重症监护医学。作者手稿；PMC 2012年6月21日发布。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院291784
神经型一氧化氮合酶缺乏降低细菌性腹膜炎和脓毒症患者的存活率
,,,,,、和
崔西忠
美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院重症监护医学部国立卫生研究所临床中心
弗吉尼亚·贝施
美国马里兰州贝塞斯达20892-1512，MSC-1512，2C624室，10号楼，中心路10号，国立卫生研究院麻醉和外科服务部，国立卫生院临床中心
阿尔菲亚·凯布利纳
美国马里兰州贝塞斯达20892-1512，MSC-1512，2C624室，10号楼，中心路10号，国立卫生研究院麻醉和外科服务部，国立卫生院临床中心
阿德里安·赫根
美国马里兰州贝塞斯达20892-1512，MSC-1512，2C624室，10号楼，中心路10号，国立卫生研究院麻醉和外科服务部，国立卫生院临床中心
玛莎·奎扎多
美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院病理实验室国家癌症研究所
彼得·艾查克
美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院重症监护医学部国立卫生研究所临床中心
Zenaide M.N.Quezado公司
美国马里兰州贝塞斯达20892-1512，MSC-1512，2C624室，10号楼，中心路10号，国立卫生研究院麻醉和外科服务部，国立卫生院临床中心
崔锡忠，美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院重症监护医学部国立卫生研究所临床中心；
通讯作者。 摘要
目标
探讨神经元型一氧化氮合酶（NOS1）在小鼠多菌性腹膜炎和脓毒症中的作用。
学科
B6129S编号1+/+和B6；129S4编号–/–老鼠。
干预措施
NOS1号+/+和NOS1–/–动物接受盲肠结扎和穿刺（CLP）或假手术，并接受NOS1抑制剂7-硝基吲哚唑（7-NI）或载体。
测量和主要结果
CLP后，NOS1的遗传缺陷和药物抑制显著增加了死亡率风险[8.69（3.27，23.1），对<0.0001和1.71（1.00，2.92）对=0.05，NOS1的死亡危险比（95%置信区间）–/–和7-NI处理的NOS1+/+与NOS1相比+/+动物。在7-NI处理的NOS1中+/+动物，NOS增加（6小时），然后减少（24小时），而–/–动物血液细菌计数持续增加(对=0.04，对于7-NI和NOS1的不同影响–/–)与NOS1相比+/+动物。CLP后，NOS1–/–与NOS1相比，诱导型NOS和促炎细胞因子上调，血清肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6水平升高+/+小鼠（全部对< 0.05). CLP后，循环白细胞和肺灌洗细胞也出现了类似的显著下降(对≤0.0008），腹腔灌洗细胞显著增加(对=0.0045）。CLP后6小时和24小时以上，与NOS1相比+/+，编号–/–小鼠腹腔细胞浓度显著升高{分别为0.40±0.09 vs 0.79±0.15[log（×104cells/ml）]两次平均值对= 0.038}.
结论
NOS1的缺乏和抑制可能通过增加致炎细胞因子反应和损害CLP后的细菌清除而增加死亡率。这些数据表明，NOS1对感染和脓毒症期间的生存、细菌清除和细胞因子反应的调节至关重要。
关键词：败血症、腹膜炎、NOS1、nNOS、NO、啮齿动物
介绍
大多数关于一氧化氮合酶（NOS）在脓毒症中作用的研究都集中于诱导型NOS（NOS2），并表明其表达以及NO的过度生成在脓毒病诱导的血流动力学变化和终末器官损伤中起关键作用[1–6]。关于一氧化氮合酶的组成亚型，有实验证据表明内皮型一氧化氮合酶（NOS3）在脓毒症中也有重要作用。研究人员表明，NOS3基因缺陷可改善内毒素引起的低血压反应[7]NOS3的过度表达使小鼠对内毒素诱导的肺损伤、心肌功能障碍和死亡具有抵抗力[8,9]。然而，对于另一种组成性表达的NOS，即神经元NOS（NOS1）在感染和脓毒症中的作用知之甚少[10].
NOS1在多种组织中表达[11–15]并与心脏和肾脏功能的调节有关[16–18]，血管内稳态[19,20]气道反应性和炎症[15]。关于白细胞功能，研究表明NOS1在白细胞-内皮相互作用的调节中发挥作用。先天性缺乏NOS1的小鼠在基础状态和凝血酶刺激后，肠系膜微循环中的白细胞滚动和粘附增加[21]。在化学性腹膜炎期间，NOS1缺陷小鼠增加了白细胞向腹膜的迁移，这似乎是P-选择素介导的[21]。其他研究表明，NOS1缺乏增加了气管内注射内毒素或肺炎克雷伯菌[22]。在绵羊中，NOS1抑制改善了吸入烟雾和气道滴注细菌后的肺损伤[23]。综上所述，这些研究表明NOS1可能在基础状态和炎症期间调节白细胞运输中起重要作用。
然而，NOS1对细菌感染期间总体结局的影响尚不清楚。我们假设，NOS1的遗传缺陷和药物抑制将导致白细胞向感染部位的转运增加，微生物清除率增加，以及腹膜炎和败血症期间整体结果的改善。
方法
实验对象
在NIH临床中心动物护理和使用委员会批准后，我们研究了女性B6129S NOS1+/+（NOS1亲本菌株的F2杂种–/–小鼠，C67BL/6J和129S）和B6；129S4编号1–/–6至8周龄、体重15至30克的老鼠（马萨诸塞州巴尔港杰克逊实验室）。动物被安置在72°F（22.2°C）的环境中，可以自由获取食物和水。手术后，在前36小时内每2小时观察一次动物，在36小时至48小时内每4小时观察一回，在48小时至168小时内每天观察一次。发现濒死或表现出意外痛苦的动物被人道处死。
实验方案
生存
我们研究了八个组，包括所有手术组合[盲肠结扎和穿刺（CLP）或假手术（剖腹手术，不进行盲肠结直肠结扎和穿孔）]、基因型（NOS1）+/+或NOS1–/–)和治疗[7-硝基吲哚唑（7-NI）或载体]。在异氟醚诱导麻醉后，动物接受CLP或如前所述的假手术[24]。简单地说，在腹部中线小切口后，用4–0丝线在距离盲肠尖端1厘米处结扎盲肠底部，并用16-G针在反肠系膜表面穿孔一次。然后通过穿刺伤口排出少量粪便。手术结束时给予液体（生理盐水，50 ml/kg），每剂量使用抗生素[Primaxin®（亚胺培南/西司他丁钠），25 mg/kg亚胺培南，默克，新泽西州怀特豪斯站]术后2h开始，每12h注射一次，持续72h（每次皮下注射50ml/kg生理盐水，前24h为150ml/kg，24h至72h为100ml/kg）。
7-NI治疗
手术期间，根据实验组分配，NOS1+/+和NOS1–/–给动物静脉注射7-NI（80 mg/kg）花生油或花生油（对照）[25]并在10小时以上产生可检测到的7-NI血清水平[26].
细胞计数和器官组织学
在基线检查时或手术后6小时或24小时，对单独的动物队列进行人道处死，以收集血液、肺和腹腔灌洗液以及器官。获得完整和差异的血细胞计数和定量血培养。对于腹腔灌洗，将磷酸盐缓冲盐水（PBS）注入腹膜，3分钟后回收腹膜液。通过气管插管获得肺灌洗液，然后依次注射4份1毫升的PBS。用电子计数器（佛罗里达州迈阿密Coulter Electronics的Z1 Coulter粒子计数器）进行洗脱细胞计数。制备用于差异计数的载玻片（Cytospin 4，Thermo Shandon Inc.，宾夕法尼亚州匹兹堡）并进行染色。洗液上清液通过45μm过滤器，并使用Folin–Lowry技术进行蛋白质测定。
一位对动物组盲的病理学家测量了心脏、肺、脾、肝和肾中中性粒细胞的浸润情况，结果如下：0分表示没有中性粒细胞，1+表示数量较少，2+表示数量适中，3+表示数量较多。
定量实时聚合酶链反应
使用RNeasy Mini试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚，齐亚根）在CLP后6小时从脾脏中分离RNA。安捷伦2100生物分析仪使用RNA 6000纳米试剂盒（安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉）评估RNA质量，并使用NanoDrop（NanoDrot科技公司，德国威明顿）测量数量。使用Abi Prism®7500（均来自加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）中的一步qRTPCR试剂盒，通过实时聚合酶链反应（qPCR）定量肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、IL-10、IL-1β、干扰素（IFN）-γ、巨噬细胞炎症蛋白（MIP）-1α和NOS2基因表达。在内源性GAPDH标准化后计算基因表达的倍数变化，并相对于NOS1的脾脏中检测到的变化进行表达+/+对照动物（标准化为1）使用比较Ct法[27].
血清细胞因子和趋化因子水平
使用多重夹心酶联免疫吸附试验（SearchLight Mouse Cytokine array，ThermoFisher Scientific，Woburn，MA，USA）测定血清TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、IFN-γ和MIP-1α水平。
体外细菌杀灭试验
白细胞从6个NOS1队列中提取+/+和六个NOS–/–小鼠，腹腔灌洗细胞(>90%的粒细胞和<获得10%的单核细胞和淋巴细胞），并悬浮在不含Ca的Dulbecco PBS中2个+和镁2个+.大肠杆菌0111:H12（5×106将对数相培养的CFU添加到含有2×10的聚丙烯管中6相应小鼠株的白细胞。在37°C下与端对端旋转共培养90分钟后，通过将每管内容物的系列稀释液以三份的形式镀在MacConkey琼脂上并在过夜生长后计数菌落来确定细菌活力。
统计方法
各组之间的生存效果比较（7-NI治疗组与NOS1载体组+/+或NOS1–/–小鼠或NOS1–/–与NOS1相比+/++载体或7-NI治疗）使用Cox比例风险模型进行分析，并表示为死亡风险比和95%置信区间。由于7-NI对NOS1的死亡率没有显著影响–/–动物，7-NI处理的NOS1–/–和车辆处理NOS–/–将小鼠与NOS1结合并进行比较+/+和7-NI处理的NOS1+/+生存分析和实验室数据。所有其他实验室测量值均采用方差分析进行分析。在统计分析的基础上，对变量进行平均，以提高功率并减少动物使用。通过从各实验组的平均值中减去对照组的平均数来计算疗效。在适当的地方对数据进行日志转换。所有结果均表示为平均值±SEM，并且对值≤0.05被认为是显著的。
结果
基线研究
基线检查时，与NOS1相比+/+小鼠，NOS1–/–动物的循环中性粒细胞较高(对= 0.001,)循环血小板减少(对=0.03时，). NOS1之间的血液计数变量没有其他差异+/+和NOS1–/–老鼠。腹腔灌洗液中NOS1–/–小鼠，与NOS1比较+/+白细胞计数较高[0.28±0.11 vs 0.08±0.02 log（×104/ml），NOSI–/–与NOS1相比+/+分别是，对=0.002]和更高浓度的总蛋白（分别为94±17和35±2 mg/10 ml，对= 0.03). 在肺灌洗液中，NOS1的平均细胞数和蛋白质浓度相似–/–和NOS1+/+老鼠。NOS1的基线血清细胞因子水平相似+/+和NOS1–/–老鼠。
表1
盲肠结扎和穿刺前后循环和肺灌洗变量的平均值±SEM
| 变量 | 盲肠结扎和穿刺前（基线）或（h）后的时间 |
|---|
| NOS1号+/+ | 7-NI-处理NOS1+/+ | NOS1号–/– |
|---|
| 基线(n个= 6) | 6 (n个= 9) | 24 (n个= 10) | 基线(n个= 6) | 6 (n个= 10) | 24 (n个= 10) | 基线(n个= 4) | 6 (n个= 19) | 24 (n个= 15) |
|---|
| 循环血细胞 |
| 中性粒细胞（×10三/ul） | 0.46 ± 0.08 | 0.44 ± 0.22 | 0.05 ± 0.04 | 0.46 ± 0.08 | 0.42 ± 0.15 | 0.05 ± 0.03 | 1.21 ± 0.26 | 0.56 ± 0.22 | 0.23 ± 0.13 |
| 淋巴细胞（×10三/ul） | 5.13 ± 0.84 | 0.77 ± 0.18 | 1.05 ± 0.46 | 5.13±0.84 | 1.03 ± 0.25 | 0.61 ± 0.15 | 3.87±0.94 | 0.79 ± 0.22 | 0.62 ± 0.11 |
| 血小板（×10三/ul） | 955 ± 40 | 559 ± 114 | 338 ± 48 | 955 ± 40 | 696 ± 128 | 359 ± 93 | 642 ± 126 | 654 ± 74 | 524 ± 269 |
| 肺灌洗细胞 |
| 淋巴细胞对数（×104细胞/ml） | 不适用 | 1.34 ± 0.24 | 1.45 ± 0.09 | 不适用 | 1.09 ± 0.29 | 0.98 ± 0.07 | 不适用 | 1.03 ± 0.12 | 1.21±0.08 |
生存
假手术后，所有NOS1+/+和NOS1–/–小鼠存活下来，而CLP后6小时，所有动物都表现出虚弱、嗜睡和行动不便。在168小时以上，CLP导致所有组的死亡率(). CLP后NOS1基因缺陷–/–以及7-NI处理的NOS1中NOS1的药理抑制–/–与相似模式（NOS1–/–与7-NI-处理的NOS1相比–/–,对=NS），与NOS1相比死亡风险增加（死亡时间缩短）+/+小鼠[8.69（3.27，23.1），死亡危险比（95%置信区间），对<0.0001时，]。此外，7-NI处理的NOS1中NOS1的药物抑制作用+/+与NOS1相比，在不改变存活率的情况下，动物的死亡时间显著缩短+/+[1.71（1.00，2.92）死亡危险比（95%置信区间），对= 0.05,]。最后，在7-NI处理的NOS1中，NOS1基因缺陷死亡风险比的总体增加显著大于NOS1的药物抑制+/+动物(对=0.004，比较7-NI处理的NOS1+/+动物与NOS1–/–,).
NOS1对脓毒症患者生存率的影响。NOS1中盲肠结扎和穿孔后存活的动物比例+/+，7-NI-处理NOS1+/+和NOS1–/–组
NOS1对死亡风险的影响。NOS1缺乏的死亡率危险比(NOS1号–/–)和NOS1的药理抑制(NOS1号+/++7-核岛)与NOS1中正常NOS1进行比较+/+动物。这个广场和圆圈表示相应组的死亡风险比括号95%置信区间。与NOS1中完整的NOS1相比+/+，NOS1基因缺陷与显著增加的死亡风险相关(对<0.0001），以及7-NI对NOS1的药物抑制(对= 0.05). 基因NOS1缺陷对死亡风险的有害影响大于药物抑制NOS1和7-NI(对= 0.004)
细菌计数
CLP后，与NOS1比较+/+，7-NI处理的NOS1的血液细菌计数均增加+/+和NOS1–/–动物在6小时时，但7-NI处理的NOS1减少+/+在24小时时，NOS1仍然增加–/–在24小时时，随着时间的推移，模式有显著差异(对= 0.04,). 此外，与NOS1相比，平均6小时和24小时+/+，编号–/–小鼠的血细菌计数总体增加显著增加[1.40±0.66（平均值±SEM log cfu/ml），这两个时间点加起来，对= 0.03,]。假手术后，所有组的血液培养均未生长。
NOS1对盲肠结扎穿孔（CLP）后细菌清除率的影响。CLP后，NOS1缺乏小鼠(NOS1号–/–)在6小时和24小时（两个时间点的总和对=0.03）与NOS1相比+/+老鼠。CLP后，与NOS1比较+/+，7-NI处理的NOS1的血液细菌计数均增加+/+和NOS1–/–动物在6小时时，但7-NI处理的NOS1减少+/+24小时时NOS1仍增加–/–在24小时时，随着时间的推移，模式有显著差异(对= 0.03).cfu（循环流化床），集落形成单位
CLP后的基因表达
在CLP后6小时，我们使用实时定量PCR检测了NOS脾脏中一些基因的表达–/–，7-NI-处理NOS1+/+和NOS1+/+动物(). 在NOS1中–/–动物，与NOS1比较+/+，NOS2的表达上调约四倍(对=0.004），TNF-α约为三倍(对=0.02），IL-6约为34倍(对=0.002），MIP-1α五倍(对=0.02），IL-10五倍(对= 0.005). 相反，在CLP后6 h，NOS1之间IL-4、IL-1β和IFN-γ的基因表达没有显著差异+/+和NOS1–/–动物(对=NS）。此外，7-NI处理对7-NI处理的NOS1的基因表达没有显著影响+/+与NOS1比较的动物+/+(对=NS，).
盲肠结扎和穿孔（CLP）后6 h NOS1对基因表达的影响。折叠更改(年-轴），每个基因均归一化为GAPDH，并与车辆处理的脓毒症NOS1中的基因表达相关+/+动物（标准化为1）。结果是相对褶皱变化的平均值±SEM。CLP后6小时，NOS1–/–动物，与NOS1比较+/+对照组，诱导型一氧化氮合酶上调(NOS2号)大约四倍(对=0.004），肿瘤坏死因子(TNF公司)-α约为三倍(对=0.02），白细胞介素(伊利诺伊州)-6约34倍(对=0.002），巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1型α） 五倍(对=0.02），IL-10五倍(对= 0.005). 相反，在CLP后6 h，与NOS1相比，IL-4、IL-1β和干扰素（IFN）-γ的基因表达没有显著差异+/+和NOS1–/–动物(对=NS）。7-NI治疗对脓毒症动物的基因表达没有显著影响(对=NS）
血清细胞因子和趋化因子
从基线检查到CLP后6 h，NOS1的血清TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β和MIP-1α显著增加+/+，7-NI-处理NOS1+/+和NOS1–/–动物（全部对< 0.0001,)，但任何实验组的血清IFN-γ均无明显变化(对=NS，). 此外，与NOS1相比，CLP后6小时以上+/+，编号–/–小鼠血清TNF-α水平显著升高(对=0.018）和IL-6(对=0.048）和血清MIP-1α水平增加趋势(对=0.065）。相反，在CLP后6小时内，与7-NI处理的NOS1相比，血清细胞因子水平与基线相比没有显著差异+/+带NOS1+/+动物(对=NS，).
NOS1对盲肠结扎穿刺术后血清细胞因子水平的影响。酒吧表示与基线细胞因子水平相比的平均变化。CLP后与基线相比，血清肿瘤坏死因子显著升高(TNF公司-α） ，白细胞介素(伊利诺伊州)-6、IL-10、IL-1β和巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1型α） NOS1中的水平+/+-类型，7-NI处理NOS1+/+和NOS1–/–动物；全部的对< 0.0001. 与NOS1相比，CLP后6小时以上+/+，编号–/–小鼠血清TNF-α水平显著升高(对=0.018）和IL-6(对=0.048）和血清MIP-1α水平增加趋势(对=0.065）。7-NI对7-NI处理的-NOS1的药物抑制作用+/+与NOS1相比，对基线水平的血清细胞因子变化没有影响+/+动物(对=NS）
全血细胞计数
与假手术相比，CLP使总循环白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血小板减少(对<0.05，数据未显示）。CLP后，循环白细胞总数也有类似的显著下降(对= 0.0008,)NOS1中+/+，7-NI-处理NOS1+/+和NOS1–/–动物。CLP后24小时内，总循环中性粒细胞、淋巴细胞和血小板计数()NOS1中的血红蛋白（数据未显示）也同样减少+/+，7-NI-处理NOS1+/+、和NOS1–/–动物（全部对< 0.02). 假手术后6小时至24小时，循环白细胞和淋巴细胞总数同样增加(对<0.05），循环中性粒细胞和血小板也同样减少(对<0.05）在两个NOS1中+/+和NOS1–/–老鼠。在这些测量中，NOS1的遗传缺陷或药物抑制没有影响(对=NS，数据未显示）。
NOS1对盲肠结扎穿孔（CLP）后细胞贩运的影响。CLP后，循环白细胞总数也有类似的显著下降(一;对=0.0008），肺泡灌洗液细胞总数也有类似的显著减少（肺泡灌洗液细胞总数对数，b;对=0.0001），并且腹膜灌洗细胞总数显著增加(c（c）;对=0.0045，腹腔灌洗液中的对数总细胞数）-NOS1+/+，7-NI-处理NOS1+/+和NOS1–/–动物。与NOS1相比，CLP后6小时和24小时以上+/+，编号–/–细胞总浓度明显较高(对=0.038）和7-NI处理的NOS1+/+小鼠细胞浓度升高的趋势(对=0.09）在腹腔冲洗液中
肺灌洗
CLP后，肺灌洗细胞也有类似的显著减少(对= 0.0001,)NOS1中+/+，7-NI-处理NOS1+/+和NOS1–/–动物。与NOS1相比，CLP后6小时和24小时以上+/+，7-NI-处理NOS1+/+(对=0.02）和NOS1–/–(对=0.03）小鼠肺灌洗淋巴细胞浓度显著降低[1.42±0.09，1.02±0.12，1.11±0.07 log（×104细胞/ml）NOS1+/+，7-NI-处理NOS1+/+和NOS1–/–小鼠分别在平均6小时和24小时内）]。CLP后，与研究组相比，任何其他肺部灌洗措施都没有显著差异。假手术后NOS1+/+，7-NI-处理NOS1+/+和NOS1–/–肺泡灌洗液中细胞计数和蛋白质浓度无明显变化（数据未显示）。
腹腔灌洗
CLP后，腹腔灌洗细胞显著增加(对= 0.0045,)NOS1中+/+，7-NI-处理NOS1+/+和NOS1–/–动物。此外，与NOS1相比，CLP后6小时和24小时以上+/+动物，NOS–/–小鼠的总细胞浓度显著升高[分别为0.40±0.09 vs 0.79±0.15[log（×104cells/ml）]两个时间点的平均值对=0.038]和7-NI处理的NOS1+/+小鼠细胞浓度趋向于更高（0.40±0.09 vs 0.68±0.15[log（×104细胞/ml）]，对=0.09）。从CLP后6小时到24小时，所有动物都表现出类似的下降(对=NS）（数据未显示）。假手术后NOS1+/+，7-NI-处理NOS1+/+和NOS1–/–小鼠腹腔灌洗液中的细胞计数和蛋白质浓度无明显变化。
组织病理学
为了评估NOS1在非感染性器官损伤中的作用，我们评估了假手术和CLP后6、24和168 h脾脏、心脏、肾脏、肺和肝脏中性粒细胞浸润的程度。在所有接受CLP的动物中，这些器官中中性粒细胞浸润的程度相似(,对=NS）。
表2
盲肠结扎和穿刺后肺、肝、肾、脾和心脏中性粒细胞浸润程度（平均值±SEM）
| 器官 | 盲肠结扎穿刺后时间（h） |
|---|
| NOS1号+/+ | 7-NI处理NOS1+/+ | NOS1号–/– |
|---|
| 6 (n个= 6) | 24 (n个=9） | 168 (n个= 10) | 6个(n个= 6) | 24 (n个= 10) | 168 (n个= 10) | 6 (n个= 4) | 24 (n个= 19) | 168 (n个= 15) |
|---|
| 肺 | 0 | 0.11 ± 0.11 | 0 | 0 | 0.11 ± 0.11 | 0 | 0.10 ± 0.10 | 0.07 ± 0.07 | 不适用 |
| 肝脏 | 0 | 0.33 ± 0.24 | 0.50 ± 0.29 | 0 | 0.11 ± 0.11 | 0 | 0.40 ± 0.31 | 0.21 ± 0.11 | 不适用 |
| 肾 | 0 | 0.11±0.11 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.30 ± 0.30 | 0.10 ± 0.43 | 不适用 |
| 脾脏 | 1.17 ± 0.40 | 1.11 ± 0.26 | 0.25 ± 0.25 | 1.40 ± 0.51 | 0.89 ± 0.35 | 1.00 ± 1.00 | 0.90 ± 0.28 | 0.43 ± 0.17 | 不适用 |
| 心脏 | 0 | 0.11 ± 0.11 | 0 | 0 | 0.11 ± 0.11 | 0 | 0 | 0.07 ± 0.07 | 不适用 |
体外杀菌
为了评估中性粒细胞体外杀菌能力，我们评估了细菌与NOS1诱导的白细胞共培养后细菌集落形成单位的数量–/–和NOS1+/+动物。含有细菌和NOS1诱导白细胞的平板–/–和NOS1+/+动物也有类似的(对=NS）菌落数均较低(对=0.02）比控制板().
诱导中性粒细胞的体外杀菌活性。将等分的诱发中性粒细胞与细菌一起培养，并放置过夜。仅含有NOS1诱导的中性粒细胞的平板+/+和NOS1–/–动物没有生长。含有NOS1白细胞的平板–/–和NOS1+/+动物也有类似的(对=NS）较低的菌落数量(对=0.02）比仅含有细菌的对照板中的细菌
讨论
在CLP诱导的脓毒症中，NOS1的遗传缺陷和药物抑制增加了白细胞向感染部位的转运，但降低了存活率和血细菌清除率。此外，NOS1的死亡率增加–/–动物与NOS1相关的炎症细胞因子反应模式的改变有关+/+动物。具体而言，在感染发生后6小时，相对于NOS1+/+动物，NOS1中NOS1缺乏–/–动物与NOS2基因、促炎细胞因子（TNF、IL-6）和趋化因子（MIP-1α）的显著增加表达以及IL-10的上调有关。此外，在NOS1缺乏动物中，基因表达的上调与血清促炎因子（TNF和IL-6）和趋化细胞因子（MIP-1α）水平的增加相结合。这些结果表明，NOS1缺乏在小鼠细菌性腹膜炎和脓毒症期间产生整体有害影响，并表明NOS1可能通过调节炎性细胞运输、改变微生物清除率和增加促炎细胞因子反应而影响生存。
而来自NOS1的白细胞–/–小鼠在体外表现出正常的杀菌活性，我们对这些动物体内细菌清除障碍的研究结果与其他动物一致[22]。研究人员表明肺炎克雷伯菌吸入，NOS1–/–小鼠增加了中性粒细胞向肺部的募集，但肺部的募集量增加肺炎克雷伯菌与NOS1相比+/+动物[22]。我们体内和体外研究结果之间的差异表明，体外研究并不能完全反映体内细菌的清除情况，并且除细菌杀伤以外的其他因素在NOS中CLP后清除血液中细菌的作用–/–动物。有趣的是，通过一种或多种机制尚不完全了解的NOS1已被证明在清除小鼠寄生虫感染中起作用[28]。综上所述，我们的研究结果和其他研究结果表明，NOS1对细菌感染和脓毒症期间感染部位和血液中的微生物清除都很重要。
在这项研究中，我们发现遗传性NOS1缺乏与关键的促炎和趋化细胞因子的上调以及NOS2的上调有关。我们的发现与那些表明NOS1的慢性药物抑制可以改变NOS2和NF-κB的表达的结果一致[29]，一种调节促炎细胞因子转录的因子。两者都在体外[30]和体内[31]7-NI对NOS1的慢性药物抑制导致与NF-κB上调相关的NOS2 mRNA和NOS2蛋白增加，髓过氧化物酶活性增加（中性粒细胞隔离的标志物）。有趣的是，与对照组相比，除了促炎细胞因子上调外，我们还发现NOS1缺陷动物的抗炎细胞因子IL-10也上调。因此，人们可以假设，通过在感染后改变细胞因子的表达，NOS1缺陷可能会在促炎细胞因子和抗炎细胞因子之间产生失衡，从而在脓毒症早期，这种可能的失衡会导致死亡风险增加和细菌清除受损。
根据报告，NOS1缺乏小鼠的白细胞粘附、滚动和迁移增加[21]，我们假设NOS1–/–脓毒症期间，动物可能会增加中性粒细胞诱导的炎症器官损伤。然而，与报道相反，血管外感染期间中性粒细胞粘附增加可加重损伤[32,33]在细菌性腹膜炎期间，我们没有发现NOS1改变器官中性粒细胞浸润的组织学证据。可以想象，因为我们在NOS1感染和大多数死亡的早期（长达24小时）检查了器官组织学+/+和NOS1–/–发生在24小时后，我们无法检测到器官损伤的差异。与我们的发现相反，其他人发现，在绵羊烟雾吸入和细菌挑战模型中，NOS1的药物抑制降低了肺损伤的生理和组织学指标[23]。这些结果与我们的结果之间的差异可以用所研究的物种和模型的差异来解释。然而，我们的研究结果表明，NOS1缺乏的有害影响和NOS1的药物抑制与脓毒症早期终末器官中性粒细胞浸润的显著增加无关。
关于CLP后的细胞贩运，我们的研究结果与其他描述化学性腹膜炎期间白细胞向腹膜迁移增加的研究结果一致[21]气管内细菌吸入后进入肺部[22]。在这里，我们发现在细菌性腹膜炎期间，NOS1的遗传缺陷和药理学抑制与更多的细胞迁移到腹膜中有关。因此，我们发现NOS1缺乏会影响细菌性腹膜炎期间细胞向腹膜的迁移，这一发现补充了现有的文献，表明NOS1在白细胞向血管外感染部位募集方面具有调节作用。此外，发现NOS1缺陷动物在基线时有较高的循环中性粒细胞和较低的血小板计数，这可能表明，通过尚不完全了解的机制，NOS1也可能在基础条件下对某些细胞类型的调节中发挥作用，最终影响循环中性白细胞和血小板。综上所述，这些发现支持了这样一种观点，即NOS1在基础状态和细菌性血管外感染期间的白细胞-内皮细胞相互作用的调节中发挥着重要作用。
总之，通过基因改变和酶的药物抑制，NOS1受到干扰，增加了死亡风险，增加了白细胞向感染部位的募集，降低了血液中细菌的清除率，并增加了CLP后脓毒症的促炎细胞因子反应。虽然我们必须谨慎地将啮齿动物数据外推到其他物种，但我们的结果表明，NOS1对细菌清除、细胞因子表达和脓毒症期间的存活至关重要，抑制NOS1的治疗策略可能有害。
致谢
作者感谢Yu Cao、Yvonne Fitz和LaShon Middleton提供的专业技术支持。这项研究得到了国立卫生研究院NIH临床中心的院内研究计划的支持。作者没有利益冲突需要报告。
参与者信息
崔锡忠，美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院重症监护医学部国立卫生研究所临床中心。
弗吉尼亚·贝施，美国马里兰州贝塞斯达20892-1512，MSC-1512，2C624室，10号楼，中心路10号，国立卫生研究院麻醉和外科服务部，国立卫生院临床中心。
Alfia Khaibullina，美国马里兰州贝塞斯达20892-1512，MSC-1512，2C624室，10号楼，中心路10号，国立卫生研究院麻醉和外科服务部，国立卫生院临床中心。
阿德里安·赫尔根，美国国立卫生研究院临床中心，美国国立卫生研究院，麻醉和外科服务部，10号中心大道，10号楼，2C624室，MSC-1512，贝塞斯达20892-1512，马里兰州。
玛莎·奎扎多，美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所、美国国立卫生研究院病理实验室。
彼得·艾查克，美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院重症监护医学部国立卫生研究所临床中心。
Zenaide M.N.Quezado，美国马里兰州贝塞斯达20892-1512，MSC-1512，2C624室，10号楼，中心路10号，国立卫生研究院麻醉和外科服务部，国立卫生院临床中心。
工具书类
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