线粒体靶向抗氧化剂米托醌对肾小管细胞和大鼠肾脏冷藏损伤的保护作用

摘要

介绍

已故器官捐赠者为需要移植的终末期肾病患者提供了大量肾脏。移植前必须对这些肾脏进行冷冻保存。在美国，首选的器官保存方法是冷藏（CS），大约80%的移植病例使用这种方法(Maathuis等人，2007年;Moers等人，2009年). CS减慢代谢反应以保持器官质量，同时为受体选择和转运留出时间。尽管这种方法非常有价值，但CS已被证明会引起血管收缩、肾小管和内皮损伤以及细胞死亡(Salahudeen等人，2001年,2004)可能导致肾脏疾病。根据2009年器官采购和移植网络/移植受者科学注册中心的年度报告，由于冷缺血时间、活检发现或无法找到受者，从潜在死亡供体恢复的肾脏中有16%被丢弃(Klein等人，2010年). 与活体供体肾脏相比，CS后移植的肾脏可能导致移植功能延迟、慢性移植肾肾病、移植肾丢失和/或医疗费用增加(Ojo等人，1997年;Wight等人，2003年;Schwarz等人，2005年). 由于这些CS结果，必须确定额外的策略来提高保存期间已故捐赠肾脏的质量。

许多研究小组通过测试一系列化合物作为保存溶液的添加剂来改善CS期间或移植后的细胞或组织功能，在这一领域取得了重大进展。一些报告建议，应进一步探索在保存液中添加生物类黄酮和营养因子，因为这些化合物可防止猪和犬肾小管细胞CS期间的脂质过氧化、线粒体功能障碍和细胞活力丧失(Ahlenstiel等人，2006年;Kwon等人，2007年). 在保存液中添加聚乙二醇和曲美他嗪可减少猪肾脏冷缺血/再灌注（I/R）后的间质和肾小管周围炎症、浸润和肾功能障碍(Hauet等人，2000年;Faure等人，2002年). 在同基因大鼠肾移植模型中，在威斯康星大学（UW）保存液中添加抗氧化剂去铁胺可以提高肾小球滤过率并减少细胞死亡(Huang等人，2003年). 尽管有这些努力和其他备受推崇的发现，但在一项初步临床研究中，只有聚乙二醇能改善肾脏保存(Codas等人，2009年).

本研究的目的是使用大鼠肾近端小管细胞和分离的大鼠肾脏，确定在UW保存溶液中添加线粒体靶向抗氧化剂MitoQ是否可以改善早期CS（4h）损伤。MitoQ由泛醌部分组成，泛醌部分共价连接到以三苯基鏻阳离子终止的脂族10碳链上(Kelso等人，2001年). 一旦定位于线粒体，它就被电子传递链的复合物II还原为活性抗氧化剂泛喹啉。为了防止氧化损伤，它被氧化成泛醌，然后由络合物II再还原(James等人，2005年). 在脓毒症、心脏I/R和心肌肥大的细胞和动物模型中，MitoQ已被证明有助于对抗氧化应激、线粒体功能障碍和细胞死亡(Adlam等人，2005年;Lowes等人，2008年;Graham等人，2009年). 此外，MitoQ已经在两个II期临床试验中进行了测试，结果表明它可以减少慢性丙型肝炎病毒感染患者的肝脏损伤(Gane等人，2010年;斯诺等人，2010年).

选择MitoQ进行本研究是因为它直接针对线粒体，我们认为线粒体是CS损伤的始发事件发生地。我们报道了线粒体活性氧（ROS；超氧化物、一氧化氮和过氧亚硝酸盐）是大鼠肾近端小管细胞在24小时CS和6小时复温（RW）期间线粒体功能障碍和氧化剂生成的主要促因(Mitchell等人，2010年). 因此，这似乎是第一份评估在器官保存液中添加线粒体靶向抗氧化剂的益处的报告。此外，本研究还包括一种对照化合物，癸基三苯基溴化鏻（DecylTPP），其化学结构与MitoQ相似，但不含抗氧化剂泛喹啉部分，以确定MitoQ的影响是否仅由其抗氧化性能引起。我们的结果表明，在大鼠肾近端小管细胞和大鼠肾脏CS期间，向UW保存液中添加MitoQ可以显著保护大鼠肾脏免受氧化应激、线粒体功能障碍、细胞死亡和肾损伤。

材料和方法

化学品和试剂。

MitoQ甲磺酸钠和DecylTPP由Robin A.J.Smith教授和Michael P.Murphy博士亲切提供(图1). 在体外实验中，使用了纯甲磺酸米托Q和癸基TPP，而在体外研究中使用了与环糊精和癸基TPP结合的甲磺酸米托Q。甲磺酸米托Q与环糊精结合，使米托Q更易于处理。过氧亚硝酸盐由John Crow博士的实验室提供（阿肯色州小石城医科大学）。

在单独的窗口中打开

图1。

MitoQ（顶部）和DecylTPP（底部）的化学结构（修改自Kelso等人，2001年).

冷藏体外模型。

将正常大鼠肾脏近端小管细胞（NRK-52E；美国型培养物收藏馆，弗吉尼亚州马纳萨斯）保存在6孔100或150 mm或150 mm培养板中，并将其放置在加湿培养箱中，培养箱中通入5%CO气体₂37°C时95%的空气在DMEM（Invitrogen，Carlsbad，CA）中，含有5%的胎牛血清（FCS）。细胞生长至60%汇合处，并分为四个处理组：1）未处理（Untx）、2）CS、3）CS+MitoQ和4）CS+DecylTPP。未经处理的细胞在含有5%FCS的DMEM中保持在37°C（第1组）。CS通过用冷PBS（Invitrogen）洗涤细胞两次并将其单独保存在UW/Viaspan溶液中（4°C下4小时）（第2组）、CS+MitoQ（1μM）（第3组）或CS+DecylTPP（1μM）（第4组）来启动。在单独的实验中，通过用含有5%FCS的DMEM代替单独的UW溶液或含有MitoQ或DecylTPP的UW溶液，将细胞暴露于CS加RW过夜（37°C下18小时）。

体外冷藏模型。

根据美国国立卫生研究院的规定，所有动物都接受了治疗实验动物护理和使用指南以及阿肯色大学医学科学研究所动物护理和使用委员会指南。雄性Fischer 344只近交系大鼠（Charles Rivers Laboratories，Inc.，Wilmington，MA），体重在250到300克之间，用乙烷麻醉，然后刮胡子，并用甜菜碱进行预处理。静脉注射2毫升0.9%（w/v）氯化钠丸，在耻骨联合上方1厘米处剑突尖端切开。在主动脉和腔静脉（肾血管的近端和远端）上放置斗牛犬夹，以防止血液流向肾脏。使用22号外科针头刺穿大鼠主动脉，使用小导管用盐水（每个肾10毫升）冲洗肾移植物。一旦肾脏开始变成浅棕色（灌注），腔静脉中就会形成另一个通风口，让血液从肾脏流出。两个肾脏完全冲洗后，右肾恢复并作为对照（第1组），左肾在4°C下单独暴露于CS 4小时（第2组）。在其他实验中，使用小导管用盐水通过主动脉冲洗肾脏，然后用含MitoQ（100μM）的盐水冲洗右肾，用含DecylTPP（100μM）的盐水（每个肾脏10 ml）冲洗左肾。在4°C下，将组织回收并保存在CS+MitoQ（100μM；右肾）或CS+DecylTPP（100μM；左肾）中4 h（分别为第3组和第4组）。切下所有肾脏的薄中段，立即用10%福尔马林固定，然后包埋在石蜡中进行切片（4μm）和组织学评估。肾脏的其余部分迅速冷冻在液氮中，并储存在−80°C中，直到需要进行生化分析。

线粒体超氧化物产生。

线粒体SOX红（Invitrogen）用于测量CS期间线粒体超氧化物的生成。简言之，在治疗前，在黑暗中用MitoSOX红预加载细胞（5μM；37°C下10分钟）（第1-4组）。使用Eclipse E800显微镜（尼康，梅尔维尔，纽约州）和罗丹明滤光镜（60×）观察荧光。在相同曝光时间下拍摄NRK细胞的荧光图像，并使用Nikon Nis Elements软件对三个不同场中五个随机细胞的平均荧光强度进行平均量化。在单独的实验中，细胞生长在盖玻片上，在治疗前预加载MitoSOX Red（第1-4组），并使用日立F-2500荧光光谱仪评估线粒体超氧化物生成（日立，日本东京）配备有一个盖玻片支架，使用两种不同的激发波长：396和510nm，发射测量在580nm，如前所述(Munusamy和MacMillan-Crow，2009年). 此外，如下文所述，通过使用一个小导管用生理盐水通过主动脉冲洗肾脏，监测大鼠肾脏的线粒体超氧化物生成体外冷藏模型然后在治疗前使用含有MitoSOX Red（5μM；10 ml/肾）的生理盐水（第1-4组）。在尼康Eclipse 800显微镜（20×）上使用罗丹明滤纸分析石蜡切片。

硝基酪氨酸免疫细胞化学和免疫组织化学。

如前所述，对NRK细胞（第1-4组）进行硝基酪氨酸形成评估(Mitchell等人，2010年). 总之，用硝基酪氨酸多克隆抗体（1:200；Millipore，Billerica，MA）、Alexa-594结合抗体（1:1000；Invitrogen）和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（1:100；Invit罗gen）对细胞进行免疫染色，以进行核复染。阳性对照是在室温下用过氧亚硝酸盐（0.8 mM）在PBS中处理5分钟的细胞。阴性对照是用过氧亚硝酸盐处理的细胞，但通过用过量的3-硝基酪氨酸（10 mM；西格玛阿尔德里奇，密苏里州圣路易斯）阻断硝基酪氨酸抗体来证实抗体结合特异性。使用尼康Eclipse 800显微镜（40×油）在相同曝光时间下评估并捕获硝基酪氨酸染色。使用Nikon Nis Elements软件，通过平均三个不同区域中五个随机细胞的平均荧光强度，对图像进行量化。通过硝基酪氨酸免疫组织化学方法评估肾组织切片中是否存在硝基酪氨酸蛋白加合物。组织切片脱蜡并重新水化，然后进行抗原回收（在95°C下用10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0；Sigma-Aldrich）培养20分钟）。用过氧化物酶抑制剂（Thermo Scientific，Rockford，IL）和DAKO蛋白块（DAKO North America，Inc.，Carpintia，CA）封闭切片，并用多克隆兔抗硝基酪氨酸抗体（1:3000）在4°C下培养过夜。使用DAKO LSAB+System-HRP试剂盒（DAKO North America，Inc.）制作切片，然后进行Mayer的苏木精复染（Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA）、脱水，并用Cytoseal-60（Electronic Microscopy-Seciences）进行贴装。通过用3-硝基酪氨酸（10mM）阻断抗体，证实了硝基酪氨酸抗体在肾组织中结合的特异性。

线粒体呼吸复合物活性。

通过蔗糖密度梯度离心分离NRK细胞和大鼠肾线粒体。如前所述，在30°C下使用100μg线粒体蛋白分光光度法测定线粒体呼吸复合物I、II、III或IV的活性(Birch-Machin和Turnbull，2001年;Saba等人，2008年).

形态评估。

使用周期性酸席夫反应评估肾切片的组织损伤。将组织脱蜡并再水合，然后在室温下用0.5%的碘酸溶液（Sigma-Aldrich）氧化5分钟。用蒸馏水冲洗切片，并在室温下用希夫试剂（Sigma-Aldrich）培养15分钟。随后，用自来水冲洗切片，用迈尔苏木精复染，脱水，并用Cytoseal-60固定。用光学显微镜对肾小管扩张、刷状缘丢失和细胞碎片/肾小管铸型形成进行盲目的形态学评估，并根据以下评分系统进行半定量评估：0，无变化；1、轻度变化；2，中度变化，3，重度变化。

细胞死亡测量。

根据制造商的说明，使用LDH-细胞毒性检测试剂盒II（加州山景城Biovision Research Products）测定细胞毒性。使用SpectraMax 190微孔板阅读器和SpectraMax软件（加利福尼亚州桑尼维尔的分子器件）在450 nm处测量吸光度。用TUNEL染色测定肾细胞死亡。将肾切片脱蜡、复水并暴露于抗原回收（在95°C下用10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）孵育20分钟），然后用蒸馏水冲洗并熄灭内源性过氧化物酶。将切片浸入TdT标记缓冲液中，然后在室温下用TACS 2 TdT-DAB原位细胞凋亡检测试剂盒（马里兰州盖瑟斯堡Trevigen公司）中的标记反应混合物在加湿室中培养1小时。用TdT停止缓冲液停止反应，然后用PBS冲洗载玻片。切片用链霉亲和素-HRP孵育10分钟，然后用二氨基联苯胺溶液显影，用迈尔苏木精复染，脱水，并用Cytoseal-60贴装。通过平均10个不同区域（皮质和髓质）（20×）TUNEL（棕色染色）阳性细胞数计算细胞死亡量。所有图像均在相同的曝光时间（40倍油）下拍摄。

统计分析。

结果以平均值±S.E.M.表示，平均值是从三个（体外）或五个（体内）独立实验中获得的。使用Origin 6.0统计软件（马萨诸塞州北安普敦市OriginLab），采用单向方差分析比较未治疗组/对照组和治疗组的平均值，然后采用Tukey检验比较两组在95%置信水平下的平均值差异。与P（P）值小于0.05被认为具有统计学意义。

结果

线粒体Q对CS期间线粒体超氧化物生成的保护作用。

MitoQ和DecylTPP治疗的最佳剂量是从4h CS期间的剂量反应实验中选择的。对于基于细胞的研究，从0.5、0.75、1.0、1.5和2μM的范围中选择1μM，而体外研究的最有效剂量是从50、100和500μM的剂量反应研究中选择100μM（数据未显示）。最初使用线粒体靶向荧光染料MitoSOX Red（一种测量线粒体超氧化物生成的荧光染料）测试了MitoQ治疗对CS损伤的潜在保护作用。如所示图2A、 与未经处理的细胞相比，暴露于CS的NRK细胞由于线粒体超氧化物而导致荧光增加约2倍。MitoQ对CS-诱导的线粒体超氧化物生成具有显著的保护作用；而对照化合物DecylTPP没有提供任何保护。使用基于荧光分光光度法的检测396和510 nm处MitoSOX红色荧光激发的方法进一步证实了这一点，其中396 nm是线粒体超氧化物的特异性指示剂，510 nm检测非特异性氧化剂的生成(Robinson等人，2006年) (图2B） ●●●●。此外，与对照肾脏相比，仅接触CS的肾脏显示线粒体超氧化物生成增加(图2C） ●●●●。MitoQ治疗显著降低线粒体超氧化物的生成，而DecylTPP治疗的肾脏与仅暴露于CS的肾脏线粒体超氧化物水平相当(图2C） ●●●●。

在单独的窗口中打开

图2。

MitoQ对CS过程中线粒体超氧化物生成的影响。使用MitoSOX红（5μM持续10分钟）评估线粒体超氧化物水平。A、 左侧，未经处理（Untx）的细胞和暴露于CS（顶部）的细胞以及暴露于CS+MitoQ（1μM）和CS+DecylTPP（1μM）的细胞的荧光显微图像（底部）（60×）。结果代表了使用不同细胞培养物的三个实验。对，使用Nis Elements软件定量MitoSOX红染色。数值表示为平均值±S.E.M(n个= 3). **,P（P）与Untx细胞相比<0.01；†，P（P）与CS细胞相比<0.05。B、 在盖玻片上生长的NRK细胞的荧光光谱，并在396和510-nm激发/580-nm发射波长下测试MitoSOX红的荧光。数值表示为Untx细胞±S.E.M.上任意荧光单位的平均倍数变化(n个= 3). **,P（P）与Untx细胞相比<0.01；†，P（P）与CS细胞相比<0.05。C、 用MitoSOX红（从左到右）冲洗大鼠肾脏的荧光显微照片：对照组、CS、CS+MitoQ（100μM）和CS+DecylTPP（100μM）（20×）。结果代表了五项动物实验。

MitoQ减少CS期间硝基酪氨酸加合物的形成。

免疫细胞化学和免疫组织化学用于评估CS期间硝基酪氨酸蛋白加合物。如所示图3A、 与未经处理的细胞相比，仅接触CS的NRK细胞的硝基酪氨酸染色（红色荧光）显著增加。MitoQ使硝基酪氨酸的形成减弱了约2倍，而对照化合物DecylTPP没有减少CS-介导的硝基酪氨酸形成(图3A） ●●●●。过氧亚硝酸盐处理的细胞有强烈的硝基酪氨酸形成（阳性对照），当硝基酪氨酸抗体被过量的3-硝基酪氨酸预吸收时，细胞被阻断（阴性对照；ONOO⁻+块）。大鼠肾脏免疫组织化学数据与关于MitoQ和硝基酪氨酸影响的体外研究结果一致。图3B显示，与对照肾相比，CS肾的远端和近端小管中的硝基酪氨酸（棕色染色）增加，肾小球中硝基酪氨酸的增加程度较小。用米托Q治疗的肾脏硝基酪氨酸生成较少。相反，与CS肾脏相比，DecylTPP治疗的肾脏具有相似数量的硝基酪氨酸。硝基酪氨酸染色的特异性也通过预先吸收过量3-硝基酪氨酸（CS+阻断）的抗体得到证实。

在单独的窗口中打开

图3。

MitoQ减弱CS期间硝基酪氨酸的形成。用硝基酪氨酸多克隆抗体（1:200）、Alexa-594结合抗体（1:1000）和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（1:100）对细胞进行免疫染色，进行核复染。硝基酪氨酸荧光红阳性细胞。A，未经处理（Untx）细胞和暴露于CS（顶部）的细胞的荧光显微图像，以及暴露于CS+MitoQ（1μM）和CS+DecylTPP（1μM）的细胞（中间）。底部，图像代表染色对照：用过氧亚硝酸盐（ONOO）处理的NRK细胞⁻; 阳性对照）和ONOO处理的NRK细胞⁻但与过量的3-硝基酪氨酸（ONOO）预孵育⁻+区块；阴性对照）（40×油）。结果代表了使用不同细胞培养物的三个实验。使用Nis Elements软件量化硝基酪氨酸染色。数值以平均值±标准误差表示(n个= 3). *,P（P）<0.05或***，P（P）与Untx细胞相比<0.001；†，P（P）与CS细胞相比<0.05。B、 大鼠肾脏硝基酪氨酸免疫组化的显微照片：对照组和CS（顶部）、暴露于CS+MitoQ（100μM）和CS+DecylTPP（100μM）的肾脏（中部）和CS+阻断（CS肾脏+10 mM 3-硝基酪氨酸）（底部）（20×）。结果代表了五项动物实验。

MitoQ防止CS期间线粒体呼吸复合体失活。

在体外和离体肾脏模型中评估线粒体呼吸复合物的活性，以研究4-h CS是否改变线粒体呼吸功能。与未经处理的细胞相比，NRK细胞CS后复合物I和II显著失活(图4). MitoQ完全阻止了复合物I和II的失活，而DecylTPP对复合物活性没有显著影响。本研究中未对络合物III和IV进行评估，因为我们之前已经证明，这两种络合物的活性在24小时CS中没有变化(Mitchell等人，2010年); 因此，对这些复杂活动的评估是不必要的。与体外研究结果一致，大鼠肾脏CS导致复合物I和II活性的部分失活，对复合物III和IV没有影响(图4). MitoQ对CS肾脏的复合物I和II失活有保护作用，而DecylTPP没有任何作用。

在单独的窗口中打开

图4。

MitoQ可防止CS期间线粒体呼吸复合体失活。使用来自NRK细胞（A和B）的分离线粒体和暴露于CS、CS+MitoQ或CS+DecylTPP（体外1μM，体外100μM）的分离大鼠肾线粒体（C-F）测量单个线粒体呼吸复合体的活性。数值表示为百分比平均值±S.E.M(n个=3个体外或5个体外）。**，P（P）<0.01或***，P（P）与各自的对照组相比<0.001†，P（P）与CS相比<0.05。

米托Q治疗可减少CS引起的肾损伤和细胞死亡。

定期进行酸-雪夫染色，以检查大鼠肾脏CS期间的组织病理学变化。CS暴露时发生了广泛的管状损伤，如扩张、刷状边界损失和细胞碎片/铸型形成(图5A） ●●●●。MitoQ显著改善了肾脏组织学，而DecylTPP治疗并没有逆转肾损伤。细胞核棕色染色显示的TUNEL染色用作细胞死亡的标记。如所示图5B、 与对照肾脏相比，CS导致细胞死亡显著增加（红色箭头）。与CS肾脏相比，MitoQ治疗使细胞死亡减少了约2倍，而DecylTPP对细胞死亡没有任何保护作用。

在单独的窗口中打开

图5。

MitoQ对CS-诱导的肾损伤和细胞死亡的影响。显示了五个动物实验的代表性显微照片。A、 大鼠肾脏的周期性酸-雪夫染色（从左到右）：对照组、CS、CS+MitoQ（100μM）和CS+DecylTPP（100μM）（20×）。根据以下评分系统，盲目和半定量地观察和评估了广泛的肾小管扩张、刷状缘丢失和细胞碎片/肾小管铸型形成：0，无变化；1、轻度变化；2、适度变化；3、严重变化。B、 大鼠肾脏的TUNEL染色（棕色细胞核；红色箭头）（从左到右）：对照组、CS、CS+MitoQ（100μM）和CS+DecylTPP（100μM）（40×）。通过平均皮层和髓质10个不同区域TUNEL阳性细胞数来计算细胞死亡量。数值表示为平均值±S.E.M(n个= 5). ***,P（P）与对照组相比<0.001†，P（P）与CS相比<0.05。

MitoQ降低NRK细胞CS加复温过程中硝基酪氨酸的形成和细胞死亡。

为了测试MitoQ是否有可能在再灌注/移植后提供抗氧化和细胞死亡的保护，将细胞暴露于CS加RW图6A、 4h CS加过夜（18h）RW的NRK细胞导致显著的硝基酪氨酸形成。CS期间添加MitoQ显著减弱了CS期间的硝基酪氨酸染色。RW，而对照化合物DecylTPP没有影响。LDH的细胞毒性表明，暴露于CS的NRK细胞的细胞死亡显著增加。RW与未处理细胞的比较(图6B） ●●●●。在单纯CS和CS期间，MitoQ使细胞死亡减少约2倍。两个治疗组的RW.DecylTPP均未减少细胞死亡。

在单独的窗口中打开

图6。

MitoQ减少CS和RW氧化剂的生成和细胞死亡。A、 硝基酪氨酸免疫细胞化学的荧光显微图像：未经处理的（Untx）细胞和暴露于CS的细胞。RW（顶部）和暴露于CS的细胞。RW+MitoQ（1μM）和CS。RW+癸基TPP（1μM）（底部）（40×油）。结果代表了使用不同细胞培养物的三个实验。使用Nis Elements软件量化硝基酪氨酸染色。数值表示为平均值±S.E.M(n个= 3). *,P（P）<0.05或***，P（P）与Untx细胞相比<0.001；†，P（P）与CS相比<0.05。RW电池。B、 使用LDH细胞毒性检测试剂盒II测定细胞死亡百分比。数值表示为细胞死亡平均值±S.E.M.的百分比(n个= 3). **,P（P）<0.01或***，P（P）与未经处理的细胞相比<0.001。†，P（P）与CS细胞相比<0.05，P（P）与CS相比<0.01。RW电池。

讨论

在本研究中，我们已经证明，在NRK细胞和分离的大鼠肾脏的CS过程中，将线粒体靶向抗氧化剂MitoQ添加到UW保存溶液中可以减少氧化剂的产生，防止线粒体功能障碍，并最大限度地减少肾损伤和细胞死亡。MitoQ的对照化合物DecylTPP（将MitoQ靶向线粒体的亲脂阳离子）没有提供保护作用，并作为阴性对照纳入本研究，以确认MitoQ抗氧化性能。需要指出的是，在整个研究过程中，MitoQ仅在CS（4°C）期间服用。因此，它是改善器官保存的理想候选药物，因为它不需要在移植前或移植受体的器官再灌注期间给已故供体注射。在人体器官的低温保存过程中，评估肾脏损伤的活检通常用于确定是移植还是丢弃捐赠的肾脏。因此，MitoQ减少肾损伤组织学证据的能力表明，由于CS-介导的损伤，MitoQ可能导致更少的肾脏被丢弃。此外，在帕金森病和丙型肝炎病毒的两个II期临床试验中，MitoQ已被证明是安全且耐受性良好的(Gane等人，2010年;Snow等人，2010年)这将加快其在器官保存期间使用的临床试验中的测试。此外，MitoQ不会对患者进行全身给药，因此潜在的药物引起的副作用将大大降低。本研究使用氧化应激、线粒体功能和细胞损伤标记物的结果提供了大量证据，证明了MitoQ对CS-介导损伤的有效性，并支持线粒体ROS应是预防供肾低温保存损伤的重要靶点这一观点。

先前使用人和猪肾小管细胞的研究表明，包括超氧物（NADPH氧化酶为来源）、过氧化氢和羟基自由基在内的活性氧是CS损伤的主要因素(Salahudeen等人，2000年;Karhumäki等人，2007年). 我们最近报道了线粒体ROS（超氧物、一氧化氮和过氧亚硝酸盐）是导致CS（24小时）和RW（6小时）暴露大鼠肾小管细胞线粒体功能障碍和细胞死亡的信号分子(Mitchell等人，2010年). 重要的是要指出，之前的研究在稍后的时间点（24小时）测量了CS损伤，因为大多数捐赠肾脏都会长期保存。在本研究中，在4小时时测量CS事件，以确定早期肾脏和线粒体损伤是如何发生的，并确定预防早期CS介导的损伤是否可以避免下游毒性事件。

MitoQ在CS期间的潜在保护作用最初是通过使用MitoSOX Red测量线粒体超氧化物生成来测试的。使用MitoQ处理后，CS诱导的线粒体超氧化物显著减少，这表明MitoQ将在降低下游氧化剂生成和损伤方面非常有效。以前的报告显示，在高血糖内皮细胞模型和芬太尼治疗的神经母细胞瘤细胞系中，MitoQ可降低特异性来源于超氧化物的线粒体ROS(基亚诺等人，2007年;Cuperus等人，2010年). 在后一项研究中，芬雷他尼治疗通过增加线粒体ROS生成诱导神经母细胞瘤肿瘤的凋亡。超氧化物是导致其他有害氧化剂形成的近端氧化剂，通过线粒体过渡孔和/或通过电压依赖性阴离子通道进入膜间隙，可在细胞内造成额外损伤(图伦斯，2003).

一氧化氮是一种自由基，众所周知，它与超氧物相互作用形成过氧亚硝酸盐。它由一氧化氮合酶（NOS）生成，是许多生理过程中的重要信号分子。很少有报告评估了冷缺血单独对NOS蛋白水平或活性的影响。Desrois等人（2005年）据报道，在大鼠异位心脏移植模型中，内皮细胞NOS蛋白水平在冷缺血期间显著降低，NOS活性在缺血3h后最初增加，但在冷缺血6h后显著下降。这些作者认为，冷缺血通过降低一氧化氮发挥其保护作用的能力，导致大鼠心脏内皮功能障碍。在我们最近的文章中，NRK细胞24小时CS后有效一氧化氮水平显著下降，这可能是由于一氧化氮与线粒体超氧化物相互作用形成过氧亚硝酸盐所致(Mitchell等人，2010年). NOS抑制剂N个⁵-[亚氨基（甲胺基）甲基]-我-柠檬酸鸟氨酸抑制硝基酪氨酸染色（过氧亚硝酸盐的一个标记），强烈表明确实形成了一氧化氮，但通过与超氧物的相互作用很快转化为过氧亚硝基。使用CS-NRK细胞模型的其他研究表明，在4h CS后，有效氮氧化物水平也降低，而MitoQ没有影响（数据未显示）。

MitoQ对CS诱导的线粒体超氧化物的有效性保证了在NRK细胞和分离的大鼠肾脏的CS过程中酪氨酸硝化的进一步评估。硝基酪氨酸的形成会对蛋白质功能和其他细胞过程产生不利影响。我们之前已经确定大鼠肾脏的冷I/R导致硝基酪氨酸的形成(Saba等人，2008年)根据我们目前的研究结果，我们认为冷藏会增加酪氨酸硝化。MitoQ能够显著降低细胞和离体肾脏模型中的硝基酪氨酸。在对氧化剂解毒后，MitoQ可以被呼吸链还原，反复循环回到其抗氧化形式(James等人，2005年)，这进一步支持了在CS过程中添加MitoQ的优势，因为它能够持续清除氧化剂。综上所述，我们的数据表明，向UW溶液中添加MitoQ可以通过清除线粒体超氧化物来减轻CS期间的氧化应激。

氧化剂生成增加可导致线粒体呼吸复合体失活，三磷酸腺苷水平下降，线粒体功能障碍，从而导致细胞死亡(福斯林，2001). 低温保存已被证明会损害许多器官系统的线粒体功能(Meng等人，1991年;Salahudeen等人，2003年;库兹涅佐夫等人，2004年). 我们的数据表明，CS会导致细胞和体外肾脏模型中线粒体复合物I和II的部分失活，并且通过MitoQ治疗可以完全阻止兴奋。保护复合物I和II的活性很重要，因为这些复合物会启动氧化磷酸化，一旦失活，会生成额外的氧化剂。在败血症引起的心脏功能障碍的啮齿动物模型中，MitoQ已被证明可以恢复线粒体功能(Supinski等人，2009年). 这些作者先前确定，该模型中的心肌线粒体功能障碍与ROS生成的显著增加有关。因此，MitoQ恢复CS呼吸复合体活性的能力可以解释线粒体超氧化物生成减少的原因。

冷缺血介导的氧化剂生成和线粒体功能障碍都可能导致不可逆的肾损伤和细胞死亡，一旦器官移植，可能导致进一步的损伤。研究表明，肾小管刷状缘的丢失是缺血性损伤的明确标志，也是近端肾小管功能受损的标志(Venkatachalam等人，1978年)最终导致细胞死亡。在目前的研究中，MitoQ通过减少肾小管刷状缘丢失、肾小管扩张和细胞死亡来保护CS-介导的肾损伤。

不幸的是，我们没有外科专家将CS肾脏移植到大鼠受体体内以评估移植后的肾功能。然而，仅在CS期间使用MitoQ观察到的保护程度清楚地表明，肾功能最有可能得到改善，如前所述，仅CS期间的保护可能会导致肾脏被丢弃的次数减少。通过合作，未来的研究将在移植后的猪CS肾模型上进行，以探讨MitoQ是否可以减轻移植后的损伤。这种更大的动物模型在临床上更具相关性，在技术上更容易进行外科移植研究。然而，我们能够测量MitoQ治疗对CS和NRK细胞随后RW后硝基酪氨酸形成和细胞死亡的益处，这是一个值得尊敬的模型，模拟了复温/再灌注后细胞水平上发生的情况(Stec等人，2007年;Waller等人，2007年). 我们最近发现，仅CS（24小时）可增加超氧化物和硝基酪氨酸水平，并使细胞死亡降至最低，而RW NRK细胞可显著增加细胞死亡(Mitchell等人，2010年). 这些数据与我们在之前的文章中显示的数据类似，重要的是，MitoQ治疗如何保护患者免受这种损伤。总之，这些发现表明CS期间导致细胞死亡的机制。RW似乎是在单独的CS过程中启动的，并且可以通过抗氧化处理来调节。

总之，这是首次报告显示线粒体超氧化物在CS早期显著增加，并导致线粒体和肾脏损伤。我们已确定线粒体靶向抗氧化剂MitoQ可显著保护CS-介导的氧化应激、线粒体功能障碍、细胞死亡以及肾近端小管细胞和离体大鼠肾脏的肾损伤。这些发现表明，在移植前向肾脏输注MitoQ可能具有治疗作用，可以减少CS损伤，改善移植受者的预后，并增加可用于移植的捐赠器官数量，所有这些都可能导致医疗费用下降。

致谢

工具书类