套细胞淋巴瘤的全基因组miRNA图谱显示一个预后不良的独特亚群

摘要

介绍

外套细胞淋巴瘤（MCL）约占所有非霍奇金淋巴瘤的6%，主要发生在老年男性。^1，2已经报道了MCL的几种组织学变体，包括经典型、小细胞型、囊胚型和多形性变体¹并且具有不同的增殖率和遗传特征。^三，4假定的原细胞被认为是地幔带或初级卵泡中的原始B细胞。然而，20%-30%的患者出现了变异的免疫球蛋白可变区重链（IGVH）基因。²免疫表型的特征是CD5和B细胞相关抗原CD20、CD22、CD79和CD5的表达，IgM和IgD的表达较强，但缺乏CD23、CD10和BCL6。^1，2从历史上看，大多数MCL患者表现出积极的临床病程，但随着目前的治疗，生存率有所提高，据报道中位生存时间为5-7年。⁵最近的研究发现MCL的一种惰性亚型与更长的生存时间有关。^6——7这些患者的肿瘤细胞呈现过度突变IGVH（IGVH）基因，不复杂核型，缺乏SOX11表达。

MCL的遗传标志是t（11；14）（q13；q32）突变，导致cyclin D1过度表达。尽管如此，小部分患者（<5%）缺乏这种遗传变异，但与cyclin D1阳性患者相比，其基因表达谱（GEP）和基因组谱几乎无法区分。^8，9据报道，MCL中有几种复发性遗传异常，包括9p21.3、11q22-q23和22q11.22的频繁丢失，以及10p11.23和13q31.3的增加。^三，4，9特定突变和缺失第16页(CDKN2A型),自动取款机，CHEK2（检查2）、和TP53型MCL中也经常出现。²在经常被染色体缺失所针对的区域，也有报道称存在部分单亲二体性。¹⁰

异常miRNA表达与淋巴瘤的发病机制有关，包括复发性13q31.3增益⁹窝藏MIHG1公司，其编码由6种多顺反子miRNA（miR-17、miR-18a、miR-19a、miR19b-1、miR-20a和miR-92a）组成的miR17-92簇。在包括MCL在内的B细胞淋巴瘤中，已发现miRNA表达的改变。^11——13在本研究中，我们使用基于高通量Taqman定量实时RT-PCR的miRNA分析平台对多种类型的B细胞淋巴瘤进行了大规模全局分析，以与MCL进行比较。该研究旨在确定MCL的诊断和预后特征，包括细胞周期蛋白D1阳性和细胞周期蛋白D1阴性患者。定量RT-PCR分析可以在很大的动态范围内对单个miRNA进行高度准确的定量，并区分密切相关的miRNA家族成员。我们还探索了该平台对冷冻保存和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的适用性。我们还将miRNA图谱与相应的GEP数据进行了比较，以研究与解除miRNA表达调控相关的分子机制或途径。

方法

结果

基于miRNA谱的MCL分子分类器

无监督分层聚类（HC）分析显示，与其他淋巴瘤实体相比，MCL和SLL患者形成了一个独特的聚类(图1A） ●●●●。在30名MCL和12名SLL/CLL患者中，只有一名患者分别聚集在DLBCL集群中。然而，在进一步分析后（见下文），这两名患者都被miRNA分类器分为MCL或SLL，这表明肿瘤仍然保持着与miRNA相关的实质性分化特征。

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图1

MCL的微小RNA表达谱和分类器。（A） 淋巴瘤样本、正常细胞和细胞系的无监督分层聚类。MCL、SLL、DLBCL和BL形成了很大程度上不同的集群。基质细胞相关的miRNA信号在DLBCL和BL患者中表达更高。与原始B细胞、静止B细胞、CB细胞和CC细胞相关的miRNA表达也存在显著差异，MCL和SLL患者中与原始和静止B细胞相关的micRNA表达更高。（B） 使用贝叶斯算法导出的miRNA分类器产生了19-miRNA分类器（6个上调和13个下调miRNA），能够将大多数MCL患者与DLBCL和BL患者分开。该miRNA分类器在SLL、正常细胞和细胞系中的表达。橙色方框突出显示原始B细胞和MCL细胞系。

对miRNA图谱的进一步检查显示，两个显著的miRNA特征在主要淋巴瘤实体中有差异表达：一个特征反映miRNA在基质细胞中高表达，而基质细胞在DLBCL和BL中表达更高。另一个特征与非分裂相关，静止细胞（原始的、静止的外周血细胞），在MCL或SLL/CLL患者中高表达。这些观察结果与形态学发现一致，即与DLBCL相比，MCL缺乏主要的基质成分，并且大多数MCL病例的增殖性不如其他侵袭性淋巴瘤。

我们使用贝叶斯算法推导了一个miRNA分类器，该分类器将MCL与DLBCL/BL区分开来，并对分类精度进行了省略交叉验证。¹⁵该算法产生了一个19-miRNA分类器，其中包括6个上调的miRNA（miR-135a、miR-708、miR-150、miR-363、miR-184和miR-342-5p）和13个下调的miRNA(图1B） ●●●●。当在正常B细胞亚群中评估此特征时，大多数上调的miRNAs也在原始B细胞、静息B细胞或CC细胞中高表达，但miR-135a和miR-708除外，它们通常分别在CB/CC和基质细胞中更高表达。然而，它们也由2个MCL细胞系JEKO和JVM2表达。大多数（13个中的8个）下调的miRNA（miR-424、miR-382、miR-376c、miR-127-3p、miR-539、miR-37、miR-376a和miR-411）由基质细胞高水平表达，这与MCL中基质含量低一致。其他下调的miRNAs在原始和静止B细胞中的表达也很低。

MCL和SLL miRNA表达谱的比较

正如MCL和SLL患者紧密聚集所预期的那样(图1A） MCL分类器中的miRNA（通过与DLBCL/BL的比较得出）与SLL患者有显著重叠，但MCL中高表达的4个miRNA（miR-363、miR-184、miR-708和miR-135a）除外(图1B） ●●●●。当仅对MCL和SLL患者进行非监督HC分析时，SLL的两个单独的聚类（A和B）(图2A） 观察到。与B组患者相比，SLL A组患者的miRNAs主要表达上调，其特点是miRNAs-高表达，具有抑瘤功能（miR-1、miR-133a、，¹⁶miR-133b，¹⁶miR-139-5p、miR-139-3p和miR-143，¹⁷miR-10b，¹⁸miR-145，¹⁶和基质相关（miR-23a、miR-27a、miR-27b、miR-152和miR-221）。2名副免疫母细胞性SLL患者（如上所述）各有一名，与SLL簇A和簇B聚集，与MCL簇无关。

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图2

MCL和SLL之间miRNA表达的差异。（A） MCL和SLL样本的无监督分层聚类显示2个单独的SLL患者群，每个人都有独特的miRNA谱。（B） 26-miRNA标记区分MCL和SLL，23个miRNA包括2个多顺反子miRNA簇，与SLL相比，MCL中miR106b-25（miR-106b和miR-25）和miR106a-363（miR-363和miR-20b）显著上调。

为了更明确地分离MCL和SLL，我们构建了一个由26个miRNAs组成的分类器，其中23个miRNA在MCL中上调，包括miR-184和2个多顺反子miRNA簇的成员miR106b-25（miR-106b和miR-25）和miR106a-363（miR-363和miR-20b），它们是miR17-92簇的副序列。在分类器中，SLL患者中只有miR-150、miR-511和miR-375显著上调(图2B） ●●●●。5名MCL患者的概率<90%（4名患者为40%-70%，1名患者为20%），其中1名患者被归类为SLL，这表明一小部分MCL患者可能具有与SLL患者非常相似的miRNA谱。后2名患者的增殖基因特征表现为低表达（PS；log2信号强度7.3，7.6；30名PS患者的范围为6.9-9.1），属于无痛MCL患者群的一部分（参见“通过miRNA谱分析鉴定MCL亚群以及与GEP特征的相关性”）。有趣的是，尽管两种SLL副免疫母细胞变异体的增殖率要高得多，但它们在miRNA表达谱上与SLL组显著相似（概率分别为80%和90%）(图2B）

通过miRNA谱分析鉴定MCL亚群及其与GEP特征的相关性

当MCL患者单独由非监督HC进行分析时，观察到3个不同的聚类(图3A） 95个miRNAs的表达存在显著差异(P（P）<.005）。我们应用了先前定义的MCL PS¹⁹并观察到显著差异(P（P）=.01（通过Kruskal-Wallis检验），在3个miRNA-defined簇中PS的中位数表达，指定为簇A（高PS）、簇B（中等PS）和簇C（低PS；图3A） ●●●●。簇A和簇C之间的差异更为显著。簇A中的患者表现出miR17-92簇成员及其同源序列miR-106a-363和miR-106b-25的上调，这表明增殖性miRNA谱和与CB、CC和细胞系密切相关的miRNA亚群，但与原始B细胞无关(图3B） ●●●●。C组患者的miRNA表达上调，具有生长抑制功能，包括miR-1、miR-133b、，¹⁶miR-10b，¹⁸和基质相关标记物（miR-23a、miR-23b、let-7c、let-7-b和miR-125b）。在差异表达的miRNA中，与基质相关的miRNAs在C簇中显著富集，说明基质在该亚群患者中的作用。与A和C簇相比，B簇患者显示出大多数miRNA的低表达，但与基质相关的miRNA（miR-636、miR-539和miR-485-3p）的高表达在该亚群中特别显著。

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图3

MCL患者的无监督分层聚类显示出3个不同的MCL聚类。（A） 三组之间的PS存在显著差异(P（P）Kruskal-Wallis检验=.01）。PS包含与Rosenwald等人相同的基因集。¹⁹（B） 差异miRNA表达（95 miRNA，P（P）<.005）被指定为集群A（与高PS相关）、集群B（中等PS）和集群C（低PS）。（C） 差异基因表达（649个转录物，P（P）<.005），其中A簇显示增殖相关基因的高表达，其他簇显示与基质成分相关基因的表达较高。

为了进一步了解这些簇的生物学意义，我们还检查了GEP数据。有趣的是，基于GEP的非监督HC显示，根据miRNA图谱定义，位于A组的患者几乎与GEP定义的3个亚组中的1个亚组完全相同（A组中的所有8名患者），支持A组患者具有独特的分子特征。当分析来自3个miRNA定义簇的GEP数据时，649个转录物显示出显著的差异表达(P（P）< .005). 功能分析显示，编码在细胞周期进展和增殖或抑制细胞凋亡中发挥作用的蛋白质的转录物在簇A中高度上调，这与高PS的相关性一致(图3C） ●●●●。增殖标记的转录水平Ki67号机组与该组有显著关联(P（P）< .0001). 此外，我们观察到编码巨噬细胞分泌的蛋白质的基因的高表达（例如，CHI3L1公司)，包括CD163型在该组M2巨噬细胞中表达。C组患者（低PS组）的细胞因子编码基因表达相对较高，主要与T细胞相关(CX3CL1型，CXCL12系列，CXCL2系列、和CXCL5系列)以及与WNT信号相关的基因(FZD公司，WNT5A型、和SFRP2型)与集群A（高PS组）相比。该组患者还表达了编码细胞外基质相关蛋白的转录物(电子控制模块2，EDN1型，表皮生长因子受体，EPS8系统，ITGA9公司、和PDGFD公司)。有趣的是，集群C中许多上调和下调的基因在集群B中表现出类似的表达模式，然而，在这些组中也发现了独特的基因特征。文献中关于这些基因功能特征的信息有限(图3C） ●●●●。基因富集分析补充了这些结果，显著富集了A簇中的增殖相关基因特征，而其他两个簇均显示IL-6、TGF-β、缺氧、VEFG、Hox10诱导和静止/干细胞样基因特征富集。与簇C相比，簇B具有更高的TGF-β信号，并显示出更高的p21和ATM信号的遗传毒性应激，而簇C则显示出WNT和IL-4信号通路基因的更高表达（补充表2）。我们对C组的3名代表性患者和A组的2名患者进行了β-catenin免疫组化。我们观察到C组的所有3名患者的基质/内皮细胞中β-catentin的强阳性表达。大多数肿瘤细胞为阴性，而高增殖特征的患者（A组）仅显示偶尔的细胞对β-连环蛋白呈弱阳性（补充图3），表明WNT的激活可能主要归因于C组患者的基质成分。

GEP签名的验证。

为了进一步验证这30名MCL患者的GEP结果，我们在另一组MCL患者（n=82）中验证了基因签名。在我们的初步分析中，我们从本研究中30名MCL患者的GEP数据（训练数据）中导出了一个特定的基因表达特征，可以使用贝叶斯算法区分a组和C组患者。这导致了一个具有2个基因特征的71-probe集，一个富含增殖相关基因（特征1），另一个富含基质相关基因，包括WNT途径基因（特征2），如补充图4A所示。这两个基因特征的平均表达水平呈负相关，这两个特征的平均表示比率与无事件生存率显著相关(P（P）< .01). 然后，我们使用层次聚类法分析了独立MCL序列（n=82）中的基因特征，并获得了4个MCL患者亚群，大多数人的特征1和2表达呈负相关。然而，一小部分患者在相似水平（高和低）表达了这两种特征。OS与信号1显著相关，预示预后较差。当2个特征的表达比率与OS相关时，较高的比率（特征1 vs 2）与较差的预后相关（补充图4B）。

原始B细胞和MCL miRNA图谱的比较及其功能意义

通过与其他B细胞亚群（包括CC和CB）的比较，我们确定了与原始B细胞显著相关的miRNA特征（补充图2）。与原始B细胞亚群显著相关的miRNAs为miR-150、miR-223、miR-342-3p、miR-146-5p、miR95、miR-34.2-5p和miR-146b-3p，在之前的研究中描述的7种miRNA中至少有4种。^20——22在静止的B细胞和T细胞中也观察到这些上调的miRNAs，与其他淋巴实体相比，MCL患者中的miRNAs表现出边缘富集（数据未显示），但淋巴细胞系中基本上没有这种miRNAs。

为了鉴定可能具有致病意义的miRNA，我们比较了正常幼稚B细胞和MCL细胞的miRNA谱。排除可能归因于基质成分的差异，我们观察到，与原始B细胞相比，MCL中大多数差异表达的miRNAs（>80%）上调(图4)。在MCL中上调但在原始B细胞或基质元件中未上调的miRNAs包括miR-184、miR-21、miR-10b和miR-135a，其致癌作用已在多种恶性肿瘤中得到证实，^23——26但许多其他上调的miRNA的功能特征尚不清楚。与正常的原始B细胞相比，MCL细胞中只有少数miRNAs表达下调；然而，这些包括了原始B细胞中一些最丰富的miRNAs（miR-150、miR-223、miR-225和miR342-5p/3p），这表明这些miRNA的低表达可能对MCL的发病机制很重要(图4).

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图4

MCL miRNA图谱与其他B细胞亚群、T细胞和基质元素的比较。80%以上的差异表达(P（P）与原始B细胞相比，MCL细胞中的miRNAs上调。

低温保存和FFPE miRNA图谱的评价

在相应的FFPE MCL（n=8）和DLBCL/BL（n=35）患者中评估从冷冻保存组织中获得的miRNA分类器。在19个miRNAs中，有2个在FFPE样本中表现出不一致的表达，但其余17个miRNA能够以相似的敏感性和特异性区分MCL和DLBCL及BLs。在cyclin D1阳性和cyclin D2阴性的MCL患者（n=7）中，这种17-miRNA特征的表达模式相似，很容易与DLBCL/BL患者区分开来(图5A） ●●●●。

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图5

细胞周期蛋白D1阳性和阴性MCL中的miRNA表达。（A） 从冷冻组织中获得的MCL分类器在FFPE组织和被分类为MCL的细胞周期蛋白D1阴性MCL中显示出相似的预测能力。（B） 基于miRNA图谱的无监督聚类显示，cyclinD1阴性和cyclin D1阳性MCL患者明显聚集。（C） 细胞周期蛋白D1阴性和细胞周期蛋白D阳性MCL患者之间miRNA的差异表达。

细胞周期蛋白D1–阴性与细胞周期蛋白D2–阳性MCL。

尽管miRNA谱有很大的相似性，但cyclin D1阳性和cyclin D2阴性的MCL患者在非监督HC中分别聚集，并显示30个差异表达的miRNA(P（P）<0.05和4倍的差异；图5B-C）。差异包括MYC负调控的miRNAs下调（miR-15a、miR-22、miR-29a、miR-29b、miR-29和miR-142-3p）²⁷和上调癌细胞miR-155²⁸在细胞周期蛋白D1阴性MCL患者中。相反，cyclin D1阳性患者的miR-27和miR-19a表达显著上调，提示这两个MCL亚群中存在一些不同的发病特征。此外，我们没有观察到位于11q13（miR-1237、miR-192、miR-194-2、miR-612、miR-548、miR-139和miR-326）上的miRNAs的显著表达变化，这些miRNAs-包括cyclin D1阳性和cyclin D2阴性MCL患者之间的CCND1位点。

miRNA谱与临床结果的关系

miRNA表达与临床结果的相关性通过与基于mRNA的增殖特征的相关性以及Bair等人²⁹非监督原则，以确定预测OS或无事件生存率的miRNAs，并将PS作为分析中的协变量。当根据基于mRNA的PS分析miRNA时，28个miRNA显著(P（P）<.05）在最高生育率（n=10）和最低三分位数（n=110）增殖亚群之间差异表达(图6A） ●●●●。高增殖组的特征是miR17-92簇的miR-18a和miR-106a-363簇的miR-18b、miR-20b和miR-363的高表达，表明miRNA具有增殖特征。^30，31低增殖组包括miR-125-3p、miR-126、miR-10b、miR-143和miR-145的高表达，其中许多在基质细胞中高表达，表明低增殖组与较高的微环境特征有关。

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图6

miRNA表达与临床结果的相关性。（A） 增殖特征最高三分位数（n=10）和最低三分位数的患者之间的miRNA差异表达(P（P）< .05). （B） miR-636和miR-424的Kaplan-Meier曲线显示显著性(P（P）<.05）与OS的相关性。（C） 风险组的Kaplan-Meier曲线使用6-miRNA签名，通过Bair等人的方法获得生存风险预测。²⁹

我们还进行了生存风险预测，并使用PS作为协变量之一建立了多变量比例风险模型。我们鉴定了一个6-miRNA信号（miR129-3p、miR-135a、miR-146a、miR-424和miR-450-5p的高表达和miR-222的低表达），将MCL分为好（中位OS，约4年）和差（中位OS，约2年）预后组，独立于与PS相关的miRNA(图6C和补充表3B）。

讨论

在本研究中，我们分析了187例B细胞淋巴瘤患者和正常B细胞亚群，目的是为MCL构建可靠的miRNA分类器，确定基于miRNA的预后预测因子，并确定miRNA在MCL发病机制中的可能作用。由于MCL起源的假定细胞是原始生发前中心（pre-GC）B细胞，我们确定哪些miRNAs与原始B细胞相关，并研究它们在其他静止B细胞中的表达模式。这些miRNAs包括miR-150、miR-223、miR-29a、miR-28c、miR-101、miR-320、miR-331、let-7b、miR-26a和miR-342。其中一些（miR-150、miR-29c、miR-101、miR-223和miR-320）之前已被描述为在原始B细胞中富集，使用包括深度测序在内的多种平台。^21，22其中一些miRNAs可能在维持外周淋巴器官B细胞的静止状态或非承诺状态中发挥作用。例如，miR-223在原始B细胞中的表达已被证明通过抑制LMO2和MYBL1阻止原始B细胞分化为GC B细胞。^21，22同样，miR-150通过靶向关键转录因子MYB来控制小鼠体内B1细胞的扩增和体液免疫反应。³²然而，MCL细胞的miRNA图谱显示出与原始B细胞的显著差异。由于MCL细胞含有基质元素，我们将基质细胞和从扁桃体分离的T细胞的miRNA图谱包括在内，以便于解释数据。尽管培养基质细胞后miRNA谱可能发生一些变化，但许多miRNAs与来源组织相关，因此我们预计这组miRNA将保持不变。虽然我们生成的基质细胞仅代表肿瘤微环境的一部分，但基质miRNA的表达与肿瘤中基质的丰富程度明显相关(图1)。排除基质miRNA后，与原始B细胞相比，仍有许多miRNA过度表达，这表明它们可能在MCL中起作用。其中，miR-135a已被证明通过下调大肠腺瘤性息肉病和激活WNT途径在结直肠癌中发挥致癌作用，²⁵但在经典霍奇金淋巴瘤中，它与更好的预后相关，靶向JAK2，导致Bcl-xl的下调。³³miR-21在前B细胞淋巴瘤小鼠模型中被证明是一种癌细胞，²⁴其直接靶点包括几个肿瘤抑制基因(PTEN公司，PDCD4（PDCD4）、和ANP32A型).³⁴同样，其他上调的miRNA（miR-10a和miR-10b）是通过抑制HOXD10诱导细胞运动和侵袭性的癌细胞。²³有趣的是，在本研究中，miR-10a在C簇中表达下调（miRNA聚集图3A-B）和HOX10诱导的基因在同一组中相应富集。因此，通过单变量分析，miR-10a的低表达与MCL患者更好的生存率显著相关(P（P）= .03). 相反，原始B细胞中一些高度上调的miRNAs，如miR-150、miR-223和miR-342-5p，在活化的外周血B细胞中也像在MCL细胞中一样下调，这表明它们调节B细胞的活化，并且它们的下调可能对终止静止很重要。

我们的分析确定了一个稳健的MCL miRNA分类器，其中包括6个上调和13个下调的miRNA。该分类器能够在30名患者中的29名患者中准确地将MCL与其他侵袭性淋巴瘤分离，概率>90%。有趣的是，2名DLBCL患者被错误分类，但在进一步的形态学检查后，这2名患者被诊断为具有CLL的免疫母细胞旁变异，并且在其miRNA表达谱中与MCL和SLL相似。有趣的是，这两名高增殖患者仍然与MCL和SLL患者保持着足够的相似性，因此被纳入这一类别，而不是纳入DLBCL/BL类别。对相应FFPE组织进行的miRNA谱分析显示出类似的结果，表明分类器在FFPE组织中的准确度相似。

在分类器中的miRNAs中，我们观察到原始B细胞分化为CB细胞后miR-150下调了45倍。这一观察表明miR-150是原始B细胞的一个阶段特异性标记物，可能通过下调MYB来阻止原始B细胞向CB细胞的转化。³²miR-184与MCL的关联可能部分归因于其在15q25.1中的存在，这在MCL中经常获得或扩增（>20%）⁹在功能上与细胞增殖和肿瘤发生有关。²⁶分类器中具有已知作用的其他上调miRNAs包括miR-135a³³和miR-363，³¹与肿瘤发生有关。然而，该分类器包含高度选择性的miRNAs，与正常对应物和其他B细胞淋巴瘤相比，在差异表达的miRNAs背景下进行肿瘤生物学中的miRNA研究更合适。由于miRNA的功能可能依赖于上下文，因此可能需要在感兴趣的细胞类型中验证其报告的功能。

在本研究中，我们已经证明，细胞周期蛋白D1阳性MCL的miRNA分类器在FFPE组织中的细胞周期蛋白D2阴性患者中的表达非常相似，这些患者均被归类为MCL。然而，这两组患者有足够的差异，当作为一个组进行分析时，他们倾向于形成自己的集群。在差异表达的miRNA中，miR-155上调，而MYC下调的6个miRNAs，包括抑癌基因miR-15a，在细胞周期蛋白D1阴性的MCL患者中下调。与细胞周期蛋白D1阴性患者相比，细胞周期蛋白D2阳性患者的miR-27、miR-101、miR-142-5p、miR-19a、miR-9b和2个基质相关miRNAs、miR-126和miR-143显著上调，表明其发病机制存在细微差异。然而，不同的miRNAs可能通过不同的机制影响相同的致癌途径，如miR-155（细胞周期蛋白D1阴性患者上调）和miR-19（细胞周期素D1阳性患者上调）所示，它们都可能通过抑制SHIP1和PTEN来激活PI3K途径。

SLL患者表现出与MCL患者相似的miRNA表达模式，部分原因可能是他们的低增殖、肿瘤细胞的非GC B细胞来源以及基质含量低，尽管大多数患者确实形成了一个单独的集群(图1A） ●●●●。大多数SLL患者也可以通过miRNA分类器与MCL患者进行区分，miR-150在SLL中显示出显著的上调，而26个其他miRNA中有23个在MCL中表现出较高的表达，包括与增殖特征相关的miRNA（miR-106b-25和miR-20b）、通过Bim下调的前生存信号（miR-181a）、，³⁵和15q扩增（miR-184）。⁹每名患者中只有一名被错误归类为另一类；分类错误的SLL患者是一种侵袭性副免疫母细胞变体，而分类错误的MCL患者属于C组，其中包括更多的无精打采患者。

通过无监督HC，miRNA表达谱将MCL患者分为3组，这3组似乎存在生物学和临床差异。簇A显示增殖相关miRNAs的高表达，包括miR17-92簇³⁰其同源序列miR-106a-363和miR-106b-25也与增殖相关基因的高表达一致。与A组相反，C组基质相关miRNAs的表达较高，包括miR-23a、miR-23b、let-7c、let-7-b和miR-125b，以及具有生长抑制功能的miRNA，包括miR1、miR-133b、，¹⁶和miR-10b。¹⁸GEP分析还显示增殖相关基因的低表达，有趣的是，编码细胞外基质相关蛋白的转录物的高表达(电子控制模块2，EDN1型，表皮生长因子受体，EPS8系统，ITGA9公司、和PDGFD公司)。在另一个MCL队列（n=82）中对这些基因特征的进一步检查通常验证了这些发现。大多数患者表现出增殖相关基因丰富的特征与基质相关基因之间的负相关，这两个特征的高比率与较差的生存率相关。这一观察结果表明，基质可能会影响肿瘤细胞的增殖。肿瘤微环境对滤泡性淋巴瘤患者预后的影响已被证实。³⁶同样，在DLBCL中，与细胞外基质沉积以及间充质细胞和组织细胞相关的“基质-1信号”与良好的结果相关。³⁷我们最近也报道了基质特征在血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤患者预后中的作用。³⁸本研究的结果表明，一组基质相关的miRNAs可能定义为一组更懒惰的患者，需要进一步研究。

在检查相关的GEP数据时，这些MCL亚组也显示出不同信号通路的表达差异。聚类C显示与“茎/静止”相关的通路丰富，如WNT和TGF-β信号，而聚类B似乎与较高的遗传毒性应激相关（丰富的ATM和p21通路基因）。由于WNT信号在CLL中的作用³⁹52%的MCL患者肿瘤细胞中β-连环蛋白的核染色，⁴⁰我们进一步用免疫组织化学方法研究了β-catenin的表达。在我们的患者中，β-连环蛋白似乎主要定位于基质成分。我们和我们的合作者（E.C.，个人通讯）都无法证明β-连环蛋白在肿瘤MCL细胞中的核表达，这表明WNT的激活可能主要归因于C群患者的基质成分。WNT信号对B细胞的影响是复杂的，一些研究表明WNT信号在前B细胞和前B细胞的增殖中很重要。⁴¹WNT信号也被报道在GC B细胞和CLL细胞中存活，但其他一些研究报告称，基质细胞中典型WNT信号的激活抑制B细胞淋巴生成⁴²而WNT5a可以通过非经典的WNT/Ca发出信号²⁺负调控B细胞增殖的途径。⁴³最近的一项研究表明，基质细胞中典型WNT信号的激活会阻止B细胞、NK细胞以及浆细胞样树突状细胞的增殖和生成，⁴⁴诱导细胞外基质基因的表达。由于WNT信号在MCL最不增殖的亚群中观察到，并且β-catenin似乎在基质细胞中发现，因此微环境miRNA在向肿瘤MCL细胞生成抑制信号方面的可能作用令人感兴趣，值得进一步的实验研究。

在高PS组上调的miRNAs中，来自miR17-92簇及其2个副序列的miRNA已被证实具有促进细胞增殖和抑制凋亡的作用。³⁰在我们之前的研究中，我们还发现，miR17-92除了靶向PTEN和BIM外，还靶向PI3K/AKT通路的一个重要负调控因子PHLPP2，并且miR17-91的过度表达导致PI3K/AKT通路的组成性激活以及MCL细胞系的化疗耐药性。³⁰在以前的研究中，MCL中miR17-5p和miR-20b的高表达与短OS相关。^12，13相反，miR-29的低表达，其靶基因包括川东北6与预后不良相关。¹¹我们观察到miR17-92簇及其同源序列、miRNA-363和其他一些miRNAs与PS相关(图6A） ●●●●。我们为MCL生成了一个独立于PS的6-miRNA预测因子。在这6个miRNA中，miR-222和miR-146a在两个预后组之间的表达差异较大（>3倍）。miR-146a型²⁷被抑制，miR-222⁴⁵由MYC诱导，这些miRNAs与MYC mRNA表达具有预期的相关性，表明MYC可能在MCL预后中发挥作用，这与以前的研究结果一致。⁴⁶MYC的作用可能通过控制miRNA表达而部分介导。miR-222与miR-221共表达为簇，靶向肿瘤抑制因子p27^基普147miR-146a的缺失促进小鼠肿瘤的发生。⁴⁸除了与PS相关的miRNA外，我们的研究表明还有其他miRNA可以作为生存预测因子。然而，由于本研究中的患者数量有限，在未来更多MCL患者的研究中，尤其是在临床试验环境中，需要验证和完善此miRNA预测因子。

补充材料

致谢

脚注

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