投资眼科视觉科学。2012年5月；53(6): 3027–3039.
缺乏视黄醇结合蛋白受体STRA6的小鼠的视网膜中的类视网膜含量、视觉反应和眼睛形态受到影响
,1 ,2,三 ,2,三 ,2,三 ,4 ,1 ,4 ,4 ,4 ,2,三，5 ,4,5和1,4,6
曼纽尔·马克
4朱尔斯·斯坦因眼科研究所，
和6加州大学洛杉矶分校戴维·格芬医学院大脑研究所；
拥抱雅各布斯
4Jules Stein眼科研究所，
和6加州大学洛杉矶分校戴维·格芬医学院大脑研究所；
穆里尔·克洛芬斯坦
4朱尔斯·斯坦因眼科研究所，
和6加州大学洛杉矶分校戴维·格芬医学院大脑研究所；
Roxana A Radu公司
4朱尔斯·斯坦因眼科研究所，
诺伯特·B·盖斯林克
4朱尔斯·斯坦因眼科研究所，
和6加州大学洛杉矶分校戴维·格芬医学院大脑研究所；
迪安·博克
从1神经生物学系，
4朱尔斯·斯坦因眼科研究所，
和6加州大学洛杉矶分校戴维·格芬医学院大脑研究所；
从1神经生物学系，
4朱尔斯·斯坦因眼科研究所，
和6加州大学洛杉矶分校戴维·格芬医学院大脑研究所；
和>2法国盖内蒂克生物研究所（Institute de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire），三斯特拉斯堡大学，法国伊尔柯克。
通讯作者：Dean Bok，JSEI 100 Stein Plaza Rm。B-182，加州大学洛杉矶分校朱尔斯·斯坦眼科研究所，90095；ude.alcu.iesj@kob. 2011年8月25日收到；2012年2月15日修订；2012年3月19日修订；2012年3月22日接受。
- 补充资料
补充数据
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摘要
目的。
我们报告了一个鼠标模型的生成，其中STRA6型基因在功能上被破坏，以便于研究STRA6蛋白缺乏时的视觉反应、眼形态变化和视黄醇加工。
方法。
空鼠标线，stra6−/−，已生成。Western Blot和免疫细胞化学检测STRA6蛋白的表达。对6周龄、5月龄和10月龄小鼠进行视觉反应和形态学研究。采用高效液相色谱法评估暗适应小鼠眼组织中的维甲酸含量。
结果。
STRA6蛋白在stra6−/−null小鼠的视觉反应持续减少，但没有完全消融。小鼠的视网膜色素上皮（RPE）和神经感觉视网膜中的类视黄醇含量也显著减少，包括视黄酯减少95%。在形态学水平上，与控制幼崽相比，由于视杆内外节缩短，神经感觉视网膜厚度减少，视杆相应减少一-和b条-波幅。此外，视锥感光细胞数量和视锥减少b条-波振幅。中的典型特征stra6−/−空眼是指持续存在的原发性肥大玻璃体，这是一种光学致密的血管结构，位于晶状体后表面和神经感觉视网膜之间的玻璃体腔中。
结论。
我们对stra6−/−无效小鼠确定了STRA6蛋白对RPE摄取、细胞内运输和加工视黄醇的重要性。在没有它的情况下，视杆感光器内外节段长度减少，锥细胞数量减少，暗视和明视反应也减少。原发性玻璃体溶解也需要STRA6。然而，从这些研究中可以清楚地看出，STRA6并不是RPE摄取视黄醇的唯一途径。
街道6−/−小鼠的眼睛表型与对照幼崽明显不同，但与人类在同一基因突变中观察到的病理异常相比，其严重程度更低。
介绍
维生素A（全部-反式-视黄醇）是生成各种功能衍生物的基本前体，包括所有-反式-雷纳醛，全部-反式-视黄酯及其立体异构体。这些类视黄醇参与几个重要的生物过程，如生殖、胚胎发育、免疫反应和视觉。1–三由于哺乳动物不能合成视黄醇，饮食是维生素A的主要来源，维生素A最初储存在肝脏中-反式-直到需要用于多种组织。游离视黄醇在化学上不稳定，在水溶液中高度不溶。肝脏将视黄醇储存为视黄醇酯，其酶可逆。为了通过血液循环将视黄醇运输到其他靶组织，需要血浆视黄醇结合蛋白（RBP）和甲状腺素转甲状腺炎（TTR）结合蛋白来保护其在分配过程中免受肾脏过滤、氧化或酶损伤。4,5在眼睛中，与RBP（holo-RBP）结合的视黄醇通过脉络膜毛细血管血液输送到视网膜色素上皮（RPE）。自20世纪70年代中期以来，有人提出holo-RBP通过一个假定的RBP受体与RPE细胞的基底侧相互作用。6–8因此，使用RPE细胞和光交联试剂结合高亲和力纯化，对RBP受体蛋白进行了表征，并发现其位于这些细胞的基底侧。9该受体现在被鉴定为STRA6，一种多面体膜蛋白，以高亲和力与RBP结合，并介导从全息RBP复合物中摄取视黄醇。9STRA6被认为具有膜受体和膜转运蛋白的双重功能。9–11虽然很明显，STRA6可以从RBP中催化提取视黄醇，但视黄醇到达其细胞内结合伙伴的精确途径仍然难以捉摸。12STRA6也在负责视黄醇加工的其他组织中表达，如皮肤、脉络丛、胎盘和睾丸。13–15人类STRA6型突变与严重的病理表型密切相关，尤其是在胚胎期。这些突变的后果表现在各种疾病中，包括肺发育不全、心脏畸形、精神发育迟滞和小眼症/无眼症，统称为Mathew-Wood综合征。16–18最近，在STRA6部分缺乏的斑马鱼中也报告了由于视黄醇摄取及其加工缺陷而导致的各种发育异常。19
为了研究STRA6对RPE细胞对视黄醇摄取和加工的重要调节作用，我们试图建立一个其表达受到功能性干扰的小鼠模型。
我们报告中的数据表明stra6−/−小鼠表现出的眼部表型比人类同一基因突变的病理异常要轻。我们的研究得出结论，STRA6是RPE中大多数视黄醇摄取过程所必需的，但也表明存在替代途径，可以在受损条件下部分补偿STRA6的功能。
材料和方法
老鼠
具有杂交C57BL/6J（50%）-129Sv（50%）遗传背景和杂合子的冷冻胚胎街道6突变(STRA6型tm 1（tm 1）
编号等位基因，A；stra6+/-)由法国伊利科奇IGBMC（法国伊利基尔奇）生物研究所（Institute de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire）提供。加州大学洛杉矶分校/辅助生殖技术（ART）核心设施在代孕雌性中对冷冻保存的胚胎进行了再衍生。通过尾部活检基因组DNA的PCR对结果后代进行基因分型。使用补充表S1中描述的引物进行基因分型(http://www.iovs.org/content/53/6/3027/suppl/DC1)和PCR核心试剂（Applied Biosystems，新泽西州Branchburg）引物P1和P2用于检测野生型基因（173个碱基对bp-long），引物P1和P3用于检测街道6零等位基因（326 bp-long）。杂合小鼠(stra6+/-)被交叉以获得stra6−/−我们研究中使用的突变体。所有小鼠均保持12小时的光/暗循环，并随意喂食NIH-31改良开放式配方奶粉，该配方奶粉含有24500 IU/kg的维生素a醋酸盐（威斯康星州麦迪逊市哈兰·特克拉德）。所有实验程序均在6周龄、5个月龄和10个月龄的小鼠组中进行。所有涉及使用小鼠的实验均符合美国国立卫生研究院制定的指南以及ARVO关于在眼科和视力研究中使用动物的声明。
通过PCR对尾部活检的基因组DNA样本进行野生型和突变等位基因的基因分型，随后通过Western Blot分析确认RPE细胞中没有STRA6蛋白。(A类)包含包含外显子E3到E8的区域的基因组区域(带编号的实体框)的街道6野生型等位基因(顶部). 在街道6零（L−）等位基因，包含外显子E5到E7的片段被一个LoxP位点（标记）取代，使得街道6基因非功能性(底部). 用于基因分型的DNA引物（P）的位置和方向用箭头表示。(B类)由中描述的引物组合获得的PCR扩增的代表性图像(A类). (C类)使用RPE细胞提取的Western Blot图像街道6−/−突变和WT控制。Immnuno检测采用针对小鼠STRA6 C末端肽的多克隆抗体和单克隆抗GAPDH作为内部对照。
Western Blot分析
如前所述，从新鲜解剖的组织中提取蛋白质。20每次分析使用10微克样品。如前所述进行电泳和免疫检测。20初级抗体包括：兔抗STRA6肽（来自IGBMC）、兔抗RPE65肽（M.T.Redmond）、兔抗RGR肽（H.Fong）、兔抗LRAT肽（D.Bok）和商业单克隆抗GAPDH（sc-51905；Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz，CA）。
维甲酸分析
所有小鼠在夜间进行暗适应，并且所有组织操作都在昏暗的红光下进行（Eastman Kodak Co.，Wratten 1A滤光片）。如前所述，用正常相高效液相色谱法（HPLC）处理并分析每个含有RPE的视网膜和眼镜杯。21通过在线光谱分析和与真实的维甲酸标准物共同洗脱来确认每种维甲酸的鉴定。
眼底成像
眼底图像是使用Micron II视网膜成像显微镜（Phoenix Research Laboratories，Inc.，Pleasanton，CA）获得的。用含有氯胺酮（15 mg/g）和木聚嗪（7 mg/g体重）的生理盐水溶液腹腔注射（IP）麻醉小鼠，并用1%硫酸阿托品滴液扩张瞳孔。小鼠眼睛与相机的光轴对齐，物镜的位置使其接触角膜表面（角膜压平）。记录了一系列图像，以记录研究过程中视网膜和眼部外观的变化。
视网膜血管造影
视网膜血管造影是使用上述相同的一般眼底成像程序进行的。将小鼠麻醉，并向IP注射10%荧光素钠（美国伊利诺伊州迪卡托市阿科恩公司），剂量为每5–6克体重0.01毫升。短波长灯（1最大值=487nm）来激发荧光素，并且在光学路径中放置阻挡滤光片（透射＜500nm＜0.1%）以防止激发光到达相机。录制了一部持续时间约为10分钟的电影，从中提取了单个图像和剪辑。
光谱域光学相干层析成像（SD-OCT）
使用专门为小鼠设计的商用SD-OCT系统（北卡罗来纳州三角研究公园Bioptigen）进行超高分辨率SD-OCT成像。100个系列b条-收集、堆叠并在空间上对齐扫描，以形成视网膜体积的注册三维呈现（参见补充图S1，http://www.iovs.org/content/53/6/3027/suppl/DC1). 高分辨率b条-通过对20个个体进行平均和空间对齐，获得了以视神经头为中心的视网膜上下扫描b条-沿同一垂直轴扫描。生成的图像导出为640×480像素8位灰色位图文件，并在Adobe Photoshop CS3（加利福尼亚州圣何塞市Adobe Systems）中进行处理。
视网膜电图（ERG）
如前所述记录ERG。22简单地说，经过一夜的暗适应后，使用金电极从眼睛的角膜表面记录ERG，该电极参照插入口腔中的类似金丝。鼠标的眼睛放在一个大积分球的开口前，在这个开口处有短暂的闪光。对这些闪光的响应被放大10000×（Grass P511高性能交流放大器），带通滤波（0.1–300 Hz），在个人计算机中使用I/O板（PCI-6221；德克萨斯州奥斯汀National Instruments）进行数字化，并取平均值。杆介导的反应被记录为蓝色闪烁（Wratten 47A，λ最大值=470 nm）。在饱和棒背景（32 cd/m）上记录锥介导的对白色闪光的反应2). 所有刺激均以1 Hz的频率呈现，但最明亮的闪光除外，其中呈现速度减慢至0.2 Hz。
组织学
石蜡包埋组织。
对杂合子小鼠进行交配，取阴道塞出现当天的12PM作为产后0.5天（E0.5）。在选定的时间点通过剖宫产采集胚胎和胎儿，并将其固定在Bouin液中5天，包埋在石蜡中，然后连续切片，厚度为5μm。在石蜡包埋之前，E18.5胎儿在DC3脱钙剂中治疗30小时（法国坦普尔马斯Labonord）。然后根据标准程序用苏木精和伊红对切片进行染色。
塑料包埋组织。
用异氟醚麻醉的小鼠通过心内灌注进行固定。在眼球剜除前，在角膜上极进行光灼以标记方向。眼罩被修剪成颞半球和鼻半球。将所有组织浸泡在溶于0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中的1%四氧化锇中1小时，然后在分级系列酒精中脱水。
颞半球嵌入Epon/Araldite混合物中。光学显微镜切片在1μm处切割，用1%甲苯胺蓝和1%硼酸钠染色，然后用配备Planapo 63X油浸透镜和CoolSNAP数码相机的蔡司Axiophot显微镜拍照。
免疫细胞化学和共焦显微镜
用异氟烷对小鼠实施安乐死。眼睛固定在4%甲醛中。在磷酸盐缓冲液中依次用10%和30%的蔗糖渗透眼镜杯后，将其嵌入OCT（加州托伦斯市樱花精细技术公司）。在低温恒温器（徕卡CM3050S）上切割10微米冰冻切片。冷冻切片在4%甲醛中重新固定10分钟，并用50 mM氯化铵（NH4Cl）淬火。冷冻切片用封闭溶液孵育，然后用针对STRA6的C末端肽的亲和纯化抗体（1:200，abCam Inc.#ab73490）孵育。将切片暴露于与Alexafluor 488（分子探针，尤金，OR）结合的次级山羊抗兔IgG抗体1小时。用荧光标记花生凝集素（PNA，20 ug/mL；Vector Laboratories，Burlingame，CA）标记锥鞘。切片在共焦激光扫描显微镜下进行检查（Fluoview，Olympus，日本）。
视网膜平面安装准备
用异氟醚对小鼠实施安乐死，并摘除眼睛。视网膜与后段的其余部分分离，并固定在4%甲醛中。视网膜用荧光标记的PNA（20μg/mL）染色1小时，盖上盖子，在共聚焦激光扫描显微镜（日本奥林巴斯，Fluoview）下用40倍物镜检查。
结果
基因中断街道6−/−小鼠
冷冻保存的胚胎再衍生后，杂合子stra6+/-从F1子代获得的小鼠进行杂交以产生stra6−/−基因完全断裂的突变体。用PCR筛选尾部活检的基因组DNA来区分基因型街道6野生型（WT）和杂合窝交配的无效小鼠(B） ●●●●。stra6−/−小鼠发育成正常外观，这与街道6-人类的零突变。针对小鼠多肽的C末端序列产生的抗STRA6抗体没有检测到STRA6蛋白的合成stra6+/+，其显示出具有约74kDa的分子量和另外一种更高分子量的产物(C） ●●●●。事实上，在stra6−/−摘录，排除从删除的区域下游重新启动翻译的可能性街道6mRNA。为了确认从每个细胞提取物中装载了等量的蛋白质，使用商业单克隆抗GAPDH抗体作为内部参照物(C） ●●●●。
STRA6在正常小鼠视网膜中的定位及形态学变化
在6周龄的样本中发现眼睛直径略有减小stra6−/−老鼠。通过测量WT和stra6−/−小鼠在光学显微镜下使用校准过的天平。眼睛直径缩小了8–10%，这种情况持续了stra6型分别为5个月龄和10个月龄的−/−小鼠(). 通过免疫细胞化学和共焦显微镜观察STRA6蛋白在整个视网膜样品上的细胞定位。中呈现的代表性图像在6周龄的RPE细胞或组织切片中的任何其他周围细胞中均未显示STRA6信号stra6−/−老鼠(B） ●●●●。相反，在RPE细胞基底外侧的对照组织切片中观察到强烈的荧光信号，这与RBP受体的预期定位一致(A和插图）。此外，塑料切片的光学显微镜显示stra6−/−视网膜与对照小鼠的比较(C、 D）。观察到整个视网膜范围内IS/OS厚度的变化。为了说明这些差异，对下半球和上半球的每个WT和突变眼进行了形态计量分析（在等间距点，每个半球八个）。该分析表明stra6−/−眼睛(E） 。
眼睛直径的比较街道6−/−和WT小鼠。在3个不同年龄、6周、20周（5个月）和40周（10个月）收集眼球。在立体显微镜下记录测量结果。每个值代表每个WT的平均3-5个眼球stra6−/−小鼠组。
视网膜的组织学特征街道6突变体和对照。(A类,B类)视网膜冰冻切片（10μm）街道6+/+和stra6−/−老鼠。STRA6染色采用来自abCam Inc.的抗STRA6抗体，稀释度为1:200。(C类,D类)来自两种基因型的视网膜1μm塑料切片的图像显示，缺乏STRA6的小鼠视网膜的外节和内节缩短(D类). (E类)沿视网膜整个范围测量外/内节厚度。视神经头（ONH）被用作区分上(正确的)和劣势(左边)半球。每个视网膜显示四个代表性视网膜的平均值街道6+/+和stra6−/−基因型。在每个半球测量八个不同的点。ONL，外核层。棒材，20μm。
STRA6干扰对其他RPE蛋白的影响
为了确定由于缺乏STRA6，RPE细胞中正常存在的蛋白质的表达是否有任何变化，我们对视觉周期蛋白RPE65、RGR和LRAT进行了Western Blot分析。如补充图S2所示(http://www.iovs.org/content/53/6/3027/suppl/DC1)，RPE细胞的蛋白质提取物街道6+/+,stra6+/-，和stra6−/−三种基因型小鼠的表达水平没有差异。相反，对照组的STRA6表达较高街道6+/+比杂合子stra6+/-在stra6−/−从这些结果中，我们得出结论，STRA6在RPE细胞中的表达受到了有效干扰，其缺失对其他视觉周期蛋白的表达水平没有影响，其他视觉周期蛋白质的表达水平的降低会导致视觉周期的衰减。
儿童眼睛持续性原发性玻璃体增生（PHPV）街道6−/−小鼠
对所有患者常规进行SD-OCT和眼底成像研究街道6在进一步评估之前进行小鼠试验。在分析了6周大的几只眼睛后stra6−/−小鼠的眼底检查显示，密集的“小行星状”尸体很明显。这些结构位于玻璃体房内和晶状体后部。IP注射荧光素后，我们可以观察其血管化(A、 B）。补充材料中提供了通过该结构的血流电影(http://www.iovs.org/content/53/6/3027/suppl/DC1). “小行星状”结构的代表性眼底图像显示在C.这些结构包含许多类似脉络膜黑素细胞的色素细胞(D） ●●●●。进一步分析发现它们是持久性PHPV。初级玻璃体是一个短暂的胚胎结构，由来自眼周间质的成纤维细胞和玻璃样动脉发出的毛细血管网组成。23在E13.5和E14.5之间，形成初级玻璃体的成纤维细胞（PV，A） 分散在迅速膨胀的无细胞次级玻璃体（SV，A） 和不再在E15.5中标识（未显示）。在E13.5处，stra6−/−和WT眼在组织学上无法区分(n个= 3). 然而，在E14.5时，继发玻璃体中的细胞核数量在stra6−/−胎儿与WT的比较(n个=每个基因型3个；比较PV，A、 B和数据未显示）。稍后，E18.5stra6−/−突变体(n个=3）显示次级玻璃体（PHPV，D） 这在WT中从未观察到(n个= 3,C） ●●●●。所有2个月大、成年、，stra6−/−突变体(n个=11）在视神经出口点和晶状体（PHPV，F、 H），而从未在其WT幼仔的眼睛中观察到PHPV(n个= 6,E、 G）。在成人中也观察到PHPV，街道6−/−小鼠，即5个月龄和10个月龄(，未显示）。眼睛的SD-OCT分析stra6−/−小鼠还发现，在某些情况下，这些PHPV结构的密度足以阻止红外光穿透右侧（OD）和左侧（OS）眼睛获取OCT信号的路径，如（参见左组底部面板中的箭头）。图中所示的5个月大小鼠眼睛的SD-OCT图像（右组底部）与6周龄空白小鼠的视网膜相似。
6周龄儿童的典型眼底分析和光学显微镜图像stra6−/−显示鼠标。(A类,B类)IP注射荧光素后观察到两个不同焦平面中存在PHPV结构。通过血管的存在可以观察到这些结构的血管化(B类,箭头). (C类)PHPV结构的小行星状外观(A类)和(B类)标准眼底成像。(D类)Epon-Araldite矢状切面（1μm），显示PHPV体的内部特征，包括色素黑素细胞。
永存增生性原发性玻璃体的发生stra6−/−突变体。(A类–D类)E14.5和E18.5 WT胎儿矢状面组织切片的比较stra6−/−突变体(stra6−/−）. (E类–H（H）)6周龄WT和stra6−/−眼睛。C、 角膜；H、 玻璃样血管；五十、 透镜；ON，视神经；R、 视网膜。条形表示160μm(A类–F类).
5个月大婴儿的眼底和光学显微镜图像街道6老鼠。(A类,B类)眼底图像街道6−/−小鼠双眼均出现PHVP。(C类,D类)光学显微镜图像显示视网膜IS和OS长度减少街道6−/−小鼠与WT对照组相比。棒材，20μm。
典型的SD-OCT显示街道6+/+和stra6−/−6周龄和5个月龄小鼠。来自5个月组的图像以较低的放大倍数拍摄。6周龄小白鼠的下半部分显示，小行星状致密结构（PHVP）位于左眼（OS）和右眼（OD）视网膜层上方stra6−/−老鼠(箭头). 这些结构能够阻挡穿过视网膜的光路，产生阴影效果。然而，在5个月大的小鼠的下面板中，尽管双眼中都存在PHVP，但光路并没有被阻断，这可能是由于解剖定位和色素沉着程度的差异。
此外，5个月大的婴儿的视网膜厚度stra6−/−小鼠相当于6周龄小鼠(，下部面板）。一个有趣的形态学观察街道6与相应的对照组相比，突变体发现6周龄小鼠荧光标记PNA染色的锥体数量减少了20%，而5个月龄时减少了80%().
视网膜的组织学特征街道6突变体和对照。5个月大的视网膜冰冻切片（10μm）街道6+/+和stra6−/−所有面板中都显示了鼠标。锥鞘染色(A类,C类)通过使用荧光标记的PNA（20μg/mL）获得。STRA6染色(A类)使用来自abCam Inc.的抗STRA6抗体进行1:200稀释。(B类,D类)是Nomarski控件的图像stra6型+/+和stra6−/−，分别是。
STRA6缺乏对视觉反应的影响
暗适应ERG记录如所示对于街道6+/+,stra6+/-、和stra6−/−老鼠。此图显示了平均值(+1 SE）每个小鼠基因型对逐渐升高的光强度的ERG反应幅度。对于一-和b条-波，响应振幅stra6+/-小鼠与从街道6+/+对照小鼠。相比之下，来自stra6−/−小鼠明显小于街道6+/+对照小鼠。平均来说，暗点一-和b条-波幅（反映感光细胞和视网膜中部细胞的性能）分别约为街道6+/+对照小鼠。有趣的是，在单侧存在PHPV的6周龄空白小鼠的情况下，双眼的记录显示振幅也有类似的降低，如补充图S3所示(http://www.iovs.org/content/53/6/3027/suppl/DC1)表明这些结构对视网膜功能影响不大。我们关于空突变体中锥体密度减少的形态学观察得到了对光刺激的锥体反应减少的支持stra6−/−老鼠。圆锥体b条-在6周龄时，波幅平均仅为WT或杂合反应的20%。这并没有随着年龄的增长而发生实质性变化（数据未显示）。
6周龄儿童ERG分析街道6老鼠。在黑暗适应条件下记录各组小鼠对蓝闪刺激的ERG反应。阴影区域定义的法线范围一-和b条-WT的波幅街道6+/+老鼠。杂合子的反应街道6+/−小鼠完全落在这个范围内，与正常的视网膜功能一致。相反，ERG的反应来自stra6−/−小鼠明显更小一-和b条-WT对照组和杂合子小鼠的波幅分别约为20%和50%。5个月大婴儿的ERG分析街道6小鼠表现出与6周龄小鼠相似的视觉反应（数据未显示）。
STRA6缺乏对视网膜组织中维甲酸含量的影响
对于维甲酸含量的评估，小鼠对应于所有三种街道6在新鲜解剖眼睛之前，基因型在夜间进行暗适应。RPE细胞和神经感觉视网膜样品作为单独的组收集。如所示，所有金额-反式-视黄醇（全部-反式-与杂合和WT样品相比，在RPE和空白小鼠视网膜样品中发现的ROL）持续减少(A、 D）。当对突变眼进行其他视黄醇衍生物的测试时，也观察到了相同的减少模式，例如-反式-视黄基棕榈酸酯（全部-反式-RP）和11-顺式-视黄基棕榈酸酯（11-顺式-RP）用于RPE(B、 C）和11-顺式-视黄醛（11-顺式-RAL）和所有-反式-视黄醛（全部-反式-RAL）用于视网膜(E、 F）。如这些面板所示，对于夜间适应黑暗的小鼠，维生素A的储存形式（全部-反式-RPE细胞中的RP）表现出最显著的变化，约95%的stra6型与对照样品相比，−/−提取物(B） ●●●●。有趣的是stra6−/−小鼠能够再生约21%的野生型11-顺式-RAL水平(E） 在暗适应期间，与感光器响应一致，该响应由一-ERG波().
RPE和神经感觉视网膜中的维甲酸含量街道6基因型。降低所有-反式-在RPE和神经感觉视网膜中均观察到ROL街道6无鼠标(A类,D类). 这些突变体还显示所有-反式-RP和11-顺式-RPE中的RP(B类,C类)还有11个-顺式-RAL和所有-反式-神经感觉视网膜中的RAL(E类,F类). 每个值代表每个基因型组4个眼睛样本的平均值。所有样本均采集自6周龄婴儿街道6老鼠。样品采用正相高效液相色谱法进行分析。全部-反式-ROL，全部-反式-视黄醇；全部-反式-RP，全部-反式-视黄基棕榈酸酯；全部-反式-RAL，全部-反式-视网膜；11-顺式-劳尔色卡，11-顺式-视网膜；11-顺式-RP，11-顺式-视黄基棕榈酸酯。
讨论
视黄醇是生物体在一生中实现正常功能所需的生物机械的重要组成部分。由于STRA6作为视黄醇/RBP复合物的膜受体的相关性及其作为视黄醛转运体的关键作用，9–11我们试图生成一个街道6零小鼠模型，以更好地了解STRA6缺陷对哺乳动物的影响。严重的表型异常与街道6Matthew Wood综合征患者的突变。16–18有趣的是街道6我们报告中的空白小鼠表现出的表型变异与对照窝鼠明显不同，但比在人类中观察到的严重程度要低街道6突变。
一种重要的表型stra6−/−突变小鼠由于其视杆感光细胞内外节段长度缩短，视网膜厚度减少。当对视黄醇衍生物加工重要的其他RPE蛋白在这些细胞中被遗传性破坏时，观察到类似的形态学变化，如RPE65的情况24和LRAT。25然而，重要的是要在第65页和lrat公司敲除模型——ERG测量的视觉反应与stra6−/−突变体，对光刺激的视觉反应仍然显著，尽管异常。这种显著的ERG反应清楚地表明，尽管RPE中没有STRA6，视黄醇或视黄醇酯仍然通过视觉周期进行传递和处理，以生成11-顺式-RAL公司。因此，STRA6消融的生理效应与破坏伙伴蛋白（如RPE65和LRAT-顺式-类维生素A。
RPE和神经感觉视网膜样品中视黄醇及其衍生物的含量在街道6使鼠标无效。在两种组织中，所有-反式-RPE中ROL显著降低至约84%，神经感觉视网膜中ROL降低至约88%，表明RPE细胞摄入的大部分视黄醇是STRA6依赖性的。对于RPE细胞，所有-反式-RP的耗竭程度高于任何其他维甲酸（对照组的3%）。此外，11-顺式-在神经感觉视网膜中，视网膜仅占对照的24%。尽管事实上，在这些突变体中，LRAT和RPE65的蛋白质表达没有变化（表明具有完全的酶活性）。尽管如此，即使RPE的视黄醇摄取减少-反式-可用RP足以产生足够的11-顺式-RAL提供显著的视觉响应。有趣的是，不像第65页和爱尔兰共和国在空白小鼠中，5个月或10个月时没有明显的杆状光感受器细胞变性，尽管在该年龄时锥状光感受器的数量在街道6突变体。这些发现类似于第65页和irbp公司敲除小鼠，26,27这意味着视黄醇水平对椎体存活比杆更为关键。另一方面，锥体虽然在6周龄时数量较多，但在10个月后数量减少到正常的20%。对圆锥体的影响b条-波幅更大。尽管6周龄时球果数量较高（WT的70%）b条-在6周到5个月期间，波动稳定在正常值的～20%。
眼底成像显示玻璃体腔中存在致密体街道6−/−突变眼，与PHPV相似。有趣的是，PHPV是啮齿动物胎儿维生素A缺乏综合征中最常见的先天性异常，28,29这也是RARbeta和Raldh3基因敲除小鼠的一个特征。30,31此前有人提出，由Raldh3合成的维甲酸（RA）在腹侧视网膜和RPE中表达，31激活PHPV成纤维细胞中表达的RARbeta，30在胎儿发育过程中控制其正常退化。我们的研究表明，STRA6也有助于PHPV的退化。STRA6参与这一事件很可能是因为它在为RPE和视网膜细胞提供维生素A方面发挥了作用-反式-ROL在这些细胞中的摄入量显著减少，似乎Raldh3在不含STRA6的情况下合成的RA量不足以在原代玻璃体成纤维细胞中适当激活RARbeta，从而阻止其增殖。值得注意的是，尽管RA是防止增殖所必需的，但受损的RA信号不会干扰细胞分化，因为PHPV的细胞会产生黑素细胞，黑素细胞是一种分化的细胞类型，通常来源于眼周间质。30
在视网膜血管造影中，这些PHPV结构由视网膜和脉络膜的血管供血。由于在某些情况下，PHPV结构具有足够的密度来阻挡SD-OCT成像过程中的光路，我们想知道ERG响应的减少是否为零街道6小鼠的部分原因是到达视网膜的光线受到阻碍，而不是由于外节缩短而产生的生理效应。然而，无论PHPV在6周或5个月大时是否存在，与对照组相比，在突变小鼠中观察到的ERG反应总是减少，并且表现出类似的暗视b条-无论PHPV结构是单侧还是双侧，双眼的波幅模式。因此，突变体中ERG反应较低是由于缺乏STRA6引起的视网膜改变和视黄醇摄入减少的直接结果，但与致密结构本身无关。
我们的研究结果清楚地表明，这些突变体中的STRA6缺陷在生理和生化水平上具有显著影响。然而，他们也证明了RPE中没有这种物质并没有完全消除对光的视觉反应。这些观察结果具有有趣的意义，因为众所周知，某些人的功能丧失存在可变性街道6突变，这表现为表型的不同严重程度。也有报道称，当其中一些突变导致基因完全失活时，其后果非常显著，就像完全没有眼睛一样。16–18这种模式并非如此，尽管stra6型基因，这些小鼠表现出与年轻小鼠相似的表型视黄醇结合蛋白4-在正常饮食（维生素A充足）下，缺陷小鼠的视觉反应受损，但在其他方面表现正常。32–34
人们必须问，为什么在STRA6功能异常的情况下，人类和小鼠之间存在这种表型差异。最简约的解释是指物种特定的背景基因差异。其他研究也有这方面的先例。示例包括通用第53页淘汰赛35和眼睛相关美国广播公司4(美国广播公司)淘汰赛，36–38在这种情况下，小鼠的表型并不像人类的表型那样严重，因为相同的基因被破坏了。这些比较告诉我们，当直向同源基因在小鼠和人类中发生突变时，并不总是存在表型相关性，特别是当将小鼠中被破坏的基因与人类中携带点突变的基因进行比较时。此外，人类和小鼠之间的环境影响和视黄醇代谢差异可能不同。
另一个重要的问题是，空白小鼠如何弥补STRA6功能和细胞视黄醇摄入量的缺乏？我们的研究结果清楚地表明，STRA6并不是循环holo-RBP摄取视黄醇的唯一途径。这一点从我们早期的研究中可以明显看出，在这些研究中，我们破坏了爱尔兰共和国有条件地基因表达，并在RPE中观察到少量视黄酯。25因此，必须存在视黄醇摄入的替代机制。在确定STRA6是负责视黄醇摄取的重要膜蛋白之前，文献中提出了几个关于其作用的假设。这些机制包括游离视黄醇通过细胞膜的被动扩散，14,39视黄醇以乳糜微粒的形式通过体循环输送，40以及与megalin作为细胞内完整-RBP受体有关的假定作用（Han等人，未发表数据）。41,42毕竟，它们中的一种或几种可能在这个过程中发挥作用。
总之，我们的研究为研究STRA6在眼部细胞内视黄醇转运中的功能提供了一个有用的小鼠模型。这些小鼠对于缺乏维生素A的研究尤其重要。沿着这些思路，使用该模型的组合基因敲除也将进一步促进我们对RPE中视黄醇贩运机制的理解。
致谢
Scott Fish、Shannan Eddington和Kendal Kernstine提供了专家技术援助。孙慧博士协助批判性阅读手稿。DB是加州大学洛杉矶分校的多利·格林眼科教授。
脚注
由USPHS拨款EY00331和马库拉视力研究基金会拨款支持。STRA6tm 1个小鼠突变株系在法国伊尔柯克的苏里斯临床研究所（ICS）（小鼠临床研究所[MCI]）建立(http://www.ics-mci.fr/)在遗传工程和模型验证部门，由NBG和MM提供资金，他们得到了Inserm、医学研究基金会DEQ20071210544（FRM）和国家研究机构09-BLAN-0286-1（ANR）的支持。
供稿人5NBG和SN的贡献相等。
披露：A.鲁伊斯，无；M.马克，无；H.雅各布斯，无；M.Klopfenstein先生，无；J.Hu（胡锦涛），无；M.劳埃德，无；S.哈比卜，无；C.托沙，无；R.A.半径，无；N.B.盖斯林克，无；S.Nusinowitz公司，无；D.博克，无
工具书类
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