。综上所述，这些结果表明，与原生物蛋白形成复合物显著延长了Bim的半衰期。

ABT-737诱导的细胞死亡需要Bim抑制内源性Mcl-1

为了阐明Bim如何在ABT-737处理的Bcl-2过度表达细胞中触发凋亡，我们研究了来自vavP–Bcl-2-/Bim^提单,vavP–Bcl-2/Bim^无、和vavP–Bcl-2/Bim^市盈率老鼠。引人注目的是，比姆^提单无论Bcl-2的表达如何，细胞对ABT-737都有很强的抵抗力(图4E、 补充表1）。相反，vavP–Bcl-2/Bim^无和vavP–Bcl-2/Bim^市盈率淋巴细胞对ABT-737的敏感性与vavP–Bcl-2/Bim^+/+细胞。这种巨大的差异可以用以下事实来解释：^诺克斯和Bim^彪马可以绑定Mcl-1，但Bim^坏不能。值得注意的是，在ABT-737治疗后，结合Bim或Bim突变体的Bcl-2水平持续下降，而与Bim或其突变体复合的Mcl-1水平增加，但Bim中预期的情况除外^坏-表达细胞(图4F） ●●●●。

为了证实ABT-737治疗后蛋白质-蛋白质结合的变化是由于蛋白质从预先存在的复合物中置换而不是新合成的蛋白质结合所致，我们在放线菌酮存在下治疗5小时后进行了Bim免疫沉淀。即使没有蛋白质合成，ABT-737治疗也减少了Bim与Bcl-2的结合，并增强了与Mcl-1的结合（补充图2C）。然而，这并不排除当Bcl-2被ABT-737占据时，新合成的Bim和Mcl-1优先相互作用的可能性。

总的来说，这些发现表明，为了使ABT-737触发对Bcl-2过度表达的淋巴细胞的杀伤，Bim必须能够中和非ABT-737.直接靶向的Mcl-1。

Bcl-x的过度表达_L（左）与Bcl-2不同，或Bcl-w对ABT-737不敏感

因为ABT-737结合纯化的重组Bcl-2和Bcl-x_L（左）具有相似亲和力的蛋白质，^6,7令人惊讶的是BCL-XL型表达与NHL细胞对ABT-263的敏感性无关(图1). 为了进一步研究这一点，我们用感染了编码FLAG-标记的Bcl-2，Bcl-x的逆转录病毒的WT胎肝细胞重建了致命照射小鼠的造血系统_L（左）、Bcl-w或Mcl-1。我们证实，所有4种蛋白质在功能上均过度表达，明显防止了足叶乙甙和地塞米松的侵害（补充图3A）。

在上述实验中(图2)，Bcl-2的过度表达使细胞对ABT-737治疗敏感，而Mcl-1的过度表达则使细胞产生耐药性(图5A-B）。与Bcl-2过量的影响形成惊人对比的是，Bcl-x过度表达_L（左）Bcl-w在所有骨髓和胸腺淋巴亚群中诱导了显著的ABT-737耐药性(图5A、 补充图3B和数值补充表2）。与Bcl-2和Mcl-1一样，Bcl-x的过度表达_L（左）或Bcl-w升高的Bim水平(图5B） ，与这些原生动物蛋白复合物中隔离（补充图4A）。高Bcl-2，Bcl-x_L（左）或Bcl-w水平保护Bim不降解（补充图4B），但不增加Bim mRNA水平（补充图4 C）。这些结果在T细胞杂交瘤细胞系DO11.10中得到了证实。Bcl-2的过度表达使DO11.10细胞对ABT-737敏感，而Bcl-x的过度表达_L（左）保护他们免受这种化合物的伤害(图5C） 尽管每种方法都会相应地提高Bim水平(图5D） ●●●●。

在单独的窗口中打开

图5

Bcl-x公司_L（左）Bcl-w过表达可防止ABT-737诱导的细胞死亡。（A） 用pMIG–Bcl-2、pMIG-Bcl-x逆转录的WT胎肝细胞_L（左）将pMIG–Bcl-w、pMIG-Mcl1或对照pMIG载体移植到受致命辐射的小鼠体内（每组5只）。8周后采集淋巴细胞并用ABT-737进行培养。结果提示如补充图3A中的热图所示。（B） Bcl-2、Bcl-x的过度表达_L（左）根据Western blotting评估，淋巴细胞中的Bcl-w或Mcl-1伴随着Bim增加。由于一个尚不清楚的原因，标记Mcl-1的标记版本很难用我们的抗标记抗体检测，但用抗-Mcl-1抗体检测时，它是一个移动较慢的带。（C） 稳定转染pEF–mBcl-2、pEF-mBcl-x的小鼠DO11.10 T杂交瘤细胞_L（左）或对照pEF载体被不断增加的ABT-737浓度激发24小时。（D） Bcl-2或Bcl-x过表达时Bim水平升高_L（左）Western blotting显示在DO11.10细胞中。（E）Mcl-1型^{飞行/飞行}/Eμ-Myc公司用pMIG–Bcl-2、pMIG-Bcl-x逆转录的淋巴瘤细胞_L（左）在暴露于ABT-737之前，用4-OHT处理pMIG–Mcl-1或对照pMIG载体3天，以去除内源性Mcl-1。这些实验是用一个独立的Mcl-1型^{飞行/飞行}/Eμ-Myc公司淋巴瘤系。（F） Mcl-1、Bcl-2、Bcl-x的相应水平_L（左）Western blotting法测定Bim。

确定Bcl-2和Bcl-x的相反作用_L（左）对于ABT-737诱导的凋亡在肿瘤模型中保持不变，我们使用E类μ-Myc公司转基因小鼠。E类μ-Myc公司–驱动型淋巴瘤对ABT-737表现出高度耐药性，因为Mcl-1水平较高。³⁶我们在E类μ-Myc/Mcl-1型^{flox/flox公司}/罗萨克里^呃老鼠，所以Mcl-1型可通过4-羟基三苯氧胺（4-OHT）治疗随意删除。Bcl-2在E类μ-Myc/Mcl-1型^{flox/flox公司}/罗萨克里^呃细胞使这些淋巴瘤细胞对ABT-737的体外治疗敏感，特别是当内源性Mcl-1被去除时(图5E-F）。相反，Bcl-x_L（左）或Mcl-1过度表达的细胞对ABT-737具有耐药性，即使在缺乏内源性Mcl-1的情况下(图5E-F）。这些数据与我们在人类NHL细胞中的发现一致。总的来说，我们的结论是ABT-737在杀死过度表达Bcl-2的细胞方面比杀死过度表达Bcl-x的细胞更有效_L（左）或Bcl-w(图1B） ●●●●。

作者感谢安德烈亚斯·斯特拉瑟、杰里·亚当斯、彼得·查博塔、约翰·帕里索特和大卫·西格尔的有益讨论；Gordon Smyth提供统计建议；雅培提供ABT-737和263；Lorraine O'Reilly和Kylie Mason检测试剂和抗体；Bruno Helbert和Carley Young用于小鼠基因分型；艾米莉·萨瑟兰（Emily Sutherland）、塔妮娅·卡米莱里（Tania Camilleri）和乔瓦尼·西西利亚诺（Giovanni Siciliano），他们饲养了大量的老鼠。

这项工作得到了澳大利亚研究委员会（D.M.）、澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）、项目拨款461219和461221、项目拨款637326、研究奖学金（A.W.R.和D.C.S.H.）和职业发展奖（W.D.F.和P.B.）、塔塔夫人纪念信托基金（S.G.）、，澳大利亚白血病基金会奖学金（S.L.K.和E.F.L.）、维多利亚癌症委员会、白血病与淋巴瘤协会（SCOR拨款7413）、国家癌症研究所（CA43540）以及NHMRC（IRISS）和维多利亚州政府（OIS）的基础设施支持。