NAD合成酶家族中谷氨酰胺与氨的利用

克隆、异源表达和蛋白质纯化

这个nadE（奈德）编码NADS的基因鼠伤寒沙门氏菌LT2（基因座标签：STM1310，标准_NADS）、野生型和尼特通过聚合酶链反应从基因组DNA中扩增突变株，并将其克隆到pET15b载体中，与N末端His融合₆-标签（Novagen）。一个双基因操纵子嗜热菌HB27编码预测的双成分tt公司_NADS由核心合成酶或S亚基（TTC1538）和假定的谷氨酰胺酶或G亚基（TTC1539）组成，在pET衍生载体中克隆[37]添加他的₆-标记到操纵子第一个基因的N末端。编码S亚基的单个基因tt公司_NADS和mj（百万焦耳）_NADS来自贾纳氏Metanocaldoccoccus jannaschi在同一载体中克隆了DSM（MJ1352）。所有重组蛋白在大肠杆菌BL21/DE3并使用标准方案纯化至同质性，如[38]通常，细胞在LB培养基中生长至OD₆₀₀37°C下约0.8–1.0，由0.2 mM IPTG诱导，在20°C下摇晃12小时后收获。通过Ni-NTA琼脂糖柱层析纯化1-6L培养物中的蛋白质，然后通过HiLoad Superdex 200 16/60柱（Pharmacia）和AKTA FPLC系统进行凝胶过滤。

活性测定和稳态动力学分析

NADS活性的连续测定基于NAD产生（由NaAD和氨或L-谷氨酰胺产生）与其通过醇脱氢酶转化为NADH的酶偶联，并在340nm处监测(ε=6.22米⁻¹厘米⁻¹)如前所述[21]在37°C下，在含有10 mM MgCl的缓冲液中进行比活性测定₂、46 mM乙醇、16 mM氨基脲（或2 mM NaHSO_三如果使用谷氨酰胺），100 mM HEPES，pH 7.5，在所有底物、2 mM ATP、2 mM-NaAD和4 mM NH的饱和浓度下_三（或Gln）。使用基于HPLC的直接测定法来评估热稳定性的底物特异性mj（百万焦耳）_纳德。反应混合物含有100 mM HEPES，pH 7.5，10 mM MgCl₂2 mM ATP、2 mM NaAD（或NaMN）和4 mM NH_三（或Gln）。在70°C下培养30分钟后，使用Microcon YM-10离心过滤器（Amicon）通过微滤去除蛋白质，并在50×4.6 mm C18柱（Supelco）上分析滤液，如前所述[11].

为了确定稳态速率常数，两种底物（例如NaAD和ATP）在饱和浓度下保持恒定，而第三种底物在相关浓度范围内变化（例如氨或谷氨酰胺）。例如，野生型的氨含量范围为0.1至4 mM标准_NadE，突变体为1至40 mM标准_纳德。分三次进行测量，并使用GraphPad Prism软件包将初始速度数据拟合到标准Michaelis-Menten方程，以获得K（K） _米和k个 _猫值。

定量RT-PCR分析

总mRNA从鼠伤寒沙门氏菌使用SV总RNA分离系统（Promega），LT2、nit11和SK51细胞在富含（LB）或最低培养基中加上5–20 mM谷氨酰胺或20 mM氨水培养。DNA酶处理（Promega）后，在随机引物存在下，使用SuperScript II逆转录酶（Invitrogen）进行逆转录。为了检查DNA污染，在没有逆转录酶的情况下进行对照反应。使用SYBER GreenER qPCR超级混合通用（Invitrogen）和表S2NAD合成酶基因短区的扩增(nadE（奈德）)和间隙A这被用作内部标准。扩增条件如下：95℃下15 min；在95°C下30 s，56°C下1 min，72°C下30s，共40个循环，并在Stratagene Mx3000中进行。

一种来自嗜热杆菌(tt公司_NADS）可以利用谷氨酰胺作为氮供体

中的共同表达大肠杆菌形成操纵子的两个基因（TTC1538–TTC1539）嗜热杆菌结果表明，他们的产品编码假定的NADS S-和G-亚单位，形成紧密复合物，并倾向于在Ni-NTA上共同纯化(图3A)和凝胶过滤(图3B)色谱法。SDS-PAGE分析表明其化学计量比为1∶1。该复合物的酶特性证实了其NADS活性以及将氨和谷氨酰胺两者用作酰胺供体的能力。相反，单独的S亚基，当作为单个基因表达和纯化时，仅与氨具有相当的NADS活性(图3C)显示K（K） _米数值非常接近典型的细菌NadE酶[25],[52]值得注意的是，即使对于双亚单位（G/S）酶，底物偏好仍偏向氨而非谷氨酰胺（～50倍），这表明理论上可以同时使用这两种底物体内另一方面，据报道，典型NadE酶对氨的偏好高于谷氨酰胺（例如，NadE的约2500倍来自假单胞菌属。 [25]明显更高。事实上，即使谷氨酰胺的NadE活性很低，也可能是由于其自发水解和/或游离氨的污染。总的来说，获得的结果为预测的C型（可能还有，R型)谷氨酰胺利用NADS酶(图2).

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图3

生物化学特性嗜热杆菌谷氨酰胺酶和NAD合成酶亚基。

Ni-NTA亲和柱（A）和凝胶过滤色谱（B）洗脱组分的SDS页面分析表明，His标记的重组嗜热杆菌NADS和未标记的GAT倾向于共同纯化。（C） 动力学表征嗜热杆菌S-亚单位和G/S复合物。

来自的单域NADS詹纳西伊先生(mj（百万焦耳）_NADS）使用氨作为氮供体

NadE亚家族的成员在古生菌中发现，但迄今为止尚未报道对古生菌代表的NADS酶进行研究。事实上，古生菌中NAD合成酶功能的存在可能受到质疑，因为在所有古生菌（分析的50个基因组中有50个基因组）中，一种典型的细菌NadD酶（将NaMN前体转化为NADS的NaAD底物）被一种远距离同源的NadM所取代。与NadD不同，NadM家族成员（也存在于某些细菌中）可以有效利用酰胺化吡啶核苷酸NMN，从而提供NAD的替代（NADS-独立）途径。例如，在细菌病原体土拉菌中，用NadM替换NadD伴随着NadE同系物作为NMN合成酶（NMNS）的功能适应，仅具有边际NADS活性[11]另一方面，我们报道了古代NadM[12]是一种双功能NMN/NaMN腺苷酸转移酶，至少理论上可以与NMNS或NADS结合使用。例如，双功能NadM与传统（F型）NADS在另一种不寻常的不动杆菌NAD网络中协同作用。[10]为了阐明古代NadE亚家族的功能活性，我们克隆了一个MJ1352基因，并在大肠杆菌中过度表达该基因，该基因编码来自M.jannaschii的假定NADS。以NaAD和NaMN为底物，氨为酰胺供体（4mM），饱和ATP（2mM），评估纯化重组mj_NADS的动力学参数和底物特异性。该分析显示出强大的氨依赖性NADS活性（NaAD 0.13±0.02 mM的Km和0.20±0.01 s−1的kcat）。谷氨酰胺作为酰胺供体时，未检测到明显的NMNS活性和NADS活性。总的来说，该分析证实了古代NadE的分类，以及该亚科的细菌成员，即氨利用型（N型）NADS。

突变型单结构域NADS的动力学性质鼠伤寒沙门氏菌(标准_NADS）与其直接利用氨的生理作用相一致体内

尼特沙门菌尽管氨同化酶水平正常，但之前被描述为氮同化缺陷的突变体[36]，为我们提供了一个有价值的案例研究，以进一步解决体内NadE亚家族的酰胺供体特征。鉴于原始研究中描述的两类突变体，ICR（SK51）或亚硝基胍诱导的突变体(nit11号机组)，在nadE（奈德）基因座，这些突变的确切性质尚未确定。对各自突变基因座的扩增和测序揭示了两种类型的遗传损伤：（i）预测的-35框上游启动子区的单核苷酸（G）缺失，以及（ii）核苷酸143（G到a）的点突变，用Asn取代Ser-84残基(图4A). 因此，报告的NADS活性缺失可能发生在第一类突变的转录水平上，也可能发生在第二类突变的酶性质水平上。事实上，定量RT-PCR证实nadE（奈德）SK51 mRNA水平与nit11号机组或野生型鼠伤寒沙门氏菌(图4B). 重要的是，培养基中增加氨或谷氨酰胺不会对nadE（奈德）mRNA。这表明，观察到的生长表型的抑制不是由于转录水平的调节，而是由于克服了严重抑制的NADS和强大的谷氨酰胺合成酶（GlnA）之间对氮源的竞争。后一种解释与报告的glnA公司突变[36].确定突变的影响nit11号机组野生型酶的功能标准_NADS和S48N突变体在大肠杆菌，提纯，并测定其对ATP、NaAD和NH的表观稳态动力学参数_三(图4C). 野生型酶的动力学参数与报道的非常接近大肠杆菌NadE公司[52]与S48N突变体最显著的差异是在表观K（K） _米氨的值，突变体的氨值高出约70倍标准_NADS与野生型酶的比较。这一发现为观察到的nit11号机组应变，可通过增加介质中氨的浓度进行补偿[36]值得注意的是，突变残基是保守基序的一部分S公司N型ATP焦磷酸酶家族的GGXDST特征[14].基于NadE结构[34]，它位于活性位点附近，这与观察到的对NADS活性的影响一致。

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图4

Nit11和SK51的分析鼠伤寒沙门氏菌突变菌株。

（A） 的示意图鼠伤寒沙门氏菌nadE突变菌株。Nit11突变体的特征是在核苷酸143处发生错义突变，产生氨基酸替代AN。SK51突变体的特点是单核苷酸缺失（位于–51的G被认为是起始密码子的第一个碱基+1），该缺失正好位于启动子-35盒调控区的上游。预测的调控序列显示在底线中。（B） 的相对表达水平nadE（奈德）野生型和两类突变体nit11号机组（S48N）和SK51在四种不同的生长条件下生长：富培养基（1），添加20 mM NH的最小培养基_三（2） ，MM补充5 MM（3）或20 MM（4）谷氨酰胺。（C） 野生型和S48N的动力学特征鼠伤寒沙门氏菌NAD合成酶。通过分光光度耦合（SPEC）分析测量初始速率。动力学参数K（K） _米和k个 _猫是在固定（饱和）浓度的共基质下测定的表观值。对于固定底物，浓度为：2 mM ATP、2 mM NaAD和40 mM NH_三错误表示标准偏差。

因此，突变对酶对氨的亲和力的既定影响以及所描述的各突变菌株的氨依赖性为NadE亚家族的单域NADS酶利用氨而非谷氨酰胺作为酰胺基来源的假设提供了额外的支持体内.

识别与谷氨酰胺利用能力相关的NADS结构元素

上述分类在NADS家族系统发育树上的投影(图5A，有关详细信息，请参阅图S1)显示了覆盖所有酶的三个分支I–III的显著一致性F型虽然分支IV–VII中的大多数NADS序列属于N型，代表C型（和R（右）)在分支IV和V中发现它们相互交织。因此，基于序列区分真正的单组分（氨利用）NADS和双亚单位（谷氨酰胺利用）酶是一个挑战。这一点尤其重要，因为许多基因组包含腈酶家族的遥远代表，其功能尚未分配，可以被视为NADS酶的候选G亚基，目前被归类为N型.

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图5

NAD合成酶家族的系统发育分析。

（A） NAD合成酶系统发育树示意图（完整版本见图S1)基于合成酶结构域构建。NAD合成酶基因的定义类型——“融合”(F型)，“群集”(C型)，“远程”(R型)和“无”(N型)分别以红色、绿色、青色和洋红色突出显示。整个树被拓扑划分为簇，这些簇被指定为I–VII分支。（B） 带有NAD合成酶基因类型映射的物种树示意图（完整版本见图S2). 含有单一NAD合成酶基因的F、N、C和R型基因组分别用红色、绿色、青色和洋红表示。拥有一个以上NAD合成酶基因的基因组分为“多个F”、“多个N”、“单个F-单个N”和“所有其他”基因组组，分别以深红色、深绿色、橙色和黄色突出显示。

为了应对这一挑战，我们旨在确定双组分谷氨酰胺利用NADS酶的假设特征序列元素（基序）特征，将其与单组分氨利用酶区分开来。识别这些基序将有助于概括我们的发现并改进NADS分类。为此，我们将比较序列分析与可用的三维结构数据相结合。NADS系统发育树的七个分支中的每一个都由18个报告的3D结构中的至少一个表示(图5A). 与底物、辅因子和金属离子结合位点有关的关键残基的详细检查[22],[30],[31],[32],[33],[34],[35],[53](表S4)未能识别两组NADS酶之间不同的任何残基：（i）谷氨酰胺利用(F、C型和R（右）)和（ii）氨化(N型)，但在每个组中都是保守的。同样，SDPpred算法中实现的特异性确定位置预测方法不能识别与两组之间的～800分析序列分离显著相关的残基[54]该方法的一个局限性（我们成功地将其用于其他蛋白质家族的功能分类，例如。[55])是指需要消除包含主要差距的不一致区域。对从NADS多重比对中删除的这些区域的检查表明，它们大多属于表面环，通常已知这些表面环积累了频繁的插入和删除[56]有助于蛋白质-蛋白质相互作用界面的适应性进化[57].

我们假设，区分两个NADS基团的结构元素可能位于第一组酶的循环区域内，这些酶负责S-和G-结构域（或亚基）之间的相互作用，并且在单组分酶中没有相应的区域。因此，S域的所有四个结构成分包括与G域的相互作用界面：α9、α18和α20螺旋和扩展的C端环（如原始定义结核分枝杆菌NADS结构，图6)，似乎在其他报道中扮演同样的角色F型NADS结构来自hutchinsonii噬细胞菌（PDB:3ILV），以及阿维链霉菌（PDB:3N05）。氨基酸序列的各个区域在系统发育树覆盖的所有三个分支（I–III）中都是保守的F型酶。另一方面，这些结构元素中的两个，α18螺旋和C末端环，在所有五个报告的3D结构中都不存在，主要分支VI代表N型单域酶，包括标准_全国广告标准。重新构建以包含所有可变区域的多重路线确认此分支的所有代表中都不存在这些结构元素(表2和图S2). 在这两种元素中，在分支IV和V的三个报告的3D结构中可以检测到α18螺旋。然而，这些结构都不包括C末端环。完整的多重比对表明，后者是区分这两个分支（例如tt公司_分支机构IV中的NADS）mj（百万焦耳）_NADS在以古生物为主的V分支中，参见图S3).

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图6

来自结核分枝杆菌.

大多数相互作用残基存在于以下结构区域，即α9、α18螺旋和延伸的C末端环，分别以粉红色、绿色和黄色突出显示。

总的来说，上面列出的所有签名元素都必须存在（参见表2)作为区分所有三种双组分酶和单组分酶的必要和充分要求，几乎所有分析序列都得到了确认。仅有的两个例外是来自藻酸弧菌和油酸硫球菌（分别为第六和第七分支）最初分类为R型基于各自基因组中存在假定的G亚单位同源基因。

我们要感谢加州大学伯克利分校的西德尼·库斯图博士鼠伤寒沙门菌突变菌株。