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生物化学杂志。2012年6月8日；287(24): 20652–20663.
在线发布2012年4月25日。 数字对象标识：10.1074/jbc。M111.327601号
PMCID公司：PMC3370248型
PMID：22535952

B2短穿插核元素（SINE）自发插入NADH脱氢酶（泛醌）Fe-S蛋白4生成的线粒体复合物I缺陷小鼠模型的蛋白质组学和代谢组学分析(恩杜夫斯4)基因*保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg

狄龙·W·梁,一,1 贾斯珀·C·科门,b条,1 Chelsee A.Hewitt公司,一 埃斯特尔·阿尔诺,c（c） 马修·麦肯齐,d日 贝琳达·菲普森,e（电子） 梅兰妮·巴洛,e（电子）,（f） 阿德里安·拉斯科夫斯基,b条 莎拉·金克尔,一,克,小时 盖尔·戴维,克 威廉·希思,克 安妮·K·沃斯,一,小时 勒内·普·扎赫迪,我 詹姆斯·皮特,j个 罗马语Chrast,c（c） 阿尔伯特·希克曼,我,k个 迈克尔·T·瑞恩,我 戈登·斯迈思,e（电子）,（f）,小时 大卫·R·托本,b条,2和哈米什·斯科特一,小时,米,n个,三
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

背景：线粒体复合物I缺乏症是一种常见的遗传性代谢病。

结果：B2可转位元件插入恩杜夫斯4在小鼠中导致复合物I的“N组装模块”丢失、细胞代谢物改变和神经症状。

结论：NDUFS4亚单位是复合物I稳定性所必需的。

意义：了解氧化磷酸化缺陷的影响对于治疗的发展至关重要。

关键词：线粒体疾病、线粒体代谢、小鼠、小鼠遗传学、蛋白质组学、B2 SINE、CI缺乏、Leigh综合征、NDUFS4、插入突变、小鼠模型

摘要

真核细胞通过线粒体复合物网络和称为氧化磷酸化系统的电子载体以ATP的形式产生能量。在哺乳动物中，线粒体复合体I（CI）是该系统的最大组成部分，由线粒体和核DNA编码的45个不同亚单位组成。被诊断为基因突变的人类NDUFS4型编码CI的核DNA编码亚单位（NADH脱氢酶泛醌Fe-S蛋白4），通常患有Leigh综合征，这是一种在婴儿期或儿童早期发病的神经退行性疾病。线粒体来自NDUFS4型患者通常缺乏可检测的NDUFS4蛋白，并表现出CI稳定性/组装缺陷。在这里，我们描述了一种由插入转座因子引起的隐性小鼠表型恩杜夫斯4通过新的连锁和表达分析鉴定。指定的恩杜夫斯4弗基，突变导致纯合小鼠所有组织中的异常转录剪接和NDUFS4蛋白缺失。显示的身体和行为症状恩杜夫斯4飞/飞小鼠包括暂时的毛发脱落、生长迟缓、步态不稳和尾巴悬吊时的异常身体姿势。中的CI分析恩杜夫斯4飞/飞使用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的小鼠发现存在迁移速度更快的致残复合体。这个受损的CI缺乏“N组装模块”的亚单位，其中包含NADH结合位点，但包含两个完整CI中不存在的组装因子。通过串联质谱对血液进行的代谢组学分析表明，羟酰肉碱种类增加，这意味着CI缺陷导致NADH/NAD失衡+抑制线粒体脂肪酸β氧化的比率。

关键词：线粒体疾病、线粒体代谢、小鼠、小鼠遗传学、蛋白质组学、B2 SINE、CI缺乏、Leigh综合征、NDUFS4、插入突变、小鼠模型

介绍

氧化磷酸化（OXPHOS）4线粒体中的系统由五种蛋白质复合物（CI-CV）组成，以富含能量的分子ATP的形式为细胞产生大部分能量(1). 复合物I（CI；NADH泛醌氧化还原酶）是电子通过酶促将NADH转化为NAD进入OXPHOS系统的主要入口+释放的电子转移到泛醌，然后酶还原泛醌。在这些作用的同时，CI将质子泵出线粒体基质，从而促进线粒体膜电位（ΔψM（M）)，可由络合物V用于ATP合成或替代用于产生热量。在哺乳动物中，CI需要核和线粒体DNA编码的45个亚单位的正确组装才能正常发挥作用，使其成为最大的OXPHOS复合物。

OXPHOS系统缺陷是遗传性代谢疾病的最常见原因，影响5000名活产婴儿中的1名(2). CI缺乏是OXPHOS疾病中最常见的一种，已经证明是由至少20个亚单位基因和至少9个编码CI组装因子的其他基因的突变引起的(三)许多其他受影响的个体尚未确定其遗传原因。对于任何OXPHOS疾病，CI缺乏可能影响任何年龄段的任何器官，但大多数情况下，能量需求高的器官，如心脏和大脑，都会受到影响。因此，孤立CI缺乏患者最常出现早期神经退行性疾病Leigh综合征（OMIM编号256000）(4,5). 目前没有有效的治疗方法可用于CI缺乏症患者，所有OXPHOS障碍患者通常都是如此。迄今为止，患者管理主要局限于症状治疗(6)以及为那些已确定有可能进行产前检测的突变家庭提供遗传咨询。

开发新治疗方法的一个问题是缺乏OXPHOS疾病的相关动物模型，尤其是小鼠模型，以测试有希望的药物。直到最近，唯一的CI缺乏小鼠模型是自发突变的“Harlequin”小鼠，其前病毒插入了Aif公司（凋亡诱导因子）基因，导致AIF蛋白的整体表达减少，随后产生的条件Aif公司淘汰赛(7–10). 这些模型有一些局限性，因为AIF在CI维护和活动中的确切作用尚不清楚。最近发现的由同源基因突变引起的孤立CIV缺乏症患者强调了这一点AIF公司基因(11). 此外，Harlequin小鼠表型的变异性可能会使治疗结果的解释复杂化。

这个恩杜夫斯4该基因编码CI的基质臂亚单位NDUFS4型该基因发展为Leigh综合征，具有CI组装/稳定性缺陷和CI活性严重缺陷。截短型NDUFS4的纯合表达导致胚胎死亡(12)，而完全击倒恩杜夫斯4(恩杜夫斯4−/−小鼠）出现严重的神经损伤，导致在～7周时死亡(13).恩杜夫斯4−/−小鼠出现严重的神经损伤，在～7周时死亡。其他研究表明恩杜夫斯4−/−小鼠是由于大脑中的CI缺陷(14). 我们的CI缺乏小鼠模型是由于B2 SINE逆转录病毒自发插入恩杜夫斯4基因(恩杜夫斯4飞/飞老鼠）。我们使用了一种新的策略，包括基于单核苷酸多态性（SNP）和微卫星的遗传连锁，以及表达外显子阵列，该策略不仅识别了受影响的基因，还识别了受感染的外显子。我们的表型恩杜夫斯4飞/飞老鼠和克鲁斯描述的很相似等。(13)用于常规淘汰赛。然而，我们在这里显示恩杜夫斯4飞/飞小鼠血液中的某些代谢物与未受影响的对照组相比有显著差异，这可能在未来用作疾病的生物标记物。此外，我们在恩杜夫斯4飞/飞小鼠，这与在NDUFS4型.

实验程序

动物处理

自发的恩杜夫斯4弗基突变源于转基因C57BL/6（B6）菌株。对于遗传作图，B6恩杜夫斯4弗基/+雄性与BALB/c（BC）雌性杂交。在回交（N2)和交叉（Fn个)后代以及创始B6群体的后代。Walter and Eliza Hall Institute动物伦理委员会（项目2005.041）批准了伦理批准，默多克儿童研究所动物伦理委员会批准了协议（A526）。小鼠被关在12小时的光/暗循环中，并提供随意获得食物和水。恩杜夫斯4飞/飞根据我们的道德准则，在出生后第40天左右，当老鼠体重减轻10%以上和/或被尾巴悬吊时出现后肢抱住或向前卷曲时，对它们实施安乐死。

生长曲线和器官重量

每天下午对出生后5至45天的小鼠称重。使用针对生长曲线设计的排列测试（可在Walter和Eliza Hall医学研究所生物信息学网站上获得）评估对照组和受影响小鼠之间的差异，该测试具有10000个排列。第页根据Phipson和Smyth的建议计算值(15).

遗传连锁

用于定位弗基通过BALB/c上的异交进行位点定位，结果后代中有完全外显率（370中的81=0.22，χ2=1.91，df=1，第页=0.17）无性别偏见（χ2=0.62，df=1，第页= 0.43). 利用Pearsonχ法测定建立群体和异交群体中突变表型的外显率2拟合优度测试。性别偏见采用皮尔逊独立性检验和耶茨校正进行检验。共有99个后代，包括20个回交（N2)和79个交叉（F2)使用SEQUENOM®iPLEX对309个SNP标记进行分析TM（TM）分析和15个微卫星的定制面板（文件号8876-006，R012005年4月）。简单地说，每个SNP区域都经过PCR-扩增，然后进行清除步骤，以脱磷酸化未合并的dNTP。第二次扩增是使用在每个SNP核苷酸之前停止的引物进行的，反应在单碱基延伸后终止。因此，每个多态性标记的最终扩增产物只有一个核苷酸不同，即SNP本身。使用质谱仪（SpectroCHIP®生物阵列）和MassARRAY工作站（3.3版）分析扩增子。对SNP基因型进行单点分析，以检查分离畸变并确定全基因组显著性的阈值。然后使用在R中实现的自定义二项式检验来寻找对B6纯合子的偏见。

使用公共数据库中的标记进行微卫星基因分型(补充表1). 使用荧光标记的引物（Applied Biosystems）在标准条件下进行扩增，并通过AB3730 DNA分析仪上的毛细管电泳分离PCR产物。使用基因映射器（3.7版）将荧光信号转换为片段大小。通过单倍型的视觉比较来检测微卫星基因型，以确定B6纯合子的区域。

基因分型

这本小说恩杜夫斯4在标准条件下，用PCR对突变进行基因分型，其中一个正向引物位于内含子3（5′-TAGGAGGAGACGAGCA-3′），两个反向引物分别位于B2 SINE插入物（5′-TTACCCACGCACTCATCAC-3′）和外显子3（5'-GATGCCCACCATCAAG-3′）。

微阵列分析技术

根据制造商的说明，使用Qiagen RNeasy®Lipid Tissue Midi Kit从两个未受影响和两个受影响的P37小鼠的全脑中分离出总RNA，包括DNA酶治疗。根据制造商的说明（GeneChip®全转录感应靶点标记分析手册701880第2版），对RNA进行处理，并将其杂交到Affymetrix基因芯片®小鼠外显子1.0ST阵列上。使用GeneChip®扫描仪3000检测到荧光信号。

强度值经过背景校正，log2-使用鲁棒多阵列平均算法进行变换和分位数规范化(16). 总结并分析基因和外显子水平的表达值。在每种情况下，使用经验贝叶斯调节法评估差异表达t吨测试(17). 应用Benjamini和Hochberg调整控制连锁区30个基因的错误发现率。基于RefSeq的自定义CDF文件用于基因水平分析(18). 使用ROAST对全基因组差异表达结果进行通路分析(19)、摄像头、，5和来自布罗德研究所分子特征数据库（MSigDB）的基因集(20)映射到小鼠直系图（参见Walter and Eliza Hall医学研究所生物信息学网站）。

克隆和测序

基因组学恩杜夫斯4每个外显子的引物设计为包括200–300 bp的相邻剪接边界，而cDNA扩增的引物则设计为每个外显体的中间（引物序列可按要求提供）。根据制造商的说明，使用Promega pGEM®-T载体系统和JM109活性细胞进行cDNA扩增子的克隆。使用Applied Biosystems Prism®BigDye制备测序反应TM（TM）澳大利亚基因组研究机构推荐的终结者（3.1版）。使用M13引物5′-GGAACAGCTATGACCATG-3′和5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′对克隆进行测序。使用毛细管分离分析荧光标记的扩增子，并使用SeqMan软件（DNASTAR®Lasergene）检查序列读取。恩杜夫斯4参考序列下载自加州大学圣克鲁斯分校基因组浏览器鼠标2006年2月的组装。

SDS-PAGE、BN-PAGE和免疫印迹

对于SDS-PAGE，新鲜冷冻组织在裂解缓冲液（100 m）中均质米Tris/HCl pH值8100 m米氯化钠，0.1%Triton X-100，2 m米EDTA和蛋白酶抑制剂混合物），短暂超声处理，并在4°C下离心。收集所得上清液，并使用SDS-PAGE在15%丙烯酰胺凝胶上解析20μg蛋白质提取物。使用单克隆抗体检测NDUFS4（MitoSciences，MS104）。

对于BN-PAGE，从小鼠心脏中分离线粒体，如前所述用于培养细胞(21)并以1%溶解n个-十二烷基-β-d日-在用BN-PAGE分离络合物之前使用麦芽糖苷或1%Triton X-100(22). 蛋白质要么用0.5%考马斯蓝R（Sigma）在40%乙醇、7%乙酸中染色，要么转移到PVDF膜（Immobilion，Millipore）上进行免疫修饰(22). 用针对CII 70-kDa亚单位（Invitrogen）或CI亚单位NDUFA9的抗体检测膜(23).

对于完整CI和“受损”CI的质谱分析，线粒体在1%Triton X-100中溶解，然后在4–10%BN-PAGE凝胶上分离。复合物I通过另一轮BN-PAGE进一步纯化。为此，切下第一维度BN-聚丙烯酰胺凝胶条，放置在第二个BN-聚丙烯腈凝胶上。

将溶解的凝胶固定在50%甲醇、2%磷酸中；在蒸馏H中清洗2O；在34%甲醇、2%磷酸、17%硫酸铵中培养；并用考马斯亮蓝G胶体染色。然后从凝胶中去除络合物进行质谱分析。

纳米LC-MS/MS分析

如前所述，清洗、还原、氨甲酰化切除的凝胶带，并进行胰蛋白酶凝胶内消化(24). 用15μl 0.1%三氟乙酸（TFA）提取生成的肽。使用LTQ-Orbitrap XL（德国不来梅热电科学公司）质谱仪进行纳米LC-MS/MS分析，该质谱仪在线耦合至惰性U3000纳米HPLC系统（荷兰阿姆斯特丹Dionex）。

简而言之，肽在内径为100μm的反相捕集柱（Synergi HydroRP，粒径为4-μm，孔径为80-Å，长度为2-cm，Phenomenex）上在0.1%TFA中预富集，然后在内径为75μm的反相柱（Syergi HzroRP，2-μm，粒径80-┓）上分离孔径，30-cm长，Phenomenex）主色谱柱，采用40-min二元梯度（溶剂a，0.1%甲酸；溶剂B，0.1%蚁酸，84%丙酮），范围为5-50%溶剂B，40min，50-95%B，1min，流速为270 nl/min和60°C。

350至2000年MS调查扫描米/z（z）在Orbitrap中使用聚硅氧烷以60000的分辨率获得米/z（z）445.120030作为船闸质量。五个最强烈的信号在LTQ中使用动态排除进行基于碰撞诱导解离的MS/MS。Orbitrap和LTQ的AGC目标值分别设置为106和104。

原始数据转换为mgf（Mascot通用文件）格式，并使用Mascot 2.2.2根据IPI小鼠数据库版本3.52（55303序列）搜索生成的峰列表，设置如下：胰蛋白酶作为酶，最大缺失一个裂解，Cys的氨基甲酰化（+57.0214 Da）Met的固定和氧化（+15.9949 Da）以及Ser、Thr和Tyr的磷酸化（+79.9663 Da）作为可变修饰，肽质量耐受性为10 ppm，MS/MS耐受性为±0.5 Da。只有至少具有两种不同的蛋白质，手动检查的肽MS/MS光谱高于马斯科特评分35(第页28时<0.05）。

线粒体CI活性

OXPHOS酶活性如前所述用分光光度法测定(5)，但在25°C下进行的分析除外。组织呼吸链复合物的活性恩杜夫斯4飞/飞和野生型小鼠通过t吨测试。差异被认为在第页< 0.05.

线粒体ATP合成测定

根据Pallotti和Lenaz的研究，立即从因颈椎脱位而被安乐死的小鼠组织中分离出线粒体(25)根据西姆斯的说法(26)对于大脑来说。如前所述，测量了分离线粒体的ATP合成能力（6.25μg/ml末端浓度），省略了洋地黄素(27). 利用底物苹果酸（10 m米)和谷氨酸（10米米)而依赖CII的ATP合成是通过琥珀酸（10 m米)在鱼藤酮（2.5μ米). ATP合成能力表示为CI依赖性ATP合成与CII依赖性ATP合成之间的比率。线粒体数据来自恩杜夫斯4飞/飞与对照组小鼠进行比较t吨测试。差异被认为在第页< 0.05.

组织学

将骨骼肌（股四头肌）冷冻切片至8μm，并用油红O染色。油红O储备液通过将300 mg染料溶解在100 ml异丙醇中制备。将冰冻切片固定在多聚甲醛中10分钟，并在60%油红O储备液中培养10分钟。用蒸馏水清洗玻片三次，装订并检查。为了分析视神经，用1%多聚甲醛和2%戊二醛在0.1溶液中灌注小鼠米cacodylate缓冲液（pH 7.3）5分钟。通过在4°C的固定液中浸泡2小时，在0.1中清洗，准确解剖并固定视神经米二羧酸缓冲液，在1%OsO中渗透4h4（福卢卡）。神经用水冲洗、脱水，并植入Epon 812替代物（Fluka）中。用1%甲苯胺蓝对一微米半薄切片进行染色并进行光学显微镜检查。

小鼠大脑以1:4的比例在20μm的温度下进行冷冻切片。脊髓在20μm处按1:24系列切片。所有切割部分都安装在涂有明胶的载玻片上。每个切割组织的一个系列用甲酚紫染色。使用Olympus Bx51显微镜获得切片图像（×10），然后使用Neurolucida软件进行分析。使用ImagePro-Plus软件测量运动皮层、感觉皮层、胶体体、脑室、纹状体、海马（齿状回和CA1）、黑质、脑桥核、丘脑腹后核（VP）、小脑层和整个半球的区域。

干血盆卡血液的代谢分析

将从心脏中提取的血液放在Whatman 903纸上，按照前面描述的方法进行电喷雾串联质谱分析，并进行了微小修改(28). 多反应监测用于针对选定的氨基酸和酰基肉碱组。使用添加的稳定同位素内标进行定量。之间的重大变化恩杜夫斯4飞/飞小鼠和对照组的测定方法为t吨测试。差异被认为在第页< 0.05.

组织中的酰肉碱分析

根据van Vlies，分析了大约10 mg的心脏或肝脏组织等。(29)稍作修改。使用以下内部标准对酰肉碱种类的数量进行半定量：[2H（H）9]用于C0–C2肉碱的肉碱[2H（H）三]C3–C6肉碱的异戊酰肉碱[2H（H）三]C8–C10肉碱的辛烷酰肉碱，以及[2H（H）三]C12–C20肉碱的十四烷基肉碱。使用Waters Quattro LC仪器，通过电喷雾串联质谱法对丁基化酰基肉碱物种进行了两次测量。

结果

Ndufs4中自发B2 SINE插入（fky）导致进行性神经系统疾病

在杂合子雄性的繁殖策略中Dnmt3L型老鼠(30)和雌性RIP-mOVA转基因C57BL/6小鼠(31)自发的“时髦”突变(弗基)发生。这种突变独立于父母的转基因分离，遗传与常染色体隐性位点一致。这个飞/飞表型出现于出生后第16天左右（P16），颈部毛发脱落，随后沿着躯干向尾部扩散(图1A类). 这种皮毛脱落是暂时的，一周后以类似的方式从颈部到躯干再生。纯合小鼠在出生后第2周表现出发育不良，到P40时，平均比正常同窝小鼠小26%(第页= 10−5男性；第页= 10−5女性；图1B类). 从第5周起，受影响的小鼠出现神经症状，包括头部倾斜（75只中的16只=0.21）、绕圈子行走（75只里的17只=0.23），以及被尾巴悬吊时身体向前卷曲（75只当中的51只=0.68）。从P40开始，症状迅速恶化，导致按照道德准则实施安乐死。尽管纯合子状态下的突变严重，但没有证据表明有产前死亡，这是由465个后代组成的队列确定的，其中107个表现为隐性表型（465中107个=0.23，χ2=0.98，df=1，第页=0.32）无性别偏见（51名男性和56名女性，df=1，χ2= 0.48,第页= 0.49). 我们将连锁和表达分析进行了一种新的组合，以快速确定负责飞/飞表型。用于定位弗基该位点是通过异交C57BL/6启动的弗基利用BALB/c野生型小鼠，对20个回交后代和79个杂交后代的309个SNP进行全基因组查询。对这些SNP的分析得出了13号染色体的一个亚区，其中由15个微卫星组成的定制小组进一步将该隐性位点精确定位在小鼠13号染色体上的6兆碱基区间D13密特196和3708633卢比(补充图1A类和表2)，包含30个带注释的RefSeq基因（Ensembl Genome Browser；小鼠构建35）。使用Affymetrix GeneChip®小鼠外显子1.0ST阵列上的全脑RNA对这30个基因进行表达分析恩杜夫斯4在纯合小鼠中下调(第页= 4 × 10−24;补充表2). 此外恩杜夫斯4除外显子3外，所有五个外显子均表现出相对一致的下调，该外显子比其他外显子至少下调2.5倍(补充图1C类和表3).

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纯合子“funky”突变小鼠出现短暂脱发(A类)以及繁荣的失败(B类). A类在P17附近，胆小的老鼠脖子后面出现秃顶，沿着躯干（第21页）向尾巴（第24页）推进，之后毛发以相同的顺序生长。B类，生长曲线比较纯合子时髦男性和女性与正常同龄人。从15天大开始，纯合小鼠的生长速度下降。n个=受影响男性为6(M（M）,影响);n个=33（对照雄性）(M（M）,控制);n个=10（受影响女性）(F类,影响);n个=20（对照组雌性）(F类,控制);第页= 10−5男性；第页= 10−5针对女性。误差线、瑞典。

所有五项的排序恩杜夫斯4外显子和相邻剪接边界显示在外显子3内有258-核苷酸（nt）插入(图2A类). 使用RepeatMasker（A.F.A.Smit、R.Hubley和P.Green，RepeatMasker Open-3.01996-2004；可在万维网上获得）针对Repbase查询插入序列，发现与已知的B2短穿插核元素（SINE）有97%的匹配（176个核苷酸中的171个，不包括69个核苷酸的poly（A）尾部）(图2,B类和C类). 对我们的小鼠群体进行的基因筛查发现恩杜夫斯4变体，恩杜夫斯4弗基，与隐性表型分离。

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“funky”突变是B2 SINE插入恩杜夫斯4. A类，测序色谱仪比较恩杜夫斯4野生型和纯合型小鼠外显子3；插入序列在外显子5′端开始后52nt开始。B类，RepeatMasker输出显示插入序列与B2_Mm1a的对齐；176个nt中的171个=97%匹配。过渡和置换表示为我和v（v）分别是。C类,恩杜夫斯4弗基显示B2插入和靶位点重复的位点(TSD公司)序列。

B2 SINE插入导致NDUFS4中NDUFS4蛋白耗竭飞/飞老鼠

全脑RNA的RT-PCR分析显示一个截断的典型恩杜夫斯4成绩单恩杜夫斯4飞/飞小鼠，测序显示第3外显子缺失(图3A类)这与外显子水平的微阵列分析一致。规范的外显子3缺失恩杜夫斯4预计转录本会引起移码，导致外显子4和5内过早终止密码子的形成。包含外显子3和B2插入物的标准转录本存在于较低水平，但B2元件在外显子三中的定位也会导致外显子内过早终止密码子的形成。大脑、心脏、肝脏和骨骼肌的Western blot分析未能检测到NDUFS4蛋白恩杜夫斯4飞/飞小鼠组织与野生型和杂合同卵鼠的比较(n个= 3) (图3B类)，与转录后恩杜夫斯4过早终止密码子诱导的非传感介导衰变导致的产物(32).

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B2正弦插入恩杜夫斯4结果所有受试组织中出现孤立CI缺乏。 A类，RT-PCR显示截断恩杜夫斯4全脑RNA转录本恩杜夫斯4飞/飞老鼠；野生型转录变体(第1版)通过克隆测序进行鉴定；这个示意图上正确的描述凝胶上可见的不同扩增子；白色箭头指出终止密码子的位置。B类，NDUFS4蛋白在大鼠的全脑、心脏、肝脏和骨骼肌中未检测到恩杜夫斯4飞/飞小鼠通过蛋白质印迹。C类，CI活性，根据柠檬酸合成酶标准化(反恐精英)，在所有测试的组织中减少恩杜夫斯4飞/飞老鼠(n个= 3–5).D类线粒体CII、CIII和CIV活性在恩杜夫斯4飞/飞老鼠(n个= 4).电子，心脏和大脑线粒体的ATP合成能力被确定为CI依赖性ATP生成（与底物结合苹果酸和谷氨酸）与CII依赖性ATP的生成（与在CI抑制剂鱼藤酮存在下的底物琥珀酸）标准化并显示为控制线粒体的百分比（年龄范围P30–P41，心脏n个=13，大脑n个= 5).C类和D类,黑色条、野生型小鼠；白色条,恩杜夫斯4飞/飞老鼠。电子,控制,恩杜夫斯4+/（f）+和恩杜夫斯4+/弗基;飞/飞,恩杜夫斯4飞/飞. *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.005; #,第页< 0.001; ##,第页< 0.0005; ###,第页< 0.0001; ####,第页< 0.00005.误差线、瑞典。

恩杜夫斯4编码线粒体CI的18-kDa结构亚单位NDUFS4型导致线粒体CI缺乏（OMIM编号252010）(33–35)，而传统的击倒恩杜夫斯4小鼠的基因最近也被证明会导致CI缺乏(13). 脑、心脏、肌肉、肝脏和肾脏组织中CI活性的测量恩杜夫斯4飞/飞与野生型相比，柠檬酸合成酶活性正常化的小鼠CI活性水平降低(图3C类). 心脏组织残留活性最高（野生型水平的22.1±1.3%），而肝脏残留活性最低（野生型的10.4%±1.1%）。此外，在野生型和杂合型小鼠之间，CI活性没有发现差异（数据未显示）。这与杂合动物的表型相符，我们发现杂合动物与野生型动物没有区别。

其他OXPHOS复合物（CII、CIII和CIV）的活性不受NDUFS4耗竭的影响，如大脑中所示，这表明对CI的单独影响恩杜夫斯4飞/飞老鼠(n个= 4,第页≫0.05，未配对t吨测试；图3D类).

为了确定NDUFS4耗竭对OXPHOS系统功能的影响，我们研究了分离的线粒体在底物苹果酸和谷氨酸上呼吸时产生ATP的能力，这些底物在CI水平上将电子送入系统。作为对照，我们用琥珀酸、，通过CII输入电子，再加上鱼藤酮抑制CI活性。由于在野生型和杂合子基因型之间没有发现CI活性和表型的差异，因此将它们合并并称为“对照”组。由于CI活性的缺陷恩杜夫斯4飞/飞与对照线粒体相比，显示生成ATP的能力下降（通过呼吸苹果酸和谷氨酸生成的ATP比率与琥珀酸和鱼藤酮；图3电子). 尽管在心脏和大脑的CI活性测定中测得的降低幅度很大，但心脏中产生ATP的能力仅小幅降低了18%，而大脑中的降低幅度更大，为36%(图3电子).

NDUFS4蛋白耗竭导致CI N模块丢失

人类体内无意义突变、缺失和复制NDUFS4型已证明干扰NDUFS4蛋白合成，导致线粒体CI形成异常并导致活性降低(33–37). 我们检测了线粒体CI组装状态恩杜夫斯4飞/飞用BN-PAGE分离小鼠，然后用考马斯染色。恩杜夫斯4飞/飞心脏线粒体溶于1%n个-十二烷基-β-d日-BN-PAGE麦芽糖苷在CI组装/稳定性方面存在明显缺陷，如控制通道中可见的与CI的正确分子量对应的条带消失所示(图4A类,车道1和2). 相反，有一条分子量较低的带，对应于～800 kDa的蛋白质复合物出现在恩杜夫斯4飞/飞心脏线粒体(车道2)，表明CI受损。接下来我们使用较温和的溶解条件来检测CI和CIII（CI-CIII）的超复合物2)BN-PAGE上(图4A类,车道3和4). CI-CIII2超复合体以低分子量物种的形式出现，表明在恩杜夫斯4飞/飞线粒体。在1%Triton X-100溶解线粒体的BN-PAGE后，用针对CI亚单位NDUFA9的抗体进行免疫印迹，证实CI和CI-CIII的损伤状态2超复合体恩杜夫斯4飞/飞线粒体(图4B类). 残缺CI和CI-CIII的数量2与野生型小鼠相比，超复合物也减少了。此外，杂合子CI的组装状态和数量恩杜夫斯4+/弗基线粒体与野生型线粒体没有区别，与CI活性测量结果一致（数据未显示）。

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NDUFS4的耗尽会改变CI的装配状态。 A类，代表性BN-聚丙烯酰胺凝胶，当恩杜夫斯4飞/飞心脏线粒体溶解于1%n个-十二烷基β-麦芽糖苷(驾驶员侧车门模块;车道2). 什么时候？恩杜夫斯4飞/飞心脏线粒体在1%Triton X-100中溶解(TX100型)、CI-CIII2超复合体(联合国安全理事会)可以观察到(车道3和4). 大部分CI-CIII2在以下情况下检测到SC处于跛行状态恩杜夫斯4飞/飞线粒体(车道4).B类，BN-PAGE和抗CI亚单位NDUFA9抗体的Western blot显示CI的弱染色和损伤状态(CI公司)单体和CI-CIII2(CI/CIII公司2)来自恩杜夫斯4飞/飞老鼠。

BN-PAGE实验中发现的受损CI的成分恩杜夫斯4飞/飞随后使用纳米液相色谱-串联质谱（nano-LC-MS/MS）和野生型和恩杜夫斯4飞/飞线粒体。这导致在野生型CI中检测到45个亚基中的38个，而在受损复合体中检测到30个亚基(表1和补充表4). 野生型和致残型CI中仍有五个亚基未被检测到，这表明这些亚基可能难以检测。值得注意的是，除NDUFS4外，在受损CI中未检测到亚基NDUFA12、NDUFS1、NDUWS6、NDUFV1和NDUFV2。这些亚基包括NDUFS5，构成负责NADH氧化和电子向铁硫簇转移的N模块(图5). 这些数据证实，NDUFS4对于CI矩阵臂N模块组件的组装和/或稳定性至关重要。

表1

孤立野生型和“致残”型的典型MALDI-TOF结果恩杜夫斯4飞/飞复合体I

野生型全息复合体恩杜夫斯4飞/飞残废复合体
检测到的亚单位3830
未检测到亚基7一15一
检测到N个模块亚单位60b条
检测到的装配系数02

一包括5个在两者中均未检测到的亚单位。

b条没有检测到N模块亚基。

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线粒体中受损CI的纳米LC-MS/MS分析结果示意图恩杜夫斯4飞/飞老鼠。 左侧，野生型小鼠CI中存在不同的模块。赖特，我来自残废的综合体恩杜夫斯4飞/飞小鼠遗漏了构成N模块的所有亚单位，而组装因子Ndufaf1和Ndufaf2与受损复合物I相关。纳米LC-MS/MS分析结果的表示基于McKenzie和Ryan描述的组装模型(64).

受损CI不仅缺少N模块，还检测到与受损复合体特异相关的其他蛋白质，即NDUFAF1（CIA30）和NDUFAF2（B17.2L）(补充表4和图5). 这些蛋白质被称为CI组装因子，以前在多个CI缺乏患者中发现与组装中间体相关(38–40). 此外，发现NDUFAF1与致病性NDUFS4型突变(39,41).

Ndufs4的代谢组学分析飞/飞小鼠表现出羟酰肉碱增加

在描述了NDUFS4缺失对CI组装的影响后，我们接下来试图评估其对细胞代谢更广泛方面的影响。血液中阿卡尼汀和氨基酸的串联质谱靶向分析恩杜夫斯4飞/飞小鼠（平均年龄40.1±4.4天恩杜夫斯4飞/飞小鼠和对照小鼠分别为40.1±4.4天（平均值±S.D(图6和补充表5). 有趣的是，与对照动物相比，碳链为C4:0、C16:0和C18:1的羟基肉碱均增加(图6,A–C). 虽然血液中这些代谢物的绝对水平较低，可能不会直接影响疾病的结局，但羟酰肉碱的增加可能表明第三NAD被阻断+-CI缺陷引起的线粒体脂肪酸β-氧化途径的依赖性步骤。然而，对肝脏和心脏的额外阿卡尼汀分析恩杜夫斯4飞/飞与对照小鼠相比，小鼠的肉碱种类没有太大差异(补充表6和7). 此外，骨骼肌油红O染色未能检测到恩杜夫斯4飞/飞老鼠(补充图2)偶尔在CI缺乏患者中发现(5). 这些结果表明，缺陷可能导致脂肪酰基物种比率的改变，但不会导致脂肪酸氧化的严重缺陷。

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NDUFS4缺失导致串联MS测量的血液代谢物水平发生显著变化。 A–C，对干血斑卡血液的串联质谱分析显示，羟酰肉碱种类显著增加，其质量相当于羟基-C4:0酰肉碱、羟基-C16:0酰肉碱和羟基-C18:1酰肉碱恩杜夫斯4飞/飞老鼠。D–F型，唯一显著变化的氨基酸水平是甘氨酸、苯丙氨酸和高瓜氨酸（均增加）。n个=27（对于控制装置）；n个=26恩杜夫斯4飞/飞.误差线、瑞典。

对血液氨基酸水平的串联质谱分析显示，甘氨酸、苯丙氨酸和高瓜氨酸的水平只有显著变化，这些都在恩杜夫斯4飞/飞血液(图6,D–F型).

讨论

结合表达谱分析的连锁已成功识别小鼠和人类的常染色体隐性疾病基因(42,43). 在这里，我们对表达数据进行了分析，重点是通过定制的连锁分析和敏感位点的精细映射确定的临界区间。这减少了差分表达式分析的多重测试惩罚。此外，据我们所知，这是唯一一个使用外显子阵列的例子，事后来看，由于突变的性质（见下文），表达分析不仅确定了基因，还确定了基因突变的外显子飞/飞表型。SINE属于内源性逆转录病毒样序列家族，称为转座元件，已知其通过插入突变引起疾病(44–46). 自发发生的弗基突变不仅突显了插入突变的有害影响，而且还让我们怀疑亲本是否有转基因Dnmt3L型（DNA甲基转移酶3样基因）或RIP-mOVA型（在大鼠胰岛素启动子控制下的膜结合卵清蛋白）在促进诱变活性方面发挥了作用。尽管RIP-mOVA不太可能成为候选人(31)，DNMT3L被发现是精原细胞DNA甲基化和转座元件遗传抑制所必需的(30).Dnmt3L型−/−雄性小鼠由于生精障碍而不育，而Dnmt3L型+/−雄性在表型上正常且有生育能力。考虑到飞/飞表型起源于育种Dnmt3L型+/−男性，这表明失去了一种功能Dnmt3L型等位基因可能足以增加雄性生殖系中转座元件相关突变的频率。

这个恩杜夫斯4弗基该基因座有一个13-nt靶位点重复序列5′-AAACCAGAAGG-3′和一个假定的靶序列5′-TCAAAA-3′，这是记录插入的特征(47,48)由长散布的核元素（LINE）介导(49,50) (图2C类). B2 SINE插入引入了提前终止密码子恩杜夫斯4，很可能触发突变mRNA的非传感介导衰减，导致NDUFS4蛋白的完全耗竭，如图3,A类和B类(32).

恩杜夫斯4编码线粒体CI的18-kDa亚单位，在需要能量的组织中高度表达，如心脏、骨骼肌和中枢神经系统的各种成分，如杏仁核、小脑和背根神经节(51). 诊断为纯合子患者NDUFS4型突变遭受线粒体CI缺乏（OMIM编号252010）。症状上，这些患者患有Leigh综合征（OMIM编号256000），这是一种常见于先天性线粒体疾病的早期进展性神经退行性疾病，表现出发育不良、嗜睡、张力减退和神经退行疾病等症状(4,52). 在一只普通的敲除小鼠身上重现了这种症状谱恩杜夫斯4其中使用Cre重组酶-loxP（Cre-loxP）系统切除外显子2(13). 这个恩杜夫斯4飞/飞这里描述的小鼠表现出与传统基因敲除小鼠基本相同的表型，包括短暂脱发、发育不良和P35神经缺陷的发展，根据我们的道德准则，这通常导致受影响小鼠被P40安乐死。

Leigh综合征的特征是中枢神经系统的各个部分受损，如脑干、基底神经节、小脑和脊髓(4). 初步神经病理学检查显示41天和48天大的婴儿大脑没有明显的形态学异常恩杜夫斯4飞/飞老鼠(补充表8). 与这一观察结果一致，未受影响和受影响P37小鼠全脑总RNA的全基因组微阵列分析显示，只有两个差异表达基因，均下调，恩杜夫斯4和Ppdpf公司密集而复杂的生物信息学尝试未能发现甚至细微改变的相关生物途径(例如.keywords brain、neuro、oxidative、ampk和fatty）和without(MSigDB公司)先前的知识。

然而，与在恩杜夫斯4−/−老鼠(13)，视神经轴索损伤恩杜夫斯4飞/飞P58小鼠(补充图3). 脑区的初步光镜研究恩杜夫斯4−/−野生型和敲除型小鼠之间也没有差异(13). 然而，同一组随后发表的一项更详细的研究显示，患有晚期疾病表型的小鼠的特定脑区出现神经元缺失，这可能是由于胶质细胞的逐渐激活所致(14). 根据我们的道德准则，我们的小鼠通常在金塔纳定义的疾病晚期发病之前被安乐死等。(14). 这可能解释了为什么我们没有在大脑中检测到明显的神经病理学变化。

根据柠檬酸合成酶对CI活性进行标准化测量，发现大脑、心脏、肝脏和肌肉组织中恩杜夫斯4飞/飞老鼠(图3C类)与患者肌肉组织中发现的水平类似，最初在常规组织中报告恩杜夫斯4−/−老鼠(13,52). 随后的一项研究发现心脏的活动稍高，CI活动仅减少56%(53)这可能是由于样品制备和分析方法不同所致。对其他主要线粒体复合体（CII、CIII和CIV）的类似分析显示恩杜夫斯4飞/飞老鼠(图3,C类和D类). 这些结果提供了令人信服的证据，证明纯合子恩杜夫斯4突变对CI有单独的影响。CIII活性降低，在一些NDUFS4型病人(33)，在中未检测到恩杜夫斯4飞/飞老鼠。恩杜夫斯4飞/飞小鼠在6周龄时存活至成年，而大多数纯合子患者恩杜夫斯4突变在婴儿期死亡(33). 这可能表明NDUFS4在小鼠中存在一些功能冗余。然而，一个更可能的解释是，由于小鼠在6周内成熟到成年，它们在发育方面的存活时间更长，神经病理学也更温和，这是由于累积的组织损伤导致病理变化所需的时间。

乍一看恩杜夫斯4飞/飞考虑到Ndufs4亚单位在所有研究组织中普遍表达，CI活性显著降低，小鼠可能会感到惊讶。然而，之前已经注意到神经系统对线粒体功能障碍的选择性脆弱性(54). 这在一定程度上可以解释为其高能量需求，尽管大脑只占体重的约2%，但它占氧气消耗的约20%和葡萄糖消耗的约25%(55). 在恩杜夫斯4飞/飞小鼠，一个促成因素可能在于观察到大脑中与CI相关的ATP合成能力也比心脏中显著降低（分别为对照值的64%和82%）。我们对脑匀浆的研究也可能低估了某些神经细胞CI活性降低的功能后果。以前的研究发现，当CI活性降低25%时，大鼠突触线粒体的ATP合成开始下降，而在非突触线粒体中，只有CI活性降低72%时才起作用(56). 因此恩杜夫斯4飞/飞小鼠可能与组织内和组织间CI活性水平的异质性、组织间和组织内CI活性丧失的不同功能阈值以及与细胞功能和细胞死亡相关的下游通路的变化有关(57).

虽然恩杜夫斯4−/−(13)和恩杜夫斯4飞/飞小鼠与CI缺乏症患者的临床特征有许多相似之处，也有差异。显然，尽管线粒体疾病患者的头发和皮肤出现了异常，但这两种模型中出现的短暂毛发脱落并没有相同的人类症状(58–61). 据报道，另一种线粒体疾病小鼠模型Polg“突变”小鼠的皮毛进行性脱落，这种小鼠随着年龄的增长积累线粒体DNA突变(62,63).恩杜夫斯4在皮肤中似乎没有高度表达，但毛发脱落的年龄特异性发作表明恩杜夫斯4.未来的表达式分析恩杜夫斯4在毛发脱落开始之前、期间和之后的皮肤样本中，可以提供进一步的信息。

的装配状态分析恩杜夫斯4飞/飞使用BN-PAGE的CI揭示了一种约830 kDa的受损CI物种的存在，该物种可能与超级复合体结合(图4,A类和B类). 早期研究使用患者的成纤维细胞恩杜夫斯4突变表明存在一个残废物种，该物种被认为是CI的累积组装中间产物(36,37,41). 与所有组织中发现的低复合物I活性一样，少量组装复合物I和CI-CIII2相比之下，ATP合成水平相对较高。后者在成纤维细胞中进行测量，其质膜已被低浓度的洋地黄素渗透，并保留完整的线粒体内膜。在超声组织匀浆中测量CI活性，BN-PAGE研究使用相对温和的洗涤剂条件，但仍能从线粒体内膜溶解OXPHOS复合物。鉴于NDUFS4参与CI的组装和稳定性，这些观察结果共同表明，完整内膜中完全组装的CI数量可能高于酶分析和BN-PAGE分析预测的数量。

进行Nano-LC-MS/MS分析以确定构成受损CI的亚单位，并显示完全缺乏属于NADH氧化（N）模块的亚单位。在组装成成熟CI的最后阶段，该模块作为一个整体连接到包含所有其他亚单位的中间体上(图5)（有关审查，请参见参考。64). 之前在在体外使用对照组和患者线粒体（缺少NDUFS4或NDUFS6）进行亚单位导入研究，被认为是真正的CI组装中间产物(41,64). 支持这一点，我们的研究显示CI组装因子NDUFAF1和NDUFAF2与受损复合物物种的关联，表明复合物在BN-PAGE条件下不会解离。尽管已发现NDUFAF2与830-kDa组装中间产物相关NDUFS4型，NDUFAF1之前未显示(39,40). 然而，在控制线粒体的830-kDa组装中间产物中检测到NDUFAF1(38). 我们注意到，在关于恩杜夫斯4−/−老鼠(13)但最近的一项研究中也描述了这一点，该研究还确定了一种保留NADH氧化活性的约200 kDa的小络合物(53). 这些观察结果与我们对受损CI的质谱分析结果一致。

测定酰基肉碱种类是检测人类和小鼠脂肪酸氧化缺陷的一种特征明确的方法(65). 我们的血液代谢筛查恩杜夫斯4飞/飞小鼠表现出多种羟酰肉碱的增加(图6,A–C). 这些羟基肉碱物种的确切结构无法通过本研究中使用的串联质谱法确定。然而，3-羟基酰基辅酶A在线粒体β-氧化过程中形成，并在NAD中转化为β-酮酰基辅酶A+-β-氧化螺旋的依赖步骤（有关审查，请参阅参考文献。66). 因此，羟酰基肉碱的增加表明3-羟酰基酶a转化为相应的酰肉碱物种时β-氧化受阻。在恩杜夫斯4飞/飞小鼠，CI似乎缺乏负责NADH转化为NAD的模块+这可能会导致NAD失衡+/线粒体内NADH比率是脂肪酸β-氧化受阻的原因。对OXPHOS疾病患者的研究表明，血清丙氨酸水平升高和/或瓜氨酸水平降低(67–70). 这不是在恩杜夫斯4飞/飞只含有甘氨酸、苯丙氨酸和高瓜氨酸水平的小鼠显著升高(图6,D–F型). 然而，这些水平并没有显著改变，它们可能不会对表型产生很大影响。

总之，我们已经使用连锁和外显子阵列的新组合，对由于插入B2 SINE转座元件而自发产生的CI缺乏的动物模型进行了表征。生物化学方面恩杜夫斯4飞/飞小鼠有CI缺陷，类似于在基因突变患者的成纤维细胞中观察到的CI缺陷NDUFS4型.CI不稳定，导致NADH氧化模块与剩余受损CI分离，CI与组装因子NDUFAF1和NDUFAF2相关。

致谢

Walter和Eliza Hall医学研究所（WEHI）以及Murdoch Childrens研究所的动物技术人员促进了有效的动物管理和数据收集。组织学样本的处理得到了WEHI组织学和综合神经科学设施的帮助。Affymetrix外显子阵列和连锁基因分型由澳大利亚基因组研究机构进行，该机构是通过公共基金资助的主要国家研究机构项目建立的。

*这项工作得到了澳大利亚研究生奖（授予S.A.K.）、国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）奖学金（授予H.H.S、D.R.T.、G.K.S.和A.K.V.）、NHMRC职业发展奖（授予M.M.和M.B.）、NHMRI项目拨款257501以及NHMRC项目拨款607403和602530的支持，澳大利亚研究委员会（致M.T.R.）、维多利亚州政府的运营基础设施支持计划，以及沃尔特和伊丽莎霍尔医学研究所颁发的鼻领导奖（致H.s.）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg本文包含补充表1-8和图1-3.

5D.Wu和G.K.Smyth，手稿正在编写中。

4使用的缩写如下：

牛津大学
氧化磷酸化
CI–简历
分别为复合I–V
OMIM公司
Man®中的在线孟德尔遗传
数据流
自由度
SNP公司
单核苷酸多态性
BN编号
蓝色本地
P（P）n个
产后日n个
纳特
核苷酸
正弦
短散布核元件
线路
长而分散的核元素。

参考文献

1Smeitink J.A.、Zeviani M.、Turnbull D.M.、Jacobs H.T.（2006）线粒体医学。氧化磷酸化障碍病理学的代谢观点.单元格元数据。 三, 9–13 [公共医学][谷歌学者]
2Skladal D.、Halliday J.、Thorburn D.R.（2003）儿童线粒体呼吸链疾病的最低出生患病率.大脑 126, 1905–1912 [公共医学][谷歌学者]
三。Tucker E.J.、Compton A.G.、Calvo S.E.、Thorburn D.R.（2011）人类复合物I缺乏症的分子基础.IUBMB寿命 63, 669–777 [公共医学][谷歌学者]
4Rahman S.、Blok R.B.、Dahl H.H.、Danks D.M、Kirby D.M、Chow C.W.、Christodoulou J.、Thorburn D.R（1996）Leigh综合征。临床特征、生化和DNA异常.安。神经。 39, 343–351 [公共医学][谷歌学者]
5Kirby D.M.、Crawford M.、Cleary M.A.、Dahl H.H.、Dennett X.、Thorburn D.R.（1999）呼吸链复合体I缺乏。未被诊断出的能量生成障碍.神经病学 52, 1255–1264 [公共医学][谷歌学者]
6Chinnery P.、Majama K.、Turnbull D.、Thorburn D.（2006）线粒体疾病的治疗.Cochrane数据库系统。版次。CD004426。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
7Klein J.A.、Longo-Guess C.M.、Rossmann M.P.、Seburn K.L.、Hurd R.E.、Frankel W.N.、Bronson R.T.、Ackerman S.L.（2002）小丑鼠突变下调凋亡诱导因子.自然 419, 367–374 [公共医学][谷歌学者]
8Joza N.、Oudit G.Y.、Brown D.、Bénit P.、Kassiri Z.、Vahsen N.、Benoit L.、Patel M.、Nowikovsky K.、Vassault A.、Backx P.H.、Wada T.、Kroemer G.、Rustin P.、Penninger J.M.（2005）肌肉特异性凋亡诱导因子缺失导致线粒体功能障碍、骨骼肌萎缩和扩张型心肌病.摩尔细胞生物学。 25, 10261–10272[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
9Pospisilik J.A.、Knauf C.、Joza N.、Benit P.、Orthofer M.、Cani P.D.、Ebersberger I.、Nakashima T.、Sarao R.、Neely G.、Esterbauer H.、Kozlov A.、Kahn C.R.、Kroemer G.、Rustin P.、Burcelin R.、Penninger J.M.（2007）靶向性缺失AIF可降低线粒体氧化磷酸化并防止肥胖和糖尿病.单元格 131, 476–491 [公共医学][谷歌学者]
10Ishimura R.、Martin G.R.、Ackerman S.L.（2008）凋亡诱导因子缺失导致细胞类型特异性神经发生缺陷.《神经科学杂志》。 28, 4938–4948[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
11Ghezzi D.、Sevrioukova I.、Invernizzi F.、Lamperti C.、Mora M.、D'Adamo P.、Novara F.、Zuffardi O.、Uziel G.、Zeviani M.（2010）与凋亡诱导因子突变相关的严重X连锁线粒体脑肌病.Am.J.Hum.遗传学。 86, 639–649[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12Ingraham C.A.、Burwell L.S.、Skalska J.、Brookes P.S.，Howell R.L.、Sheu S.和Pinkert C.A.（2009）NDUFS4.创建模拟复杂I障碍的小鼠模型.线粒体 9, 204–210[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
13Kruse S.E.、Watt W.C.、Marcinek D.J.、Kapur R.P.、Schenkman K.A.、Palmiter R.D.（2008）线粒体复合物I缺乏小鼠发生致命性脑肌病.单元格元数据。 7, 312–320[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
14Quintana A.、Kruse S.E.、Kapur R.P.、Sanz E.、Palmiter R.D.（2010年）大脑中Ndufs4缺失导致的复合物I缺乏导致类似Leigh综合征的进行性脑病.程序。国家。阿卡德。科学。美国。 107, 10996–11001[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
15Phipson B.、Smyth G.K.（2010年）置换P（P）-值不应为零。计算精确值P（P）-随机绘制排列时的值.统计应用程序。基因。分子生物学。 9，第39条[公共医学][谷歌学者]
16Irizarry R.A.、Hobbs B.、Collin F.、Beazer-Barclay Y.D.、Antonellis K.J.、Scherf U.、Speed T.P.（2003）高密度寡核苷酸阵列探针水平数据的探索、规范化和总结.生物统计学 4, 249–264 [公共医学][谷歌学者]
17Smyth G.K.（2004）微阵列实验中评估差异表达的线性模型和经验贝叶斯方法.统计应用程序。基因。分子生物学。 三，第3条[公共医学][谷歌学者]
18Dai M.、Wang P.、Boyd A.D.、Kostov G.、Athey B.、Jones E.G.、Bunney W.E.、Myers R.M.、Speed T.P.、Akil H.、Watson S.J.、Meng F.（2005）进化的基因/转录物定义显著改变了基因芯片数据的解释.核酸研究。 33，e175。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
19Wu D.、Lim E.、Vaillant F.、Asselin-Labat M.L.、Visvader J.E.、Smyth G.K.（2010）烤面包。复杂微阵列实验的旋转基因集测试.生物信息学 26, 2176–2182[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Subramanian A.、Tamayo P.、Mootha V.K.、Mukherjee S.、Ebert B.L.、Gillette M.A.、Paulovich A.、Pomeroy S.L.、Golub T.R.、Lander E.S.、Mesirov J.P.（2005）基因集富集分析。基于知识的全基因组表达谱解释方法.程序。国家。阿卡德。科学。美国。 102, 15545–15550[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
21McKenzie M.、Lazarou M.、Thorburn D.R.、Ryan M.T.（2006）Barth综合征患者线粒体呼吸链超复合体不稳定.分子生物学杂志。 361, 462–469 [公共医学][谷歌学者]
22.McKenzie M.、Lazarou M.、Thorburn D.R.、Ryan M.T.（2007）蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳分析线粒体亚单位组装成呼吸链复合物.分析。生物化学。 364, 128–137 [公共医学][谷歌学者]
23.Johnston A.J.、Hoogenraad J.、Dougan D.A.、Truscott K.N.、Yano M.、Mori M.、Hoorgenraad N.J.、Ryan M.T.（2002）人tom7在线粒体外膜前蛋白转锁酶复合体中的插入和组装.生物学杂志。化学。 277, 42197–42204 [公共医学][谷歌学者]
24Winkler C.、Denker K.、Wortelkamp S.、Sickmann A.（2007）银染色和考马斯染色方案。检测限和与ESI MS的兼容性.电泳 28, 2095–2099 [公共医学][谷歌学者]
25Pallotti F.、Lenaz G.（2001）动物细胞和组织培养系线粒体的分离和亚分离.方法细胞生物学。 65, 1–35 [公共医学][谷歌学者]
26Sims N.R.、Anderson M.F.（2008）Percoll密度梯度离心法分离大鼠脑线粒体.《国家协议》。 三, 1228–1239 [公共医学][谷歌学者]
27Wanders R.J.、Ruiter J.P.、Wijburg F.A.（1993年）渗透性人皮肤成纤维细胞线粒体氧化磷酸化的研究。线粒体脑肌病的应用.生物化学。生物物理学。学报 1181, 219–222 [公共医学][谷歌学者]
28Rashed M.S.、Bucknall M.P.、Little D.、Awad A.、Jacob M.、Alamoudi M.，Alwattar M.、Ozand P.T.（1997）采用微板分批处理和自动标记异常轮廓的计算机算法，通过电喷雾串联质谱法筛查先天性代谢错误血点.临床。化学。 43, 1129–1141 [公共医学][谷歌学者]
29van Vlies N.、Tian L.、Overmars H.、Bootsma A.H.、Kulik W.、Wanders R.J.、Wood P.A.、Vaz F.M.（2005）长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏小鼠肉碱和脂肪酸代谢特征.生物化学。J。 387, 185–193[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30.韦伯斯特·K·E、奥布莱恩·M·K、弗莱彻·S、克鲁瑟·P·E、阿波拉·U、克雷格·J、哈里森·D·K、昂·H、普提卡尼特·N、莱尔·R、米切姆·S·J、安东纳拉基斯·S·E、德·克雷泽·D·M、赫奇尔·M·P、彼得森·P、卡罗尔·B·J、斯科特·H·S（2005）Dnmt3L基因敲除小鼠精子发生中的减数分裂和表观遗传缺陷.程序。国家。阿卡德。科学。美国。 102, 4068–4073[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
31Kurts C.、Heath W.R.、Carbone F.R.、Allison J.、Miller J.F.、Kosaka H.（1996）自抗原的组成类I限制性外源呈递体内.实验医学学报 184, 923–930[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
32Chang Y.F.、Imam J.S.、Wilkinson M.F.（2007）非传感介导的衰变RNA监测途径.每年。生物化学评论。 76, 51–74 [公共医学][谷歌学者]
33Budde S.M.、van den Heuvel L.P.、Janssen A.J.、Smeets R.J.、Buskens C.A.、DeMeirleir L.、van Coster R.、Baethmann M.、Voit T.、Trijbels J.M.和Smeitink J.A.（2000）与核编码NDUFS4基因突变相关的复合酶复合物I和III缺陷.生物化学。生物物理学。Res.社区。 275, 63–68 [公共医学][谷歌学者]
34Petruzzella V.、Vergari R.、Puzziferri I.、Boffoli D.、Lamantea E.、Zeviani M.、Papa S.（2001）编码复合物I 18kDa（AQDQ）亚单位的NDUFS4基因无义突变导致类Leigh-like综合征患者复合物的组装和活性消失.嗯，分子遗传学。 10, 529–535 [公共医学][谷歌学者]
35.van den Heuvel L.、Ruitenbeek W.、Smeets R.、Gelman-Kohan Z.、Elpeleg O.、Loeffin J.、Trijbels F.、Mariman E.、de Bruijn D.、Smeitink J.（1998）人类复合物I缺乏症中新致病性突变的证明。编码18-kDa（AQDQ）亚单位的核基因中的5 bp重复.Am.J.Hum.遗传学。 62, 262–268[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
36Scacco S.、Petruzzella V.、Budde S.、Vergari R.、Tambora R.、Panelli D.、van den Heuvel L.P.、Smeitink J.A.、Papa S.（2003）复合物I 18-kDa（AQDQ）亚单位的人类NDUFS4基因的病理突变影响蛋白质的表达以及复合物的组装和功能.生物学杂志。化学。 278, 44161–44167 [公共医学][谷歌学者]
37Iuso A.、Scacco S.、Piccoli C.、Bellomo F.、Petruzzella V.、Trentadue R.、Minuto M.、Ripoli M.、Capitanio N.、Zeviani M.、Papa S.（2006）复合物I的NDUFS1和NDUFS4基因突变患者的细胞氧化代谢功能障碍.生物学杂志。化学。 281, 10374–10380 [公共医学][谷歌学者]
38Dunning C.J.、McKenzie M.、Sugiana C.、Lazarou M.、Silke J.、Connelly A.、Fletcher J.M.、Kirby D.M.、Thorburn D.R.、Ryan M.T.（2007）人类CIA30参与线粒体复合物I的早期组装及其基因突变导致疾病.EMBO J。 26, 3227–3237[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
39Ogilvie I.、Kennaway N.G.、Shoubridge E.A.（2005）在进行性脑病中线粒体复合物I组装的分子伴侣发生突变.临床杂志。投资。 115, 2784–2792[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
40Vogel R.O.、van den Brand M.A.、Rodenburg R.J.、van sen Heuvel L.P.、Tsuneoka M.、Smeitink J.A.、Nijtmans L.G.（2007）CI缺乏患者队列中复合物I组装伴侣B17.2L和NDUFAF1的研究.分子遗传学。Metab公司。 91, 176–182 [公共医学][谷歌学者]
41Lazarou M.、McKenzie M.、Ohtake A.、Thorburn D.R.、Ryan M.T.（2007年）线粒体和核DNA编码亚基在复合物I中的组装谱分析.摩尔细胞生物学。 27, 4228–4237[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
42Lawn R.M.、Wade D.P.、Garvin M.R.、Wang X.、Schwartz K.、Porter J.G.、Seilhamer J.J.、Vaughan A.M.、Oram J.F.（1999）丹吉尔病基因产物ABC1控制细胞载脂蛋白介导的脂质清除途径.临床杂志。投资。 104，R25–31[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
43Berge K.E.、Tian H.、Graf G.A.、Yu L.、Grishin N.V.、Schultz J.、Kwiterovich P.、Shan B.、Barnes R.、Hobbs H.H.（2000）相邻ABC转运体突变引起的谷甾醇血症中饮食胆固醇的积累.科学类 290, 1771–1775 [公共医学][谷歌学者]
44Gilbert N.、Bomar J.M.、Burmeister M.、Moran J.V.（2004）神经过敏小鼠中诱变B1反转录转座子插入的特性.嗯，变种人。 24, 9–13 [公共医学][谷歌学者]
45Druker R.、Whitelaw E.（2004）哺乳动物基因组中的逆转录转座子衍生元件。潜在的疾病来源.J.继承元。数字化信息系统。 27, 319–330 [公共医学][谷歌学者]
46顾Y.，Kodama H.，Watanabe S.，Kikuchi N.，Ishitsuka I.，Ozawa H.，Fujisawa C.，Shiga K.（2007）首例由Alu插入突变引起的Menkes病报道.大脑发育。 29, 105–108 [公共医学][谷歌学者]
47Jurka J.（1997）序列模式表明酶参与哺乳动物反转录子的整合.程序。国家。阿卡德。科学。美国。 94, 1872–1877[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
48Cost G.J.、Boeke J.D.（1998）人类反转录转座子整合的靶向性由L1内切酶对异常DNA结构区域的特异性决定.生物化学 37, 18081–18093 [公共医学][谷歌学者]
49Dewannieux M.、Esnault C.、Heidmann T.（2003）LINE介导的标记Alu序列的逆转录转座.自然遗传学。 35, 41–48 [公共医学][谷歌学者]
50Dewannieux M.、Heidmann T.（2005）L1介导的小鼠B1和B2 SINE在培养细胞中的逆转录转座.分子生物学杂志。 349, 241–247 [公共医学][谷歌学者]
51Su A.I.、Cooke M.P.、Ching K.A.、Hakak Y.、Walker J.R.、Wiltshire T.、Orth A.P.、Vega R.G.、Sapinoso L.M.、Moqrich A.、Patapoutian A.、Hampton G.M.，Schultz P.G.和Hogenesch J.B.（2002）人类和小鼠转录体的大规模分析.程序。国家。阿卡德。科学。美国。 99, 4465–4470[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
52Budde S.M.、van den Heuvel L.P.、Smeets R.J.、Skladal D.、Mayr J.A.、Boelen C.、Petruzzella V.、Papa S.、Smeitink J.A.（2003）线粒体复合体I NDUFS4基因突变患者的临床异质性.J.继承元。数字化信息系统。 26, 813–815 [公共医学][谷歌学者]
53Calvaruso M.A.、Willems P.、van den Brand M.、Valsecchi F.、Kruse S.、Palmiter R.、Smeitink J.、Nijtmans L.（2012）线粒体复合物III在不存在NDUFS4的情况下稳定复合物I以提供部分活性.嗯，分子遗传学。 21, 115–120 [公共医学][谷歌学者]
54DiMauro S.，Schon E.A.（2008）神经系统线粒体疾病.每年。神经科学评论。 31, 91–123 [公共医学][谷歌学者]
55Bélanger M.、Allaman I.、Magistretti P.J.（2011）脑能量代谢。关注星形胶质细胞-神经元代谢合作.单元格元数据。 14, 724–738 [公共医学][谷歌学者]
56Davey G.P.、Peuchen S.、Clark J.B.（1998）脑线粒体的能量阈值。神经退行性变的潜在参与.生物学杂志。化学。 273, 12753–12757 [公共医学][谷歌学者]
57Dubinsky J.M.（2009）神经系统线粒体的异质性。位置，位置，位置！ 实验神经学。 218, 293–307 [公共医学][谷歌学者]
58Ostergaard E.、Bradinova I.、Ravn S.H.、Hansen F.J.、Simeonov E.、Christensen E.、Wibrand F.、Schwartz M.（2005）SURF1突变患者的多毛症.美国医学遗传学杂志。A类 138, 384–388 [公共医学][谷歌学者]
59Kubota Y.、Ishii T.、Sugihara H.、Goto Y.、Mizoguchi M.（1999）线粒体脑肌病伴乳酸酸中毒和中风发作患者的皮肤表现（MELAS综合征）.美国学术期刊。皮肤病。 41, 469–473 [公共医学][谷歌学者]
60Bodemer C.、Rötig A.、Rustin P.、Cormier V.、Niaude P.、Saudubray J.M.、Rabier D.、Munnich A.、de Prost Y.（1999）头发和皮肤疾病是线粒体疾病的征兆.儿科 103, 428–433 [公共医学][谷歌学者]
61Silengo M.、Valenzise M.、Spada M.，Ferrero G.B.、Ferraris S.、Dassi P.、Jarre L.（2003）头发异常是线粒体疾病的征兆.《欧洲儿科杂志》。 162, 459–461 [公共医学][谷歌学者]
62Trifunovic A.、Wredenberg A.、Falkenberg M.、Spelbrink J.N.、Rovio A.T.、Bruder C.E.、Bohlooly-Y M.、Gidlöf S.、Oldfors A.、Wibom R.、Törnell J.、Jacobs H.T.、Larsson N.G.（2004）线粒体DNA聚合酶缺陷小鼠的早衰.自然 429, 417–423 [公共医学][谷歌学者]
63库霍斯·G.C.、希奥纳·A.、普格·T.D.、萨米亚·S.、装甲K、沃尔杰茅斯·S.E.、霍弗·T、塞奥·A.、沙利文·R、小丑·W·A、莫罗·J·D、范·雷曼·H、塞迪维·J·M、山崎·T、田库拉·M、温德鲁克·R、列文伯格·C、普罗拉·T·A（2005）哺乳动物衰老过程中线粒体DNA突变、氧化应激和凋亡.科学类 309, 481–484 [公共医学][谷歌学者]
64Mckenzie M.、Ryan M.T.（2010年）人类线粒体复合体I的组装因子及其在疾病中的缺陷.IUBMB寿命 62, 497–502 [公共医学][谷歌学者]
65.马特伦·D（2008）3.2酰肉碱，包括体外负载测试.英寸生物化学遗传学方法实验室指南第26版（Blau N.、Duran M.、Gibson K.M.编辑）第171–206页，柏林斯普林格出版社[谷歌学者]
66Houten S.M.、Wanders R.J.（2010年）线粒体脂肪酸β-氧化生物化学概述.J.继承元。数字化信息系统。 33, 469–477[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
67Rubio-Gozalbo M.E.、Sengers R.C.、Trijbels J.M.、Doesburg W.H.、Janssen A.J.、Verbeek A.L.、Smeitink J.A.（2000）一个预后指标作为疑似线粒体细胞病儿童的诊断策略.神经儿科 31, 114–121 [公共医学][谷歌学者]
68Naini A.、Kaufmann P.、Shanske S.、Engelstad K.、De Vivo D.C.、Schon E.A.（2005）MELAS患者的低瓜氨酸血症。深入了解“MELAS悖论” 神经学杂志。科学。 229, 187–193 [公共医学][谷歌学者]
69Parfait B.、de Lonlay P.、von Kleist-Retzow J.C.、Cormier-Daire V.、Chrétien D.、Rötig A.、Rabier D.、Saudubray J.M.、Rustin P.、Munnich A.（1999）神经源性虚弱、共济失调和视网膜色素变性（NARP）综合征mtDNA突变（T8993G）引发肌肉ATP酶缺乏和低瓜氨酸血症.《欧洲儿科杂志》。 158, 55–58 [公共医学][谷歌学者]
70Morava E.、Hogeveen M.、De Vries M.、Ruitenbeek W.、De Boode W.P.、Smeitink J.（2006）正常血清丙氨酸浓度可区分短暂性新生儿乳酸血症和先天性能量代谢障碍.新生儿生物 90, 207–209 [公共医学][谷歌学者]
文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会