组织谷氨酰胺转胺酶不影响小鼠纤维化基质的稳定性或肝纤维化的消退

摘要

简介

肝硬化是多种慢性肝病的结果，其发病率和死亡率都很高¹晚期纤维化和肝硬化的因果治疗不令人满意或效率低下。因此，迫切需要抗纤维化治疗来治疗和逆转纤维化²虽然大多数抗纤维化策略是针对肝星状细胞/肌成纤维细胞（统称为HSC）增殖和促纤维化激活^三，只有少数较小的研究针对细胞外基质（ECM）的稳定，主要是胶原蛋白的交联。

在成功治疗特定慢性肝病的潜在病因后，以治疗性地靶向纤维化ECM稳定过程确实是诱导纤维化退行性甚至可逆性的一种非常有吸引力的方法。在体内，纤维化ECM的稳定是通过大量I、III和V型胶原（纤维）的交联实现的，这些胶原可代表50%以上的纤维化肝组织⁴以及其他ECM分子，如弹性蛋白和纤维连接蛋白。胶原和弹性ECM的稳定可以通过三个不同的过程发生：赖氨酰氧化酶或转谷氨酰胺酶（主要是组织转谷氨酰胺酶TG2）的酶促作用，或由年龄和高血糖通过非酶促糖化和脂质过氧化驱动。赖氨酸氧化酶（LO，EC1.4.3.13，由液氧基因⁵)氧化肽基赖氨酸的侧链，导致α-氨基己二酸-δ-半醛的残留，从而使胶原蛋白和弹性蛋白的组成链共价交联⁶转谷氨酰胺酶家族（EC2.3.2.13）由8个家族成员组成（TG1-7和因子XIII⁷)其中TG2是最广泛表达和最丰富的酶。TG2和大多数其他家族成员催化具有特定谷氨酰胺残基的供体蛋白和更普遍的受体蛋白之间形成ε-（γ-谷氨酰）赖氨酸异肽交联。TG2催化的一些ECM谷氨酰胺受体蛋白的异肽键形成已被描述，即几种胶原蛋白（通过其末端肽延伸）、III型前胶原（通过N-前肽）、巢蛋白和纤维连接蛋白⁸转谷氨酰胺酶，尤其是TG2，与多种人类疾病有关^9,10、伤口愈合和纤维化¹¹，并代表了很有前景的药理靶点。

TG2在各种病因的人类肝纤维化和肝硬化中过度表达，在肝瘢痕组织中可以检测到谷氨酰胺转胺酶催化的ε-（γ-谷氨酰）赖氨酸异肽交联¹²这些发现与描述性结果一致体内CCL4诱导大鼠肝纤维化的数据表明，脱毒后晚期纤维化的有限可逆性可以用TG2介导的胶原交联来解释¹³此外，在体外TG2介导的交联可以使I型胶原蛋白抵抗胶原酶的作用。因此，在重组TG2存在下，真皮成纤维细胞通过间质胶原酶（MMP-1）分泌的I型胶原蛋白的裂解减少了50%¹⁴TG2交联大鼠尾I型胶原增加了其对MMP-1和MMP-2蛋白水解降解的抵抗力¹⁵.

然而，虽然TG2参与促进纤维化并限制其可逆性是合理的，但TG2对纤维化ECM稳定或肝纤维化可逆性的贡献体内尚未在功能研究中涉及。自从谷氨酰胺转胺酶抑制剂，包括TG2特异性药物，已经被开发用于治疗乳糜泻¹⁶TG2作为纤维化肝病患者相关抗纤维化药物靶点的验证备受关注^三.

在本研究中，我们重点关注TG2在稳定纤维化ECM和肝纤维化可逆性中的作用体内试验。首先，我们对两种小鼠肝纤维化模型中TG2的表达和活性与纤维化进展和阶段、胶原积累和ECM转换的关系进行了表征体内试验。其次，我们使用逐步胶原蛋白提取定量评估ECM稳定性的动态变化。最后，我们通过比较TG2−/−小鼠及其野生型同窝小鼠，研究了TG2缺乏如何影响ECM稳定性和纤维化可逆性。

材料和方法

动物实验

TG2缺乏小鼠如前所述生成和表征¹⁷并回交到C57Bl/6J背景（Jackson Labs，Bar Harbor，ME）12代。

动物以12小时的明暗循环饲养，并喂食标准啮齿动物食物和自来水随意使用TG2−/−群体中年龄和性别匹配的野生型同窝小鼠和从Jackson Labs（ME Bar Harbor）购买的野生型C57Bl/6J小鼠作为对照。在我们群体和Jackson（未显示）的对照组之间，未发现纤维化易感性的差异。动物实验已获得IACUC机构的批准（BIDMC，协议号158-2008）。

肝毒素诱导的肝纤维化通过慢性注射四氯化碳（CCL4）或硫代乙酰胺（TAA）在7-8周龄小鼠中诱导，并在停药后短期（4周）和长期（8-36周）监测自发恢复。首先，通过比较i/p注射与口服灌胃以及恒定剂量与递增剂量方案对肝胶原积聚的影响，在一系列先导性实验中确定了诱导纤维化的最佳给药方案（CCL4和TAA）。在野生型C57Bl/6小鼠中，恒定的肝毒素剂量（CCL4为1.75ml/kg，TAA为200mg/kg）和少于每周3次注射均不足以诱导显著的肝纤维化，导致肝羟脯氨酸增加不到2倍（未显示）。灌胃和注射递增剂量的CCL4均导致6周内出现晚期肝纤维化（与大鼠模型相比，肝羟脯氨酸增加≥4倍¹⁸)但治疗6周后，由于频繁的腹膜粘连、载体（油）积聚和腹腔炎症浸润，i/p途径被放弃。根据递增剂量方案（第一次剂量为0.875ml/kg；第1-3周为1.75ml/kg；第4-6周为2.5ml/kg；第7-12周为3.25ml/kg），以矿物油形式口服CCl4，每周三次，持续12周。或者，通过增加i/p TAA的剂量6周（第一次剂量100mg/kg，第1-2周，200mg/kg；第3-4周，300mg/kg；4-6周，400mg/kg）来诱导纤维化。除非另有规定，否则在最后一次施用CCL4或TAA后的3天内处死小鼠。在献祭时称量肝脏和脾脏的重量，并冰冻肝脏进行进一步分析。

肝脏胶原蛋白含量如前所述，在110°C的6N HCl中水解16h后，在两个不同肺叶的300-400mg肝样品中测定为相对羟脯氨酸（μg/g肝）¹⁸.根据单个肝脏重量和相应的相对羟脯氨酸含量计算总羟脯氨酸（mg/整个肝脏）^18,19.

细胞外基质稳定性通过从速冻肝脏中连续提取胶原蛋白，通过完整的胶原蛋白分馏进行生化评估。胶原在ECM中的溶解度与交联程度呈负相关²⁰为了表征和量化胶原蛋白ECM的稳定性，我们使用中性盐（新鲜分泌的胶原蛋白和前胶原蛋白）、乙酸（更成熟的胶原蛋白）和酸性胃蛋白酶（纤维性、中度交联胶原蛋白）从肝脏逐步溶解胶原蛋白，如我们之前所述^21,22并在中进行了总结图2A简单地说，将1g速冻肝脏（每组3个样品，每个样品取自2-3个单独肝脏）在20ml中性盐缓冲液（0.5M NaCl，0.05M Tris，pH 7.5，含Complete™蛋白酶抑制剂，Roche）中均质，并在4°C下在旋转摇床上培养过夜。24.000g离心30min后，收集上清液进行胶原蛋白测定（A组分：中性盐溶性胶原蛋白）。用20ml 0.5M乙酸（B组分：酸溶性胶原蛋白）提取所得颗粒，然后用胃蛋白酶（2mg/ml溶于0.5M乙酸，C组分：胃蛋白酶溶性胶原酶）提取。剩余的不溶性部分D代表成熟的高度交联胶原蛋白。每个部分在6N HCl中水解，在氮气下蒸发浓缩10倍，并通过羟脯氨酸测定用于量化胶原蛋白含量（见上文）。用新鲜缓冲液反复提取，第一步提取的胶原蛋白少于2%，证明了提取的有效性。计算每个组分中胶原蛋白的百分比，作为所有组分中测定的总羟脯氨酸的组分。所有组分中胶原蛋白的回收率通常大于平行样品中测定的总组织含量的90%。

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图2

胶原溶解度分析表明肝纤维化进展过程中纤维化ECM的交联增加

A） 通过用中性盐、乙酸和胃蛋白酶连续隔夜提取，从1g肝组织中溶解肝胶原蛋白，并通过羟脯氨酸测定对每个组分中的胶原蛋白含量进行生化定量，如M&M中详细描述的那样（0=健康肝脏；1,3,6,12=分别在CCL4治疗后1、3、6、12周出现纤维化肝脏）。数据表示每棒3个样本的平均值±SEM（每个样本来自2-3个肝脏，用于提取和分析）。***，与健康对照组相比，使用ANOVA和Dunnet后验分析p值>0.0001。

组织转谷氨酰胺酶活性如前所述，使用生物胺戊胺掺入试验在肝匀浆中测定²³，进行了修改。简单地说，用N，N-二甲基酪蛋白（Sigma C9801；10μg/ml溶于50mM Tris，0.15M NaCl，5mM EDTA，pH 7.5）在40°C的96 well板上涂敷16 h，然后用PBS/0.1%吐温进行3个洗涤步骤。如前所述表达和纯化的人重组TG2²⁴（1-100ng），或将肝匀浆（5μg/孔）添加到反应缓冲液（50mM Tris，0.15M NaCl，5mM CaCl₂，5mM DTT，0.1%吐温，pH 7.5），然后立即添加4μM生物胺戊基胺（Pierce Nr 21345），并在室温下培养2-4小时。使用50μl辣根过氧化物酶偶联链霉亲和素（Sigma S 2438，在PBS/0.1%吐温中）和50μl四甲基联苯胺底物，在630nm处检测，定量生物胺戊基胺并入二甲基酪蛋白。

结果

TG2表达和活性的增加与小鼠实验性肝纤维化的进展平行

先前的横断面研究表明，患有肝纤维化的人TG2 mRNA和活性增加¹²在C57Bl6小鼠慢性CCL4注射导致的进行性肝纤维化模型中，我们进一步描述了TG2基因表达和活性与纤维化阶段和纤维化发生活性的动态变化。CCL4给药的优化方案和递增剂量方案（见方法）导致了强劲的胶原沉积和进行性纤维化，无论是在生化上还是在组织学上都可以检测到羟脯氨酸的增加，都是在纤维化阶段。纤维化的特征是初期的第1周（根据Metavir:1.98倍胶原蛋白增加），适度的第3周（F2期平均胶原增加3.44倍），先进的第6周（F2-F3期：胶原蛋白增加4.56倍）和早期肝硬化第12周（F3-F4:6.21倍胶原蛋白增加）(图1A、B和表1). 脾肿大是门脉高压的间接测量值，从第6周开始出现（脾脏重量98.6±0.5mg），12周时达到144.7±1.2mg，而健康对照组为76.4±0.3mg（p<0.0001）。TG2 mRNA在1周后升高了3倍，并在12周内保持升高2倍(图1C). 在纤维化诱导期间的任何时间点，总转谷氨酰胺酶（转酰胺酶）活性均适度升高（与正常对照组相比，在第3周时高达1.5倍，图1D). 此外，TG2 mRNA与常用的纤维生成活性标记物有很强的相关性（p>0.001），比如前胶原的转录本α1（I）（COL1A1）mRNA（瘢痕组织中存在的主要胶原链，r=0.8735在皮尔逊测试中，图1E)TGFβ1（主要促纤维化细胞因子，r=0.8639，未显示）和α-SMA（肝星状细胞活化标记物，r=0.8954，未显示）。

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图1

在进行性CCL4诱导的肝纤维化中，转谷氨酰胺酶的表达和活性升高，并与纤维化活动相关

A） 通过肝脏羟脯氨酸进行生化测定，在CCL4治疗后1、3、6和12周，C57Bl/6小鼠的肝脏总胶原蛋白含量逐渐增加。B） CCL4治疗后1周、3周、6周和12周肝脏典型切片结缔组织染色（天狼星红）的低倍图像（原始放大倍率，x50）。C） TG2mRNA表达的时间过程，其中D）与COL1A1（1型前胶原）mRNA强烈相关（Pearson检验）。通过定量RT-PCR测定肝脏转录水平，并在归一化为β2MG mRNA后以任意单位表示（与对照组相比增加了倍）。（E）肝匀浆中的总谷氨酰胺转胺酶活性。所有数据均为平均值±SEM（n=6-8每巴）*，与经溶媒处理的对照组（Ctrl）（ANOVA）相比p<0.05。

表1

如M&M所述，C57Bl/6小鼠经胃灌胃递增剂量CCL4治疗后，肝/脾重量和肝胶原蛋白含量的变化。肝脏和脾脏重量在牺牲时测量，胶原蛋白沉积在生化上测定为相对（μg/g）羟脯氨酸（HYP）来自两个不同叶的250mg肝脏样品中的含量。根据单个肝脏重量和各自的相对HYP值计算总HYP（mg/整个肝脏）。Ctrl：非纤维化对照组（n=6），仅接受载体（矿物油）；CCL4：用CCL4治疗1、3、6和12周的纤维化小鼠。数据表示为平均值±SEM。

组	肝脏重量，g	脾脏重量，mg	相对HYP， 微克/100毫克	总HYP，μg/肝
Ctrl键，n=6	1.30±0.04	76.38±3.08	13.50±0.96	178±17.34
CCl4，1w，n=7	1.60±0.05*	90.86±5.60	22.15±0.37*	353±10.29*
CCl4，3瓦，n=7个	1.77±0.11*	88.43±4.06	34.87±1.59*	612±36.36*
CCl4，6w，n=7	1.78±0.04*	98.57±4.79*	45.57±0.92*	811±28.32*
CCl4，12瓦，n=6	2.05±0.06*	144.70±11.50*	54.00±2.48*	1107±58.46*

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^*与Ctrl相比，p<0.05（ANOVA和Dunett后验）。

TG2缺乏在肝毒素诱导的肝纤维化短期恢复期间不促进胶原蛋白的清除

接下来，我们讨论了TG2表达和活性的缺乏在自发恢复过程中对纤维化ECM的特性有多大影响，以及一旦消除促纤维化刺激，该基质是否更容易降解和移除。按照先前确定的CCl4治疗6周后(图1)，将TG2−/−和TG2+/+小鼠的“纤维化峰值”组和健康对照组（Ctrl，仅接受载体）处死，并评估纤维化程度。在另一组纤维化小鼠中停止注射CCL4，这些小鼠可以再恢复4周（“恢复”组），无需任何进一步治疗。野生型和TG2−/−小鼠在CCL4治疗6周后发展为晚期桥接性纤维化，根据生化定量和组织学评估，TG2−/−鼠的总胶原蛋白含量略高（10%）（不显著）(图3,补充表2)与早期报告中的组织学证据一致²⁶在硫代乙酰胺（TAA）诱导的肝纤维化的不同机制模型中证实了TG2−/−小鼠体内沉积更多胶原蛋白的趋势（与野生型小鼠相比，胶原蛋白的相对含量和总含量高15%，不显著，补充表2). TG2−/−和WT小鼠恢复4周后，炎症浸润几乎完全消失（未显示），促纤维化基因表达正常(图3C). 这与肝脏组织学的显著改善有关，主要表现为肝细胞再生和从毒性损伤中恢复（空泡化和嗜酸性细胞坏死减少）(图3B，E)根据我们和其他人之前对大鼠和小鼠的观察^13,18α-SMA阳性细胞的数量在纤维化高峰期显著增加，并在恢复4周后恢复到几乎正常的水平，代表了大量活化的肌成纤维细胞，野生型和TG2−/-小鼠与纤维化模型之间没有显著差异(补充图2). 值得注意的是，野生型或TG2−/−小鼠从CCL4或TAA诱导的纤维化中恢复4周后，总胶原蛋白含量没有降低(图3A、D).

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图3

CCL4或TAA诱导的晚期肝纤维化野生型和TG2−/−小鼠短期恢复后缺乏自发纤维化回归

在CCL4（A）或TAA（D）诱导6周纤维化高峰时，以及TG2−/-（开放栏）小鼠及其野生型同窝鼠（封闭栏）恢复4周后，通过肝羟脯氨酸进行生化测定的肝胶原蛋白总含量。B） CCL4（B）或TAA（E）治疗6周后以及自然恢复4周后的肝脏代表性切片结缔组织染色（天狼星红）的低倍图像（原始放大倍数×50）。C） 恢复4周后，促纤维蛋白原基因表达正常化。通过定量RT-PCR测定1型前胶原（COL1A1）、转化生长因子β1和TIMP-1的肝转录水平，并在β2MG mRNA标准化后以任意单位表达（与对照组相比增加了倍）。所有数据均为平均值±扫描电镜（n=6-8，每bar）*，与相应基因型的载体对照组（Ctrl）相比p<0.05。#，与纤维化对照组相比，p<0.05（ANOVA）。

在肝毒素诱导的肝纤维化的长期恢复过程中，TG2缺乏不利于胶原蛋白的清除

为了排除4周的恢复不足以明确证明缺乏晚期纤维化解决的可能性，我们将CCL4诱导的纤维化小鼠的恢复期延长至36周。长期恢复的同时，从恢复12周开始，肝脏相对胶原含量（每克组织的数量）显著降低（与纤维化峰值相比，TG2−/-小鼠在12周时约为26%，WT小鼠在24周时约23%）。然而，当将总胶原蛋白含量计入单个肝脏重量时，无论基因型和恢复至36周的持续时间如何，减少均不显著(图4C). 因此，即使在恢复36周后，WT和TG2−/−小鼠的每个肝脏的平均总胶原蛋白含量也分别减少了约12.7%和约7.4%，在任何组中都没有达到统计意义。这与我们之前在TAA诱导的纤维化大鼠模型中的观察结果一致，该模型在恢复8周时检查肝脏¹⁸因此，相对胶原蛋白含量的减少明显是由于肝细胞再生以及损伤停止后肝质量的增加(图4)并不是由于真正的纤维溶解，因为相对胶原蛋白含量减少23-26%，而肝脏重量相应增加18-20%(图4C,补充表3). 结缔组织染色的彻底检查在显微镜下证实了这一点，显示在36周的恢复后，整个肝实质内纤维胶原沉积持续存在，现在纤维间隔以前的位置更松散(图4D). 有趣的是，一个常见的发现是，“侵入”的肝细胞导致纤维化间隔的消散和变宽，将其分裂成多股较细的纤维，形态分析也证明了这一点(图4E、F). 这一点在两种基因型中早在纤维化诱导4周时就很明显，在CCL4停用后36周内进一步增加(图4E)和进展期人类纤维化中描述的纤维化肝重塑特征非常相似²⁷.

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图4

患有CCL4诱导的晚期肝纤维化的野生型和TG2−/−小鼠在长达36周的长期恢复后缺乏显著的胶原蛋白去除

野生型（封闭栏）和TG2−/−（开放栏）C57Bl/6小鼠在CCL4诱导6周纤维化高峰以及恢复8、12、24和36周后的相对（A）和总（B）肝胶原含量，通过肝羟脯氨酸进行生化测定。C） 恢复期肝脏体积的代偿性增加与牺牲时肝脏重量测量的肝胶原蛋白相对含量而非总含量的减少相一致。所有数据均为平均值±SEM（每根钢筋的n=6-10）。D） CCL4治疗6周和自然恢复36周后肝脏代表性切片的胶原蛋白（天狼星红）高倍图像（原始放大倍数×200）。E） 肝细胞侵入纤维化间隔是长期恢复期间观察到的一个特征性特征（显示恢复8周后的WT小鼠，原始放大倍数如图所示）。F） 恢复期瘢痕组织重塑的形态计量学分析表明，间隔变宽，浓缩的胶原束分裂为较薄的纤维。使用目镜测微计在×200放大倍数下进行测量。在纤维化高峰和4周后恢复正常时，从左右肝叶和4只小鼠/组的标本中随机选取至少10只完整纤维化间隔，在其中三分之一的外边界处评估间隔厚度和纤维数量，与相应基因型的载体对照组（Ctrl）相比，p<0.05。#，与纤维化对照组相比，p<0.05（ANOVA）。

纤维化基质的稳定性在进展或恢复过程中不受缺乏TG2的影响

最后，我们定量评估了TG2缺乏在CCL4诱导的肝纤维化进展和恢复过程中对纤维化基质稳定的影响，如上文所述。在纤维化进展的几个时间点，野生型和TG2−/−小鼠之间的胶原蛋白提取率没有差异，包括不溶性、高度交联的瘢痕胶原蛋白。有趣的是，恢复36周后，野生型和TG2−/−小鼠的不溶性胶原蛋白百分比（分别为24.3%和21.4%）略高于纤维化峰值（分别为19.69%和16.69%）。这可能表明，在消除纤维原性刺激后，ECM的稳定过程并没有停止（或逆转），但即使在没有TG2的情况下，也会继续，尽管速度要慢得多(图5)需要更多的研究来证实这一观察结果。

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图5

tTG基因缺失不会影响无纤维化小鼠、晚期纤维化小鼠或长期恢复后胶原的溶解度

如M&M中所述，通过连续提取肝组织和定量提取每个部分中的胶原蛋白，在TG2−/−小鼠（开放栏）和野生型对照组（封闭栏）中测定了纤维化ECM溶解度。仅显示了定量相关的胃蛋白酶可溶性和不溶性部分。Ctrl，车辆创建的非纤维化控件。“纤维化”，纤维化小鼠处于纤维化高峰（CCL4治疗6周）。“恢复”，CCL4治疗被停止，纤维化小鼠被允许再恢复36周。在盐溶性和酸溶性组分中未发现基因型或处理之间的差异，这些组分占总胶原蛋白的5%以下（未显示）。数据表示每棒3个样本的平均值±SEM（每个样本均来自2-3个肝脏，用于提取和分析）。

讨论

组织转谷氨酰胺酶（TG2）因其在纤维化中起重要作用(在体外)活性交联纤维化基质中的胶原，从而限制纤维化的可逆性。体内证据基于检测人类纤维化肝脏中ε-（γ-谷氨酰）赖氨酸异肽交联¹²和啮齿动物¹³在我们的研究中，我们描述了进展性肝纤维化中ECM（胶原蛋白）稳定性的动态变化，并直接探讨了TG2（主要的肝转谷氨酰胺酶亚型）在纤维化进展和纤维化逆转期间对胶原蛋白稳定的功能贡献体内使用TG2基因缺失小鼠。通过连续提取胶原蛋白对纤维化细胞外基质稳定性的分析表明，不可逆的胶原蛋白稳定是进行性纤维化的特征，胃蛋白酶不溶部分显著增加，伴有TG2活性和mRNA表达增加。然而，尽管TG2的表达和活性在纤维化过程中增加，并与纤维化基因的转录水平密切相关，但TG2缺乏对纤维化ECM的稳定性或肝纤维化的可逆性没有明显影响体内在两种肝毒素诱导的模型中。因此，与人们普遍认为的相反，TG2介导的交联似乎在功能上无助于肝纤维化的胶原稳定和不可逆性。

靶向ECM稳定性是治疗纤维化的一个很有吸引力的策略，并且在根本原因消除后增加其可逆性^三虽然这一领域大部分尚未探索，但有孤立的报告支持阻断翻译后胶原修饰的潜在益处。因此，早期的研究表明，服用β-氨基丙腈（BAPN）可不可逆地抑制赖氨酰氧化酶依赖的胶原交联，可能缓解肝硬化的发展²⁸并部分防止慢性CCL4给药的纤维化大鼠通过直接流变仪测定的肝硬度增加²⁹有趣的是，当原发性肝肌成纤维细胞（肝脏中主要的成纤维效应细胞）被培养在硬度增加的人造基质上时，纤维基质硬度本身被认为依赖于胶原交联，已被证明可以直接激活原发性肝脏肌成纤维纤维细胞³⁰此外，还证明缺乏ADAMTS2的小鼠，该蛋白酶通过从I型、II型、III型和V型前胶原中裂解N末端前胶原前肽，允许新分泌的三螺旋胶原与胶原纤维进行横向排列和交联，慢性CCL4给药期间胶原沉积速度较慢，CCL4停药后纤维化逆转速度较高³¹这些数据，再加上观察到ADAMTS2-/-小鼠的纤维间隔由较薄且不规则的胶原纤维构成，与胶原成熟和稳定是肝纤维化的重要治疗靶点这一概念相一致。

体内胶原蛋白稳定化的研究很困难，需要使用多种内部标准和昂贵的设备在肝组织完全水解后直接定量各种胶原蛋白交联⁶，并且由于缺乏检测交联的试剂而受到阻碍就地事实上，我们无法通过基于HPLC和质谱的方法可靠地检测正常或纤维化肝匀浆的末端蛋白水解消化物中谷氨酰胺转胺酶生成的ε-（γ-谷氨酰）赖氨酸异肽。这可能是由于体内这种交联的低丰度和复杂生物样品中的抑制性“基质效应”（参见补充图3和4和补充材料详细信息）。关于TG2介导的交联，过去使用在天然蛋白质中显示非特异性结合的商业抗体可能产生了错误的结果³²因此，我们使用TG2基因缺失和转氨酶活性受损的小鼠作为主要方法，同时使用连续胶原蛋白提取和自发性纤维化逆转模型作为主要功能终点来量化整体胶原蛋白交联程度。

我们清楚地证明，进行性胶原交联是肝纤维化进展的中心特征体内，据我们所知，以前在实验性肝纤维化模型中没有直接显示。我们开发了一种简单且重复性高的方法，通过连续提取胶原蛋白来评估ECM的稳定性，这将有助于未来研究纤维化基质的稳定性以及评估针对该机制的抗纤维化药物。这一过程可能会限制肝纤维化的可逆性，即使在消除了纤维化刺激后也是如此，我们证明这一过程与TG2无关。令人惊讶的是，在长达36周的长期恢复过程中，无论是野生型还是TG2−/-小鼠，肝脏总胶原蛋白均未出现定量减少，这表明在恢复阶段不会发生胶原蛋白降解和去除。这一发现与之前的一份报告相矛盾，该报告表明，在CCL4诱导的纤维化恢复后，I型前胶原基因突变的小鼠表现出缺乏自发的胶原降解，I型原胶原基因突变导致对胶原酶的抵抗³³虽然上述研究报告野生型对照组的相对羟脯氨酸水平下降了43%，r/r小鼠的肝细胞增殖受损，但未考虑肝体积的变化，也未测定肝总胶原含量。我们目前和之前的研究^18,34表明再生过程中肝细胞质量的增加导致相对的即使在没有胶原降解的情况下，恢复期间的胶原水平。重要的是，小鼠36周的恢复时间大约相当于其寿命的三分之一，相当于人类20-30年的恢复时间。从临床角度来看，由于大多数患者在其4个月内被诊断为晚期纤维化或肝硬化^第个至6^第个十年来，人们很容易推测，即使肝纤维化的原因已经消除，例如，由于对乙型或丙型肝炎的成功药物治疗，仍可能需要积极逆转晚期纤维化/早期肝硬化的纤溶疗法。

虽然TG2缺乏并不促进肝纤维化的逆转，但TG2−/−缺乏的小鼠似乎更容易发生肝脏炎症和纤维化，这与之前的研究一致²⁶一种可能的解释是TG2在促进凋亡和吞噬细胞清除凋亡细胞中的作用^35,36这些过程直接牵涉到炎症和纤维化进展的控制³⁷事实上，观察到TG2缺乏症的促纤维化作用与ECM交联无关，这与巨噬细胞吞噬功能低下一致。这可能通过限制纤维溶解而将平衡转向纤维生成，因为巨噬细胞在细胞凋亡吞噬时分泌纤维溶解MMPs，并在（胆道）纤维化逆转中发挥关键作用³⁴然而，无论TG2的这些和其他活性有何贡献，我们的方法清楚地表明，TG2整体不利于胶原（ECM）交联，也不显著影响（肝）纤维化的进展或消退。

总之，我们证明1）TG2在纤维化发生过程中上调，但对于稳定纤维化肝细胞外基质是不必要的体内; 2） 与野生型小鼠相比，缺乏TG2时形成的纤维化基质在肝纤维化自发恢复过程中不易降解；3） TG2非依赖性不可逆胶原交联是进行性肝纤维化的一个显著特征，是新型抗纤维化治疗的一个有前途的靶点。

补充材料

致谢

本文中使用的缩写

脚注

参考文献