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细胞生理学杂志。作者手稿；可在PMC 2012年6月7日获得。
以最终编辑形式发布为：
细胞生理学杂志。2011年2月；226(2): 293–298.
doi（操作界面）：10.1002/jcp.22420
预防性维修识别码：项目经理3369573
NIHMSID公司：NIHMS366428
PMID：20857416

正确沉积和去除Suz12和H2A需要RARγ。胚胎干细胞中的Z

拉蒙·阿马特和洛林·J·古达斯*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

维甲酸（RA）诱导胚胎干细胞分化。RA的作用由维甲酸受体（RAR）介导，后者促进控制基因转录的表观遗传变化。我们在此表明，在没有配体RA的情况下，组蛋白变体H2A的沉积需要RARγ。Z和Polycomb蛋白Suz12位于RA靶基因，并且RARγ和Suz12都存在于缺乏配体的多蛋白复合体中。添加RA会去除H2A。当这些基因被转录激活时，来自RARγ靶基因的Z和Suz12。

关键词：多梳组，表观遗传，基因表达，维甲酸

引言

胚胎干细胞是多能干细胞，具有分化为多种类型细胞的潜能(Kashyap等人，2009年). 维甲酸（RA）是维生素A最有效的天然形式，可以诱导ES细胞分化为不同的细胞类型(Eiges和Benvenisty，2002年;Rohwedel等人，1999年;Schuldiner等人，2000年). 类视黄醇的生物效应主要由两类核受体介导：RARs和RXRs，它们由六个不同的基因编码：RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ和RXRγ(曼格尔斯多夫，1994年). 特别有趣的是，RARγ在小鼠和人类未分化ES细胞和F9干细胞中以及在早期胚胎体形成期间表现出类似的表达模式(Jeong和Mangelsdorf，2009年;苏和古达斯，2008年).

RA促进表观遗传变化。RA治疗ES细胞降低H3k27me3并增加H3k4me3标记(Campos和Reinberg，2009年). 此外，RA取代了F9细胞中一些RA反应元件（RARE）中的Suz12(Gillespie和Gudas，2007年;Lee等人，2007b). Suz12是参与H3K27me3甲基化和维持ES细胞自我更新的多梳抑制复合物-2（PRC2）的成员，是同源异型盒（Hox）基因表达的强大抑制剂(Lee等人，2006b). Hox基因簇在ES细胞分化过程中表达，并被RA转录激活(Gillespie和Gudas，2007年;兰斯顿和古达斯，1994年;Maingue等人，2003年;Tarchini和Duboule，2006年).

组蛋白H2A变体H2A。Z特别有趣，因为它对多细胞生物至关重要(Faast等人，2001年;Ridgway等人，2004年). 在哺乳动物细胞中，H2A。Z位点主要位于RNA聚合酶II占据的位点以及增强子区域(Barski等人，2007年). 在未分化的ES细胞H2A中。Z以与PRC2蛋白Suz12非常相似的方式富集了大量沉默的发育基因(Boyer等人，2006年;Creyghton等人，2008年). 此外，H2A。正常ES细胞分化需要Z表达(Creyghton等人，2008年).

我们在这里显示H2A。Z在RARγ靶基因的未分化ES细胞中高度富集，这与Suz12的占有率和这些基因上H3k27me3标记的存在相关。重要的是，这些基因在未分化的ES细胞中不表达。我们还证明，RA治疗后，基因转录被激活，并伴有H2A的减少。Z占用和移除Suz12。此外，我们还表明RARγ对H2A很重要。在无RA培养的ES细胞中招募Z和Suz12。我们的研究还表明，在未分化细胞中，RARγ与Suz12存在于多蛋白复合物中；RA治疗会干扰RARγ与Suz12的相互作用。总之，我们的发现确立了H2A中RARγ的关键作用。在没有RA和去除H2A的情况下，Z和Suz12招募到ES细胞中的RA靶基因。RA治疗后的Z和Suz12蛋白。

材料和方法

细胞培养

如前所述，使用小鼠ES细胞和全反式维甲酸（Sigma）(Chen等人，2003年). RARγ敲除（KO）ES细胞的产生如所述（Kashyap等人，2010年提交）。

抗体

抗HA（#ab9110）、抗H3k27me3（#ab6002）和抗H2A。Z（#ab4174）抗体购自Abcam。抗Suz12（#3737）抗体是从细胞信号技术获得的。抗Ash2l（A300-107A）从Bethyl实验室获得。二级抗兔IgG（#sc-2027）抗体从圣克鲁斯生物技术公司获得。如前所述生成抗-RARγ(Gillespie和Gudas，2007年).

RNA分析

在Trizol（Invitrogen）中采集细胞，并按照制造商的方案和所述提取总细胞RNA(Kashyap等人，2009年).

染色质免疫沉淀

如前所述进行ChIP和两步ChIP（HA-ChIP）(Kashyap等人，2009年).

半定量和实时PCR分析

使用商业Taq聚合酶（Quanta）进行半定量PCR。如前所述，在Bio-Rad iCycler上进行PCR反应(Kashyap等人，2009年).

免疫沉淀（IP）

将COS、CCE和RARγKO细胞在含有蛋白酶抑制剂混合物的50mM Tris-HCl、0.1M NaCl、10mM EDTA、1%Nonide P-40（pH 7.4）中制备全细胞裂解物（罗氏诊断公司）。根据制造商的说明，使用Trueblot抗兔Ig IP珠（加利福尼亚州圣地亚哥eBioscience），使用500μg或1mg总蛋白对全细胞裂解液进行IP处理。通过SDS-PAGE凝胶分离蛋白质，并将其转移到Immobilion-P膜（Millipore）上。

蛋白质印迹分析

在含有蛋白酶抑制剂混合物的50mM Tris-HCl、0.1M NaCl、10mM EDTA、1%Nonide P-40（pH 7.4）中溶解WT CCE、RARγKO和COS细胞（罗氏诊断公司）。将样品煮沸，在SDS-PAGE凝胶上分离20–40μg蛋白质样品，并转移到硝化纤维素膜上。

结果和讨论

RARγ和Suz12存在于相同的多蛋白复合物中体内小鼠ES细胞；这种相互作用被RA抑制

RAR与一些组蛋白修饰复合物相互作用(Blanco等人，1998年;Dietze等人，2003年;Dilworth等人，2000年;Flajollet等人，2006年;Fujiki等人，2009年;Lee等人，2006a). Suz12是一种PRC2成分，被招募到F9细胞中的一些RARγ靶基因中(Gillespie和Gudas，2007年). 基于这些原因，我们测试了Suz12和RARγ相互作用的可能性。首先，我们在COS细胞中过度表达RARγ-HA（血凝素）标记的融合蛋白，然后使用HA抗体免疫沉淀（IP）RARγ。在HA-IP提取物中，我们检测到Suz12，表明Suz12和RARγ可以相互作用体内(图1A). 由于我们有兴趣了解胚胎干细胞中RARγ的相互作用伙伴，我们还对小鼠野生型（WT）胚胎干细胞进行了co-IP分析。当使用抗Suz12抗体（Ab）对细胞提取物进行IP处理时，我们在未经处理的ES细胞的IP材料中发现大量RARγ(图1B). 该信号对RARγ具有特异性，我们在ES RARγ敲除（KO）细胞中没有检测到任何信号(图1B).

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RARγ在体内与Suz12相互作用。（A） RARγ与Suz12相互作用的免疫沉淀（IP）分析。转染eGFP或RARγ-HA表达载体的COS细胞。细胞提取物使用抗HA抗体进行IP，并使用抗Suz12抗体进行免疫印迹（IB）（顶面板）。在IP（中间面板）或抗-HA之前，用抗Suz12探针检测全细胞提取物，以确认等效的Suz12输入，以检查RARγ-HA表达（底部面板）。（B） ES细胞提取物使用Suz12 Ab进行IPd，IBd使用抗RARγAb（顶部面板）。用抗Suz12抗体对全细胞提取物进行检测，以确认IP前的等效Suz12水平（底部面板）。这个实验进行了三次。

由于RA处理后F9细胞中的Suz12从某些RA靶基因中去除，我们研究了RA对ES细胞中RARγ和Suz12相互作用的影响。我们观察到，在RA治疗后，RARγ和Suz12之间的相互作用受损(图1B). 其他人认为，暴露于RA后，Suz12蛋白水平下降(Lee等人，2007a); 然而，我们没有观察到RA 24小时后Suz12总蛋白水平的变化（输入水平，图1B). 综上所述，这些结果首次表明RARγ仅在未分化的ES细胞中与PRC2成分相互作用。在RA存在下，我们没有观察到RARγ和Suz12之间的任何相互作用，这表明配体改变了多蛋白复合物的结构。我们不能忽视RARγ与其他组蛋白修饰复合物（如MLL）相互作用的可能性。虽然我们无法在ES细胞中检测到RARγ和Ash2L（MLL的一种常见成分）之间的相互作用，但当我们在COS细胞中过度表达Ash2L和RARγ时，我们确实在HA IP提取物中检测到了Ash2L（补充图S1）。

RARγ与RARβ2、Cyp26a1和C/EBPα的启动子区结合；RA在ES细胞中转录激活的基因

我们之前发现RARγ在RARβ启动子中与RARE结合2F9细胞中的Cyp26a1(Gillespie和Gudas，2007年). 为了确定RARγ是否在ES细胞的这些区域结合，我们在RARγ-KO ES细胞系中将RARγ替换为RARγ-HA（见上一节）(图2B). 我们使用HA抗体进行染色质免疫沉淀（ChIP），观察到RARγ-HA与RARβ结合2和Cyp26a1 RARE(图2A). 我们发现，即使在没有RA的情况下，RARγ-HA也是结合的，这与RAR作用的模型一致(Chambon，1996年). RA处理RARγ（KO）-RARγ-HA恢复的ES细胞后，RARγ-HA结合与未处理细胞中的结合没有显示出统计差异。我们还测量了RARγ-HA在C/EBPα基因上的结合，因为研究人员之前通过ChIP-on-ChIP表明，RARγ在RA 2h后结合在其启动子区域(Delacroix等人，2010年). 我们的结果表明，即使在未经处理的ES细胞中，RARγ-HA也与C/EBPα的启动子区结合。因此，RA没有增加C/EBPα启动子处的RARγ-HA结合，如RARβ2和Cyp26a1启动子。我们还观察到RARβ2RA处理WT ES细胞后，Cyp26a1和C/EBPα转录水平显著增加。然而，在RARγ-KO细胞中，RA对这些基因的诱导作用严重降低(图2C).

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ES细胞中RARγ与RAR靶基因的结合。ES RARγKO或RARγ-HA修复细胞培养+/-1μM RA 24h。（A） 使用HA Ab或IgG进行ChIP，并通过实时PCR定量结合DNA。数据显示为RARβ2或Cyp26a1启动子的折叠富集（平均值±S.E.）。误差条表示由GAPDH DNA校正的三个生物复制品的标准误差，用于归一化。统计显著性差异（p<0.05），星号。（B） C/EBPα启动子RARγ-HA结合的半定量PCR。（C） 用抗HA抗体检测RARγ-KO、RARγ-HA修复或WT ES细胞的全细胞提取物，以确认RARγ-HA的表达。三种不同生物复制品的代表性Western blotting（顶部面板）。RARγ-HA的IP分析（下图）。ES细胞提取物使用针对HA的Ab进行IP’d，IB’d使用抗HA Ab。（d）WT和RARγKO ES细胞培养−/+1μM RA 24小时。通过定量RT-PCR测定RA靶基因mRNA的诱导。误差条，三个生物复制品的标准误差。E的数据归一化为36B4 mRNA。统计学显著差异（p<0.05）、星号（RA vs-）和#（WT vs RARγKO）。

WT细胞中的Suz12水平在RARγ靶基因处较高，而RARγ敲除ES细胞系显示Suz12的水平降低

我们发现RARγ和Suz12一起存在于ES细胞中的多蛋白复合物中。然后，我们研究了RARγ靶基因RARβ调控区的Suz12招募2和Cyp26a1。使用ChIP，我们表明Suz12被高度招募到RARβ2WT ES细胞中含有RARE的Cyp26a1启动子(图3A). 此外，在WT ES细胞的这些启动子区域存在H3k27me3标记（与PRC2活性相关）(图3B). 我们观察到，2h RA治疗导致Suz12减少50%，H3k27me3减少25%；当Suz12和H3k27me3标记都被完全去除时，加入RA后24和72小时，这些变化甚至更大，与WT ES细胞中RARγ靶基因的IgG水平相等(图3B).

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Suz12和H3k27me3蛋白存在于WT ES细胞的RARβ2和Cyp26a1 RARE中。WT和RARγKO ES细胞经+/-1μM RA处理2、24或72h。使用抗Suz12（A）或抗H3k27me3 Ab（B）进行ChIP，并通过实时PCR定量结合DNA。每个实验至少重复三次。数据显示为IP前输入DNA的%（平均值±S.E.），并通过GAPDH DNA结合进行标准化。误差条，三个生物复制品的标准误差。统计学显著差异（p<0.05），星号（RA vs-）和#（WT vs RARγKO）。

然后，我们通过比较ES-WT和RARγ-KO细胞中Suz12和H3k27me3的占有率来确定RARγ的影响(图3A、B). 我们观察到，在基础条件下，ES RARγ-KO细胞中Suz12水平和H3k27me3标记均降低，尤其是在RARβ2启动子，其中减少了25-50%。这些结果表明，即使在没有RA的情况下，RARγ对这些染色质成分的正确沉积也起着重要作用。

然后我们研究了Suz12在Hoxa1基因簇上的占有率，该基因簇是Suz12-RARγ靶点(Gillespie和Gudas，2007年; Kashyap等人提交）。我们分析了Suz12在近端启动子（PP）和位于基因下游约2kb的RARE元件的招募(兰斯顿和古达斯，1992年). Suz12在这两个地区的入住率都很高，在RA治疗后，Suz12被解雇(图4). 然而，当我们比较了Suz12在WT和RARγ-KO ES细胞中的占有率时，我们发现在RARγKO细胞系中Suz12水平降低(图4). 有趣的是，我们发现在RARγ-KO细胞中，Suz12在Hoxa1 RARE区的含量低于PP区，这表明RARγ对Suz12与RARE结合的重要性。根据ChIP数据和上一节的结果，我们提出，在基础条件下，当基因未被转录激活时，在ES细胞中RARγ靶基因的调节区，RARγ和PRC2蛋白存在于相同的多蛋白复合体中。在RA存在的情况下，RARγ和PRC2相互作用被破坏，PRC2蛋白从调控区域中移除，导致转录激活。

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Suz12存在于Hoxa1 RARE下游3′端和WT ES细胞的近端启动子区。WT和RARγKO ES细胞经+/-1μM RA处理2、24或72小时。使用抗Suz12抗体进行ChIP，并通过实时PCR在RARE（A）或Hoxa1 PP区域（B）定量结合DNA。每个实验至少重复三次。数据以IP前输入DNA的%s表示（平均值±s.E.），并通过GAPDH DNA结合进行归一化。误差条，三个生物复制品的标准误差。统计学显著差异（p<0.05），星号（RA vs-）和#（WT vs RARγKO）。352×264mm（72×72 DPI）

H2A。RARE和H2A的Z入住率较高。RA治疗后Z被移除

H2A。在未分化ES细胞中，Z占用率与Suz12占用率有很高的重叠(Creyghton等人，2008年). 此外，H2A。Z与ERα的信号传递有关(Gevry等人，2009年)，一种与RAR结构相似的受体。基于这些原因，我们确定一些RARγ靶基因是否显示H2A。Z招聘。使用H2A的ChIP。Z Ab检测到高水平的H2A。RARβ处的Z2、Cyp26a1和Hoxa1 RARE，以及ES WT细胞中的Hoxa1 PP，而RA显著降低H2A。这些区域中的Z级别(图5A). 我们在不同的时间点执行ChIP，并观察到H2A。Z被缓慢移除，而不是Suz12（参见图3A,​,4).4). 2小时和3小时(图5A，数据未显示）。Z水平与未经处理的WT细胞相似或甚至更高。然而，在24小时RA治疗后，H2A。Z水平大大降低，72小时H2A后。Z水平与IgG信号相当。这些数据表明H2A的动态不同。与Suz12相比，从RA靶基因中去除Z。因为我们在ES RARγ-KO细胞中观察到Suz12招募的主要差异，所以我们比较了H2A。含H2A的RARγ-KO细胞中的Z占位。WT RARγKO ES细胞的Z占用率显示H2A减少50%。与WT ES细胞相比的Z水平(图5A)在RARβ2、Cyp26a1和Hoxa1 PP/RARE区域。此外，RA对H2A的影响。与野生型相比，RARγ-KO细胞中Z的去除严重受损。我们观察到，RA野生型ES细胞24小时后H2A减少75%。Z。然而，H2A。RA处理24小时后，RARγKO ES细胞中的Z水平与未处理的RARγKO ES细胞中的Z水平相似。我们考虑了RA治疗或RARγ丢失是否影响H2A。Z蛋白水平。我们对WT和RARγKO ES细胞进行了Western blotting，并观察到H2A。RA处理两种ES细胞株后，Z蛋白水平没有变化(图5C).

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H2A。Z存在于RARγ靶基因中，且在RA处理ES细胞后其水平降低。ES WT和RARγKO细胞经+/-1μM RA处理2、24或72小时。使用抗H2A进行ChIP。通过实时PCR定量Z Ab（A）和结合DNA。每个实验至少重复三次。数据表示为IP前输入DNA的%s（平均值±s.E.），并归一化为结合GAPDH DNA。误差条，三个生物复制品的标准误差。统计学显著差异（p<0.05），星号（RA vs-）和#（WT vs RARγKO）。（B） 显示H2A的三种免疫印迹的代表性。WT和RARγ-KO细胞中的Z蛋白水平。

总的来说，我们展示了H2A。Z募集受ES细胞中维甲酸信号通路的影响。我们显示H2A。Z存在于RARγ靶基因上，当这些基因在ES细胞中转录激活时，在添加RA后从这些靶基因中移除；这与H2A的报告结果不同。Z和雌激素受体α（ERα）靶点(Gevry等人，2009年). 尽管我们描述了RARγ和Suz12之间的相互作用，但我们未能检测到H2A。Z使用来自RARγ（KO）/RARγ-HA细胞提取物的HA Ab至IP RARγ-HA（数据未显示）。应该注意的是，H2A。Z显示的时间进程与Suz12删除的时间进程不同。RA早在2h时就促进了Suz12的去除。添加RA后2h，Z水平与基础水平保持一致。直到加入RA后24小时，我们才观察到H2A减少了约75%。Z占用，表示不同的移除机制。此外，我们发现H2A。RA后RARγ-KO细胞系中Z的去除严重受损(图5A)与Suz12相反，Suz12最终从RA靶基因中移除，即使没有RARγ(图3,​,44).

我们的数据表明，RARγ对H2A的正确沉积是必要的。RA靶基因上的Z和PRC2。这是H2A第一次出现。Z招募与RAR以及特定RAR亚型对Suz12和H2A沉积的重要性有关。ES细胞中的Z已经被证实。此外，RA大大降低了H2A。RA靶基因转录激活时的Z占据率。

致谢

我们感谢Kristian Laursen博士提供的RARγ-HA表达载体，Pierre Chambon博士提供的RAγ-KO小鼠，Tamara Weissman提供的编辑帮助，以及Vasundhra Kashyap批判性阅读本手稿。本研究由NIH RO1 CA043796向Lorraine J.Gudas博士提供支持。

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