MicroRNAs（miRNAs）是一大家族短的非编码RNA，在转录后抑制后生动物的基因表达。成熟的miRNA由初级miRNA转录物（pri-miRNAs）通过微处理器的顺序裂解产生(1,2)和Dicer(三,4)酶复合物分别释放前miRNA和成熟miRNA物种。据报道，miRNA表达的转录后控制发生在组织特异性(5)和发展调节时尚(6-8). 胚胎组织中一些前miRNAs的加工被阻断，只有在发育过程中才会激活加工。此外，据报道，某些前miRNAs在人类中高度表达(9)以及小鼠胚胎干细胞（ES）、小鼠胚胎癌细胞（EC）和人类原发性肿瘤；然而，相应的成熟物种无法检测到(7). 这表明miRNA生物发生中可能存在转录后阻滞，其机制尚不清楚。在ES和EC细胞中，微处理器处理块的大小对于let-7 miRNAs家族的成员来说是最显著的，尽管有人提出所有miRNA的处理都可能在微处理器步骤中进行调节(7)
我们观察到，在ES细胞中很容易检测到pri-let-7g转录物，并且在分化为胚状体的过程中保持相对稳定的水平(). 相反，在未分化的ES细胞中检测不到成熟let-7g，但在分化第10天后强烈诱导(). 在用维甲酸分化P19 EC细胞的过程中，还报道了let-7g表达的转录后诱导(7). 我们试图了解EC和ES细胞中miRNA处理中转录后阻滞的机制。我们首先比较了不同细胞类型的细胞提取物在体外抑制微处理器介导的pri-miRNA底物与相应的前miRNAs裂解的能力(). 放射性标记的pri-miRNA底物与细胞提取物预先孵育，然后通过亲和纯化微处理器复合物进行处理。尽管来自未分化P19细胞的提取物容易抑制微处理器介导的pri-let-7g到pre-let-7 g的分裂，但来自分化小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的细胞提取物不抑制分裂。因此，在我们的体外检测中，体内微处理器处理块的细胞类型特异性被重新概括。
pri-let-7g处理的转录后控制一pri-let-7g转录本的RT-PCR（如参考文献所述(7))ES向类胚体分化期间。肌动蛋白起控制作用.b类Northern blot显示，在类胚体形成过程中成熟let-7g的转录后诱导5S rRNA可作为负荷控制。c（c）,在体外以放射性标记的pri-let-7g为底物的pri-miRNA加工反应。如方法中所述，在与Flag-Drosha免疫沉淀物反应之前，将Pri-miRNA与各种数量的P19细胞提取物或小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）提取物预先孵育。前miRNA与前miRNA的比值通过密度测定法进行量化，并将数值标准化为微处理器专用车道。d日无饲料小鼠胚胎干细胞系（J1 ES）类胚体形成过程中基因表达的qPCR分析。顶部面板：前叶-7g和成熟叶-7g；中间面板：林-28；底部面板：多能性因子Oct-4和Nanog。
我们推测ES和EC细胞中存在的一个或多个蛋白因子可能抑制微加工物介导的前miRNAs加工，我们采用生化方法鉴定该因子。使用标记的pre-let-7g探针进行电泳凝胶迁移率变化分析，发现P19 EC和ES提取物中存在特定的带移，但MEF提取物中没有(图S1). 这表明pre-let-7g可以用作有效的亲和试剂，用于纯化微处理器处理块的相关因子。Pre-let-7g与琼脂糖珠结合，并与P19细胞的全细胞提取物孵育。亲和洗脱液进行SDS-聚丙烯酰胺电泳（PAGE），然后进行胶体染色。切除带并对其进行三段质谱测序(图S2). 测序揭示了几种与前let-7g共纯化的RNA结合蛋白。这些蛋白质中的许多以前被鉴定为一个大型微加工蛋白复合物的成员(2) (图S2).
前let-7g相互作用蛋白之一是小而高保守的RNA结合蛋白Lin-28。Lin-28是一个有吸引力的候选基因，原因如下：1）其RNA-结合域内的突变已被证明会损害秀丽线虫的发育时间调节(10); 2） 它在未分化的P19细胞、小鼠ES细胞中特异性表达(11)和人类ES细胞(12)分化时下调；和3）哺乳动物Lin-28同源物Lin-28B在肝细胞癌中过表达，该基因的过表达促进体外癌细胞增殖(13); 4） 据报道，Lin-28在胚胎肌肉、神经元和上皮细胞中以阶段特异的方式表达，并且Lin-28对骨骼肌的适当分化至关重要(11); 5） 最近，Lin-28与其他三种因子一起被用于重新编程人类体细胞成纤维细胞，使其具有多能性(14).
我们研究了类胚体形成过程中Lin-28表达的动力学(). Lin-28在ES细胞分化时下调，与已知的多潜能因子Oct-4和Nanog相关的动力学延迟。Lin-28的这种下调在时间上与pri-let-7处理的激活相一致().
为了探索Lin-28可能调节pri-let-7处理的可能性，我们确认Lin-28在共沉淀分析中能够结合pre-let-7g和pri-let.7g(图S3). 然后，我们测试了Lin-28在体外功能性阻断pri-miRNA加工的能力。我们观察到，含有Flag-Lin-28的Flag-Immunoprecitate在体外能有效抑制pri-let-7a和pri-let.7g的处理。含有对照RNA-结合蛋白Flag-hnRNPA1和Flag-Msi-2的标记免疫沉淀对pri-let-7a和pri-let-1g的处理没有影响(). Flag-Lin-28免疫沉淀物没有损害pri-miR15a/16-1的加工，表明miRNA加工块的选择性(). 接下来我们纯化了细菌表达的His-Lin-28()并测试了重组Lin-28（rLin-28）在体外阻断pri-miRNA处理的能力。rLin-28抑制了pri-let-7a和pri-let.7g的加工(). 因此，Lin-28足以在微处理器步骤中抑制miRNA处理。
Lin-28抑制pri-miRNA处理在体外一，α–Flag-Western以确认用于在体外分析。b条,在体外在存在Mock、Flag-Lin-28、Flag-hnRNPA1或Flag-Msi-2免疫沉淀物的情况下，pri-let-7g（左面板）和pri-let-1a（右面板）底物上的pri-miRNA处理反应。定量标准化为微处理器专用通道。c（c）,在体外在存在模拟或Flag-Lin-28免疫沉淀物和竞争性tRNA的情况下，pri-miRNA在pri-let-7g（左面板）和pri-miR-15a/16-1（右面板）底物上的加工反应。定量标准化为mock-IP平面。d日,在体外在rHis-Lin-28存在下，在pri-let-7g（左图）和pri-let-7a（右图）底物上的pri-miRNA处理反应。定量标准化为微处理器专用通道。
为了确定Lin-28是否能够阻断体内miRNA处理，在存在或不存在小鼠Lin-28 cDNA的情况下，将四个pri-miRNAs导入293T细胞，这是一种缺乏Lin-28的转化人类细胞系。在没有Lin-28的情况下，所有异位的pri-miRNAs都被有效地加工成成熟形式(和图S4). 然而，Lin-28的异位表达完全阻断了pri-let-7a和pri-let-17g的加工，而pri-miR-15a和pri-miR-122的加工在很大程度上未受影响(和图S4). pri-let-7g和Lin-28的共转染导致pri-let.7g的积累()与Lin-28在微处理器步骤中阻止miRNA处理的概念一致。我们用四种控制RNA结合蛋白（YBX-1、Msi-2、hnRNPA1和hnRNPL(和图S5). 最后，为了测试Lin-28是否能够阻断内源性miRNA的加工（而不是仅仅阻断异位表达的pri-miRNA的加工），我们将Lin-28 cDNA转染到293T细胞中，并在4天后通过定量PCR测量几种成熟miRNA的水平。我们观察到成熟let-7家族成员内源性水平下降；内源性成熟miR-21水平未受影响(). Lin-28过度表达后成熟let-7g的减少伴随着pri-let-7g水平的相应增加().
Lin-28的异位表达选择性抑制pri-miRNA加工体内一在每一组中，293T细胞要么未经转染（第1条通道），要么与指示的pri-miRNA和0.5μg pCMV-Flag空载体（第2条通道）共转染，要么与指定的pri-mi RNA和0.5微g Flag-Lin-28 cDNA共转染。在转染后40小时收集总RNA，并对指示的miRNA进行Northern印迹。b条，a）中样品的pri-let-7g水平的qPCR分析（右上图）。c（c）用定量PCR测定293T细胞与pri-let-7g和pCMV-Flag、Flag-Lin-28、Flag-hnRNPA1、Flag-hnRNPL、Flage-YBX-1或Flag-Msi-2 cDNA共转染后的成熟let-7g水平。首先，相对于未转染的对照细胞计算每个样本中成熟let-7g的数量，然后将Flag-protein联合转染的样本归一化为相应的pCMV-Flag联合转染样本。d日，qPCR显示在293T细胞中转染Flag-Lin-28后内源性成熟miRNA水平的变化。e（电子），qPCR显示在293T细胞中转染Flag-Lin-28后内源性pri-let-7g积聚。对于c-e公司，数值为两个或多个独立转染的平均+/-S.E.M。
我们试图确定Lin-28是否是胚胎细胞中miRNA加工的内源性阻断剂。我们使用三种不同的shRNA发夹和一种靶向Lin-28的siRNA来敲低P19 EC细胞中的内源性Lin-28()和ES细胞(图S6). 敲除Lin-28导致两个P19细胞中成熟let-7g的诱导()和ES细胞(图S4b)表明Lin-28可以抑制体内miRNA的加工(). 所有接受测试的let-7家族成员在击倒Lin-28后都显著上调，而其他miRNAs的水平没有变化(和图S7). 成熟let-7 miRNAs的诱导发生在Lin-28基因敲除后60小时内，而let-7 micRNAs通常仅在ES和P19分化10天后诱导，此时内源性Lin-28水平下降(、和参考(7)). 因此，我们观察到的诱导可能代表Lin-28对pri-miRNA加工的直接影响，而不是细胞分化的间接结果。为了支持这一观点，我们观察到，在我们的实验过程中，在击倒Lin-28后，多能性标记物Oct-4和Nanog的水平没有下降(). 此外，在Lin-28基因敲除后，全球miRNA分析仅检测到let-7 miRNAs上调，突显了Lin-28在调节let-7 micRNAs方面的特异性(图S7).
击倒Lin-28解除了miRNA处理障碍用对照发夹（GFPi）、靶向Lin-28的pLKO.1-shRNA发夹、对照siRNA（扰乱序列）或Lin-28 siRNA转染P19细胞。转染后60小时收集总RNA进行分析。一，Lin-28表达的定量PCR分析，使用控制发夹或控制siRNA标准化为Lin-28的表达，用于b条.b条成熟let-7g的Northern杂交。c（c），使用Lin28-SI2在d日误差条表示S.E.M.，N=3。d日定量PCR分析敲除Lin-28后成熟miRNA水平的变化。误差条表示标准误差，N=3。e（电子），P19细胞中敲低Lin-28后的pri-let-7g水平。误差条表示标准误差，N=3。如果、用对照siRNA或Lin28-SI2转染的P19细胞中的多能性标记物Oct-4和Nanog水平。误差条表示标准误差，N=3。
Lin-28同源物Lin-28B在人类肝细胞癌和几种癌细胞系中过表达(13). 报道了Lin-28B的两种亚型，其5'外显子不同。短亚型（Lin-28B-S）保留了长亚型（Lin-28B-L）中也存在的两个逆转录病毒型CCHC锌指基序，但包含截断的冷休克域。Lin-28B-L过表达诱导癌细胞生长，而Lin-28B-S过表达没有影响(13). 我们发现Lin-28B-L能有效抑制pri-let-7g的处理(图S8)而Lin-28B-S没有。这表明，之前报道的Lin-28B致癌特性可能通过阻断let-7处理而介导，至少部分是这样。我们的结果还表明，Lin-28和Lin-28B可能需要冷激波结构域和CCHC锌指来阻断活性。有趣的是，Lin-28和Lin-28B是唯一包含这两个结构域的动物蛋白(15).
我们的结果表明，Lin-28在体外和体内都足以阻断let-7家族成员的pri-miRNA加工。ES和EC细胞具有转录后调节let-7 miRNA表达的机制可能有几个原因。首先，miRNA处理的转录后激活允许通过下调单个因子快速诱导多个let-7 miRNA。其次，DGCR8是一种dsRNA-结合蛋白，是微处理器复合体的重要组成部分，其破坏会干扰ES细胞的分化，这表明miRNAs的激活可能对沉默自我更新机制很重要(16). 有人认为，转录后控制可以阻止ES和EC细胞产生即使是少量的let-7，从而严格维持未分化状态(7). 第三，miRNA表达的转录后控制可以作为一种手段，将内含子miRNA的表达模式与其宿主转录物的表达模式分离开来。
Lin-28阻断miRNA加工的确切机制及其底物选择性的范围和决定因素尚不清楚。我们的数据表明，Lin-28倾向于在微处理器步骤选择性阻断let-7家族pri-miRNAs的处理。然而，我们不能排除Lin-28单独或与其他因素协同可能在不同的生理环境中阻断其他miRNA前体的可能性。其他人报告称，当前miRNA被切割成成熟形式时，miRNA的加工也可以在Dicer步骤中进行调节(5,8). 还可能发现转录后调节miRNA处理的其他因素。Lin-28主要定位于细胞质，但也可以在细胞核中发现(10,11); Lin-28B以细胞周期依赖性方式易位到细胞核(13). Lin-28可能以细胞周期特异的方式在转录后调节胚胎细胞中的miRNA处理。
最近，Lin-28与Nanog、Oct-4和Sox2联合使用，重新编程人类成纤维细胞，使其具有多能性(14). 因此，我们的数据表明，调节miRNA处理可能有助于体细胞重编程到胚胎状态。此外，通过敲低微处理器的Drosha组分对miRNA处理的全局抑制被证明可以促进细胞转化和肿瘤发生；发现这种表型在很大程度上是由于let-7表达缺失所致(17). 据报道，Let-7通过抑制Hmga2等癌基因在肺癌和乳腺癌中发挥抑癌作用(18)和Ras(19,20). 我们认为，通过激活Lin-28来破坏let-7处理可以促进致癌表型。值得注意的是，一些人类原发性肿瘤的pri-miRNAs表达与相应的成熟物种之间普遍缺乏相关性(7,21). 这表明miRNA加工中的一个阻滞可能导致在许多人类癌症中观察到的miRNA低表达(22). Lin-28的未来研究有望揭示miRNA处理如何促进体细胞重编程和肿瘤发生过程中的去分化。
