烟酰胺诱导的线粒体吞噬

Western Blot分析

用RIPA缓冲液（50 m）溶解细胞米三氯化氢（pH 7.5），150 m米氯化钠、1%诺奈德P-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠）补充NaF、NaVO₄和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）。通常，用SDS-PAGE分离30-40μg蛋白质，转移到硝化纤维素膜上，并用抗人LC3、乙酰化p53（细胞信号技术，马萨诸塞州贝弗利）、p53、SIRT1或ERK1/2（圣克鲁斯生物技术，加利福尼亚州圣克鲁斯）和乙酰基-雌酮H3（密理博）或组蛋白H3（英国剑桥Abcam）的抗体进行印迹。利用辣根过氧化物酶偶联二级抗体和SuperSignal West Femto底物（Pierce）观察蛋白质条带。对于组蛋白提取，将RIPA裂解物造粒，在Tris/EDTA（pH 7.4）缓冲液中洗涤，并在200μl 0.4中培养n个H（H）₂SO公司₄在冰上保持90分钟。离心后，将上清液与1 ml冷丙酮混合，并在−20°C下保存过夜。组蛋白通过离心、空气干燥收集，并在H中重新悬浮₂O.通常，1μg蛋白质用于蛋白质印迹分析。

线粒体含量和基质金属蛋白酶的测定

细胞用50 n染色米壬基吖啶橙或100n米MitoTracker Red（均来自Invitrogen）在37°C的黑暗中放置30分钟，然后分别以488 nm激发/585 nm发射和488 nm激励/530 nm发射进行流式细胞术。为了测量基质金属蛋白酶，用0.3μg/ml JC-1（Invitrogen），并在488 nm处进行流式细胞术激发。记录530nm（FL-1）和585nm（FL-2）处的发射，并通过使用软件WEASEL计算单个细胞的FL2/FL1比率。使用软件SigmaPlot 9.01（Systat software，Inc.，芝加哥）绘制样本FL2/FL1比率的平均值。羰基氰化物米-氧化磷酸化抑制剂氯苯腙（Sigma）在100μ米浓度分析活细胞线粒体的MMP依赖性染色。

线粒体共焦显微镜

将培养在显微镜盖玻片上的细胞用3.7%甲醛固定在PBS中20分钟，用OXPHOS复合检测试剂盒（MitoSciences）和Alexa 488-共轭抗鼠2°Ab染色，并在共焦显微镜下观察（LSM 510，Carl Zeiss，Thornwood，NY）。为了计算每个细胞的LC3穿孔数，将LC3穿孔的共焦显微图像应用于穿孔计数程序ImageJ（美国国立卫生研究院的免费软件）。

siRNA转染

根据制造商的协议，用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）将接种在培养箱载玻片上的细胞转染为对照RNA（siNeg）、抗人NAMPT的siRNA（siNAMPT；CAAGAGAUCUGAUUUUG）或SIRT1（siSIRT1；CUUGUACGAGACGACGAC）（Bioneer，大田，韩国）。转染后2-3天对细胞进行分析。siNeg RNA（CCUACGCCACAAAUUCGU（dTdT））与任何人类基因的同源性都很低。

体内SIRT1活性测定

将细胞与Fluor-de-Lys-SIRT1脱乙酰酶底物（BML-K177，Enzo Life Sciences，Farmingdale，NY）和1米曲古抑菌素A持续1小时，并根据供应商的协议检测荧光。

总量的测量[NAD⁺]

电池（1×10⁶)在PBS中清洗，并通过添加200μl冷HClO进行溶解₄溶液（0.5米)并在冰中孵育15分钟。通过添加61μl的2米氢氧化钾，0.2米K（K）_三人事军官₄（pH值7.5）并在13000×克3分钟上清液或NAD⁺将标准稀释剂（30μl）与150μl反应溶液混合。将混合物在37°C下培养30分钟，在450 n下培养吸光度米已测量。反应溶液由8μ米WST-1（Takara Bio Inc，Shiga，日本），70μ米1-甲氧基-5-甲基苯那嗪甲基硫酸盐，20 IU乙醇脱氢酶（Sigma），64 m米烟酰胺和0.32米64 m乙醇（Sigma）米Gly-Gly缓冲液（pH 7.4）。

游离[NAD的测量⁺]/[NADH]比率

对于乳酸氧化酶分析，将10μl培养基或乳酸标准溶液与196μl分析缓冲液（0.1）混合米柠檬酸盐，1 mg/ml BSA，0.1%CaCl₂，0.02%NaN_三，用1调节至pH 6.5米纳₂高性能操作₄)将1μl的2毫升/μl乳酸氧化酶储备（乳酸氧化酶（Sigma））溶解在酶稀释缓冲液（10 m）中米千赫₂人事军官₄, 10 μ米FAD，用KOH调节至pH 7.0）、1μl 0.5单位/μl过氧化物酶原液（溶解在蒸馏水中的过氧化物酶（Sigma））和2μl 5 m米Amplex UltraRed库存（Invitrogen）。分析混合物在37°C下培养30分钟，在激发/发射=535/590 nm时读取荧光。对于丙酮酸氧化酶分析，将10μl培养基或丙酮酸标准溶液与196μl分析缓冲液（50 m）混合米千赫₂人事军官₄，1 mg/ml BSA，0.2米米三苯基膦，10μ米FAD，0.97米米EDTA，9.8米米氯化镁₂，0.02%NaN_三，用1调节至pH 6.5米NaOH），1μl 2毫单位/μl乳酸氧化酶储备（丙酮酸氧化酶溶解在缓冲液（10 m）中米千赫₂人事军官₄, 10 μ米FAD，用KOH调节至pH 7.0），1μl 0.5单位/μl过氧化物酶原液，2μl 5 m米Amplex UltraRed库存。然后将分析混合物在37°C下培养30分钟，并在激发/发射=535/590 nm时读取荧光。用于计算游离[NAD的比率⁺]/[NADH]，方程式1已使用(25).

乳酸治疗改变了[NAD⁺]/[NADH]比率和线粒体含量

我们进一步质疑NAM对线粒体含量的下调是否是由[NAD的细胞比率增加引起的⁺]/[NADH]而不是[NAD的增加⁺]就其本身而言事实上，自由[NAD的比率⁺]/[NADH]在第1天增加了近2倍，此后保持升高(图2一). （有趣的是，它在第3天之后进一步增加。）总[NAD的比率⁺]/[NADH]也有所增加，尽管程度稍轻(图2B类，比较南（−）和NAM公司(+)). 【北美地区】⁺]/[NADH]比率通过乳酸发酵由[丙酮酸]/[乳酸]比率相互调节，当升高时，它会下调丙酮酸向乳酸的转化。事实上，在NAM处理的细胞中，由培养基中的浓度决定的细胞乳酸生成量下降，与[NAD的变化呈负相关⁺]/[NADH]比率(图2一). 同时，增加10m米培养基中的乳酸导致对照组和NAM处理细胞中的比率降低到远低于模拟处理细胞的水平(图2B类). 令人惊讶的是，乳酸处理以剂量依赖的方式导致对照细胞和NAM处理细胞的线粒体含量增加(图2C类). 这表明乳酸本身或乳酸诱导的[NAD减少⁺]/[NADH]比率增加线粒体含量。

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图2。

NAM介导的[NAD变化⁺]/[NADH]比率和乳酸生成，以及乳酸和天冬酰胺对线粒体含量的影响。 A、，细胞在5m的存在下培养米NAM，在指定的时间点，收集培养液并应用于乳酸/丙酮酸氧化酶分析，以测量游离[NAD的比率⁺]/[NADH]或量化每小时每细胞的乳酸产量。B类和C、，在有或无NAM的条件下培养3天的细胞，用10 m米 我-乳酸（5或10米米在里面C类)并在采集前进一步孵育3天，以分析[NAD⁺]/[NADH]比率(B类)或用MitoTracker Green染色以量化线粒体含量(C类). 使用三次试验的平均值绘制曲线图(第页与模拟处理的细胞（−）进行的所有比较均<0.05。D类和E、，NAD的影响⁺和天冬酰胺对线粒体含量的影响。在5 m条件下培养成纤维细胞米北美⁺（■）或10米米收集1、3或7天的Asn（●），用MitoTracker Green和JC-1染色，并应用流式细胞术定量线粒体含量(D类)和MMP(E类)分别是。使用三次试验的平均值绘制曲线图（*，第页< 0.05; **,第页ANOVA检验（Dunnett检验）显示<0.01（与第0天对照组相比）。

高[NAD⁺]/[NADH]比率降低线粒体含量并增加MMP

[NAD的重要性⁺]/[NADH]比率作为细胞线粒体状态的决定因素在细胞中得到证实，其中该比率通过调节苹果酸-天冬氨酸穿梭物而改变。在这种穿梭物中，苹果酸脱氢酶将NADH氧化为NAD⁺通过将一个氢原子和一个电子转移到草酰乙酸，生成苹果酸，苹果酸通过苹果酸/α-酮戊二酸反转运蛋白穿过线粒体膜，通过还原线粒体NAD再次成为草酰乙酸⁺至NADH。线粒体草酰乙酸以天冬氨酸的形式返回细胞溶质(28). NADH向NAD的细胞溶质转化⁺可以通过增加天门冬氨酸的浓度来促进，这可以通过向培养基中添加天门冬酰胺来实现，天门冬胺酸很容易被细胞溶质天门冬蛋白酶转化为天门冬酸(29). 我们用20 m米天冬酰胺或NAD⁺（治疗包括作为阳性对照），并监测对线粒体含量和MMP的影响。Asn处理导致线粒体含量下降，其动力学与NAD诱导的动力学相似⁺或NAM。在3天内，Asn和NAD患者的线粒体含量都减少了近40%⁺(图2D类). Asn治疗引起的MMP变化与NAM治疗相似，3天内增加近50%(图2E类) (23). 这些结果强烈表明细胞溶质[NAD⁺]/[NADH]比率在线粒体含量和MMP的调节中确实起着决定性作用。

两个NAD⁺天门冬氨酸诱导自噬体形成和线粒体转化

我们以前的研究表明，NAM诱导的线粒体状态变化依赖于自噬的激活以及线粒体从长丝到短点的转变(23). Asn治疗是否也激活自噬并诱导线粒体转化已确定。首先，NAD的影响⁺或Asn对自噬激活的治疗是通过内源性LC-3蛋白的免疫荧光检测LC-3点的形成来确定的(图3一). 显著的LC-3点状突起的数量显著高于NAD处理的细胞，点状突触似乎更显著⁺或Asn。单个点刺与用白藜芦醇处理的细胞中的点刺一样大，已知白藜芦醇通过激活SIRT1诱导自噬(30)或AMP活化蛋白激酶(31). 总的来说，这些结果表明，Asn的处理确实增加了自噬流量。

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图3。

NAD处理细胞中LC3点和线粒体断裂增加⁺或Asn。 A、，在盖玻片上培养的细胞要么经过模拟处理（−），要么在5m的条件下培养米NAM，5米米北美⁺，10米米Asn或10μ米白藜芦醇2天，并用LC3B蛋白抗体进行免疫染色(白色)用Hoechst 33258对核DNA进行反染色(灰色). 给出了细胞的典型共焦显微图像。使用ImageJ程序（rsbweb.nih.gov）对细胞中显著的LC3泪点（直径大于0.5μm）的数量进行计数，平均数量以表。B、，在没有（−）或有NAM、NAD的情况下培养的细胞⁺用MitoTracker红染色，固定，并在共焦显微镜下观察。放大倍数：顶行，×252;最下面一行, ×1000.

接下来，通过共焦显微镜检查线粒体结构的变化。在模拟处理的成纤维细胞中，大多数线粒体表现为长线状结构，如图3B类(−). 然而，在大多数NAM处理的细胞中，它们似乎呈碎片状，呈短细丝或圆点状，其中许多长度小于2μm(图3B、 NAM公司) (23). 重要的是，在北美地区⁺-或经Asn处理的细胞，线粒体长度也减少(图3B、 北美⁺和Asn公司). 总的来说，所有三种化学品，NAM和NAD⁺和Asn，增加自噬通量并诱导线粒体断裂，这强烈表明[NAD增加⁺]/[NADH]比率通过诱导伴随线粒体断裂的自噬加快线粒体周转。

5 m处的NAM米但不在较高浓度下导致SIRT1激活和线粒体含量降低

SIRT1通过使参与自噬体形成的蛋白质脱乙酰化在自噬中发挥重要作用(21). SIRT1需要NAD⁺作为底物，其活性因NAD的增加而增强⁺级别或[NAD⁺]/[NADH]比率(32–34). 然而，SIRT1活性也被NAM自身抑制(35)，这使得很难直接指出SIRT1是NAM效应的关键介质。在我们之前的研究中，击倒SIRT1显著增加了对照细胞和NAM处理细胞中线粒体含量的水平，这表明SIRT1在基础水平自噬中的重要性(23). 为了确定NAM的作用是否由SIRT1的激活介导，我们首先检查用5 m米名称。用5 m米NAM，组蛋白H3的乙酰化水平，已知SIRT1底物(36)，从第1天开始明显下降，此后保持在低水平，表明SIRT1活性升高(图4一). 有趣的是，在NAM处理的细胞中，SIRT1蛋白水平本身显著较高(图4一). 虽然潜在的机制尚不清楚，但蛋白质水平的增加肯定会帮助细胞保持高SIRT1活性。此外，从蛋白质印迹的结果来看，p53乙酰化水平似乎至少在治疗后12小时较低(图4B类)和体内p53基人工底物脱乙酰的测定(37)同样增加表明，在5 m米南(图4C类). 同时，10米或20米处的NAM米剂量导致[NAD增加⁺]达到与用5m处理的细胞几乎相同的水平米NAM公司(图1B类)但导致早期SIRT1活性受到抑制（数据未显示）。重要的是，用20 m米NAM公司(图4D类). 这表明，当细胞被喂食较高剂量的NAM时，SIRT1活性，包括诱导自噬的活性，确实受到抑制（尤其是在早期大量NAM尚未转化为NMN并保持为NAM时）。在这方面，值得注意的是，与NAM相比，NAD的治疗⁺在类似浓度的大范围内（1μ米至5米米)导致线粒体含量下降，并且没有一个高剂量导致超过对照细胞中保持的水平(补充图2). NAM和NAD之间的差异⁺很可能表明NAM在高剂量下的抑制作用。

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图4。

NAM处理细胞中SIRT1活性和线粒体含量。 一和B、，用5 m培养的细胞米将指定时间段的NAM应用于乙酰化或总H3或SIRT1蛋白的蛋白质印迹(一)乙酰化或总p53或Erk蛋白。通过密度测定法对蛋白带进行量化，并对与对照细胞（0 h）中的蛋白带相关的值进行平均（来自三个不同的印迹）并绘制图表。C、 体内使用Fluor-de-Lys分析试剂盒测量SIRT1活性。每个酒吧表示六个独立实验的平均值±S.E.。*，第页与0小时对照组（−）相比<0.02。D、，在5或20 m的条件下培养的细胞米在指定的时间点收集NAM，用壬基吖啶橙染色，并应用流式细胞术测定线粒体含量。取三个生物重复序列中与0h对照组的相对数量的平均值并绘制曲线。一和D类, *,^#,第页< 0.05;^##,第页通过ANOVA检验（Dunnett检验），与第0天对照组相比<0.01。

SIRT1激活导致线粒体含量降低

上述结果表明，SIRT1介导的自噬激活可能是NAM处理细胞线粒体含量降低的潜在机制之一。通过检测激活SIRT1的两种化学物质的作用，验证了这种可能性，这两种化学物如下：费瑟汀（3,7,3′，4′-四羟基黄酮），其结构和功能与白藜芦醇相似，因此存在着离靶效应问题(38,39)和SRT1720，已知其高度特定于SIRT1(40). 任何一种化学物质的处理都会导致线粒体含量下降到与NAM处理相似的水平(图5,A–C). 在非西汀的情况下，效果往往很快，即使在最低剂量（10μ米). 第2天，含量略有恢复，但仍保持在模拟处理细胞的近80%。白藜芦醇也引起线粒体含量的类似变化（数据未显示）。同时，SRT1720处理导致含量逐渐下降，在第2天达到模拟处理细胞的近60%，类似于NAM处理。此外，80和800 n的剂量米引起了几乎相同的变化，可能反映了该化学物质的高度特异性。总之，不同的SIRT1激活剂导致线粒体含量减少的程度大致相似，这一发现表明SIRT1活化确实会导致细胞线粒体含量的下调。此外，只要细胞持续摄入新鲜的活化剂，线粒体含量就保持在较低水平，就像NAM的情况一样(图5C类).

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图5。

用非瑟素或SRT1720处理的细胞中的线粒体含量。 一和B、，细胞在补充有10、50、100或250μ米费西汀(一)或80、160，共800 n米SRT1720型(B类)固定并用MitoTracker Green染色，用于线粒体的流式细胞术定量。C类，用10μ米费塞汀或160 n米测量1、3或7天的SRT1720。将两个生物重复序列的荧光值与0天对照细胞的荧光值进行平均并绘制。（所有点都是第页ANOVA检验，与0天对照细胞（−）相比<0.01。）

SIRT1激活诱导线粒体碎片化

接下来，我们检查了SIRT1激活是否也会导致线粒体断裂。10μ的处理米费塞汀或160 n米SRT1720确实在第1天导致大量细胞中出现线粒体断裂(图6一,面板b和c（c））。有趣的是，线粒体被切断，但似乎仍与SRT1720处理过的一些细胞中先前丝状体的位置对齐(图6一,面板c). 重要的是，当SIRT1 mRNA被敲除时，线粒体碎片被阻断(图6B类). 如所示图6一, (面板e和（f）)在转染siRNA至SIRT1的细胞中，线粒体在fisetin或SRT1720的存在下保持为长丝。这些发现表明线粒体向点结构的转化是一个依赖于SIRT1激活的事件。

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图6。

用非塞汀或SRT1720处理的细胞中的线粒体结构。 A、，DMEM中培养的细胞(面板a和d日)，含10μ米费西汀(面板b和e（电子）)，或160 n米SRT1720型(面板c和（f）)用MitoTracker Green染色1天，固定，并通过共焦显微镜进行显微摄影。中的单元格面板a–c用siNegative RNA转染面板d–f在化学处理前2天用siRNA转染SIRT1。放大倍数：×1000。B类、将siRNA转染至SIRT1并模拟处理的细胞中SIRT1蛋白的状态(车道c)或用非西汀治疗(车道f)或SRT1720(车道s).