这个第8路基因突变Crb1号机组基因存在于C57BL/6N小鼠和胚胎干细胞的供体系中，并混淆了眼部诱导的突变表型

细胞和试剂

小鼠ES系R1、W4和JM8.N4来自NEI遗传核心。我们研究中的ES细胞在没有饲养细胞的情况下培养数月（至少3代）。用于衍生ES细胞系SCC1O、B6-Blu、B6-GFP、EDJ22、R1和SCC10的小鼠菌株在华盛顿大学医学院的Siteman癌症中心进行了测试。通过标准方案制备DNA，并对样本进行基因分型第8版PCR突变。

用PCR检测rd8突变

使用Qiagen Biosprint仪器、Qiangen试剂（加利福尼亚州巴伦西亚Qiange Inc.）和制造商建议的方案从小鼠尾部活检样本中分离DNA。从尾部活检中分离的DNA样本分别扩增为野生型(重量)等位基因和突变体第8版使用Mehalow等人指定的引物的等位基因。²包括引物序列mCrb1型mF1：GTGAAGACACTAGTCTCTGATC；mCrb1 mF2：GCCCCTGTTTGCATGGAGAAACTTGGAAGACACTAGTTCTTCTG；和mCrb1毫瓦：GCCCCATTTGCACACTGAC。对于PCR扩增，在25μL反应体积含1.5 mM MgCl₂, 100μ每个dNTP的M，1.6μM正向和反向底漆重量等位基因和0.8μM of forward和1.6μM反向底漆第8版突变等位基因和0.025U AmpliTaq DNA聚合酶。反应最初在94°C下变性5分钟，然后在94°C下变性30秒、65°C下变性30秒、72°C下变性30秒，最后在72°C下延伸7分钟。使用3%Nusieve 3:1（Lonza，Rockland，ME）琼脂糖凝胶分离扩增子，并在用溴化乙锭染色后在紫外光下观察。放大器尺寸为重量等位基因=220 bp和第8版等位基因=244 bp。采用TaqMan等位基因判别法对NEI基因核心的ES细胞进行基因分型，共有PCR引物序列CCCTGTGCATGGAGAAA（正向）和CCTGACCATCCCGAGAGACA（反向），等位基因特异性探针序列为[6FAM]AGCTACGTTATCCGG[MGBNFQ]（野生型）和[VIC]CAGCTACGTTATGGT[MGFQ](第8版). 利用制造商指定的协议，在运行SDS 2.3软件的Applied Biosystems（加利福尼亚州卡尔斯巴德）7900HT上进行等位基因识别分析。请注意，这两种方法的引物序列不同。

用于rd8-相关核苷酸缺失检测的DNA测序

用引物GGTGACCAATCTGGACATCC（正向）和GCCCCATTTGCACACTGACTGAC（反向）对C57BL/6J（JAX）和C57BL/6N（DCT）小鼠的尾部DNA进行PCR扩增，并用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）对产物进行纯化。将两个样品和两个PCR引物送往ACGT Inc.（Wheeling，IL）进行双向测序。使用MegAlign程序（威斯康星州麦迪逊市DNAStar）对部分序列进行比对。

眼底摄影和光学相干断层成像（OCT）

用200–300μL的氯胺酮（7.7 mg/mL）和二甲苯嗪（0.45 mg/mL）混合物对小鼠进行全身麻醉，并局部用0.5%盐酸丙卡因（德克萨斯州沃思堡Alcon Labs公司）对小鼠进行麻醉。用0.5%托吡卡胺滴眼液（纽约州罗切斯特市博士伦公司）和2.5%盐酸苯肾上腺素滴眼液扩张瞳孔，定期使用无菌润滑剂GenTeal severe（纽约州诺华公司）保持角膜湿润。眼底照片是使用Micron-2相机（加利福尼亚州普莱森顿凤凰研究实验室公司）使用StreamPix 5软件拍摄的。

为小动物成像设计的超高分辨率光谱域光学相干断层成像（SD-OCT）系统（Bioptigen，Research Triangle Park，NC）用于小鼠视网膜的体内成像。每次B扫描1000个A扫描获得1.4 mm线性扫描。

存在第8版晚期黄斑变性（AMD）样表型小鼠的突变

2007年，我们中的一个（CCC）在Ccl2公司^−/−Cx3cr1型^−/−老鼠。⁷这些小鼠是通过交叉单个基因敲除产生的Ccl2公司^−/−4和Cx3cr1型^−/−5菌株，均具有1岁时出现的AMD样特征。这个Ccl2公司^−/−Cx3cr1型^−/−双基因敲除小鼠出现眼点的眼底镜观察(图2A） 早在6-8周龄时进行组织学检查，发现视网膜病变(图2B） ●●●●。在探索疾病机制的过程中Ccl2公司^−/−Cx3cr1型^−/−我们其中一个（TAF）的老鼠Ccl2公司^−/−Cx3cr1型^−/−线与其他几条鼠标线交叉（B6-gld公司，B6-投标^−/−和B6-小径^−/−)研制三重敲除小鼠。在这个过程中，产生了一些杂合子同卵对照(表2). 重大疾病(图2A、 2B），这与基因型无关。更完整的鼠标线列表如所示表2，其中疾病与第8版突变。应注意，回传Ccl2公司^−/−Cx3cr1型^−/−C57BL/6J背景下的小鼠(重量在Crb1号机组基因座）在12周时检测出无病小鼠。

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图2。

AMD样小鼠的眼部发现。(A类)选定小鼠的眼底照片显示了典型的第8版表型。所有基因型小鼠第8行/第8行外观相似，而重量/重量小鼠与Ccl2公司^−/-Cx3Cr1型^−/-全球导航系统展示了老鼠。(B类)选定小鼠的组织学发现第8行/第8行和重量/重量老鼠。注意视网膜折叠、核层发育不良、视网膜变性和RPE空泡化。这种类型的病变在检查的眼睛中是典型的局灶性病变。

这个Ccl2公司^−/−Cx3cr1型^−/−小鼠来源于Ccl2公司^−/−（摘自马萨诸塞州波士顿哈佛医学院儿童医院的Bao Lu和Barrett J.Rollins）⁴和Cx3cr1型^−/−（摘自马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所的Philip Murphy）。⁵值得注意的是，创始人Cx3cr1型^−/−小鼠已从DCT繁殖到C57BL/6N小鼠13代Ccl2公司^−/−在我们收到C57BL/6N小鼠之前，创始小鼠已被培育为从CRL获得的C57BL/6N小鼠，培育了6-7代（Philip Murphy和Bao Lu，个人通信）。对这些亲本系的分析(表2)透露出Ccl2公司^−/−小鼠或是杂合子第8版突变或野生型Crb1号机组轨迹。全部Cx3cr1型^−/−亲代小鼠为纯合子rd8型有趣的是，只有50%Cx3cr1型^−/−小鼠在6周时出现视网膜病变，无Ccl2公司^−/−小鼠在6周龄时出现视网膜病变。该分析表明第8版突变很可能是在产生单基因敲除小鼠的过程中进入这些小鼠系的。此外，与上述B6-HLA-A-29转基因小鼠一样，单基因敲除小鼠的病理特征Ccl2公司^−/−,Cx3cr1型^−/−，在双淘汰赛中Ccl2公司^−/−Cx3cr1型^−/−老鼠，要么依赖第8版或被这种突变的存在所修饰。

C57BL/6供应商生产线中存在rd8突变

根据上述数据，似乎不太可能第8版在不相关的HLA-A29转基因和Ccl2公司^−/−Cx3cr1型^−/−双击鼠标线。相反，来源更有可能是遗传史上常见的小鼠菌株。虽然不可能追踪到所有相关菌株的完整谱系，但我们确实拥有HLA-A29 Tg系的完整系谱，该系是在家中开发的，并在创始者中检测到rd8的存在。因此，我们认为检测视觉研究中使用的许多转基因和敲除小鼠祖先共有的菌株是合理的。我们从主要供应商处获得C57BL/6小鼠，包括HSD、DCT、CRL和TAC。这些供应商都维护C57BL/6N子串，该子串是1951年后从20世纪早期JAX维护的C57BL/6J派生而来的^第个世纪。⁸我们还从JAX获得了C57BL/6J和C57BL/10J小鼠。基因分型显示，无论是哪家供应商，C57BL/6N子串均携带第8版基因(图3A） ，而C57BL/6J和C57BL/10J在铬b1轨迹。通过测序确认C57BL/6N中发现的突变的位置和身份Crb1号机组基因，显示C57BL/6N小鼠系中的预期缺失(图3B） ●●●●。眼底和组织学检查显示，来自所有四家供应商的C57BL/6N小鼠表现出典型的第8版不同程度的病变，早在6周龄时就已发育良好(图4A–D）。值得注意的是，与对照组一样，C57BL/6J小鼠表现正常第8版阴性C57BL/10J小鼠(图4E、 4F）。对患眼进行组织学检查，发现典型病变为非炎症性视网膜变性，涉及内核层和外核层、外丛状层以及感光细胞外节段(图4G） ●●●●。

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图3。

rd8基因分型。(A类)供应商小鼠的PCR基因分型第8版条带通过毛细管电泳进行解析。小鼠来自HSD、DCT、CRL、TAC和JAX。基因分型第8版通过PCR进行。图中显示了在两次单独装运中从每个供应商处获得的7只具有代表性的老鼠中的两只。(B类)的排序Crb1号机组该基因在N子串中的对齐序列中的预期位置显示出一个单碱基缺失（MegAlign程序）。用正向引物测序N-MF，N子串；用反向引物测序N-MR，N亚序列；用正向引物测序J-MF、J亚基；用反向引物对J-MR、J亚序列进行测序。

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图4。

供应商C57BL/6N小鼠（而非C57BL/6J小鼠）有眼底病变。(A类–E类)基因分型显示的小鼠眼底照片图3从指定供应商处获得的。图中所示为在两次单独装运中从每个供应商处获得的7只代表性鼠标中的一只。注意，除C57BL/6J外，所有小鼠均有不同程度的斑点状病变。(F类)以眼底正常的C57BL/10J小鼠为对照。(G公司)组织病理学。所示为与正常JAX C57BL/6J小鼠相比，受影响的DCT和CRL C57BL/6N小鼠的眼部切片。注意箭头标记的视网膜病变。其他病变阳性小鼠的组织学看起来基本相同。

法国兰斯51100号的雅克·科恩-兰斯香槟-阿登大学共享HLA-A29结构。我们感谢Jackson实验室（ME Bar Harbor）的Bo Chang对HLA-A29系小鼠进行基因分型。我们感谢Phyllis Silver（免疫调节科，LI，NEI）对HLA-A29和小白鼠进行了眼底检查，并感谢Michael Casey（华盛顿大学眼科和视觉科学系分子遗传学核心实验室）对Ccl2公司^−/−和Cx3cr1型^−/−老鼠。密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院Siteman癌症中心ES细胞核心实验室的Timothy Ley和Jacque Mudd提供了DNA样本，NEI基因工程核心的成员，特别是刘平湖，进行了ES细胞DNA测试。