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单元格元数据。作者手稿；PMC 2013年5月2日提供。
以最终编辑形式发布为：
单元格元数据。2012年5月2日；15(5): 665–674.
数字对象标识：2016年10月10日/j.cmet.2012.04.04
预防性维修识别码：PMC3361911
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院370765
PMID：22560219

肝脏合成增加和胆固醇代谢紊乱与非酒精性脂肪性肝病的严重程度相关

海基民，博士。，1 阿什瓦尼·卡普尔医学博士。，1 富克斯医学博士。，1 法里多丁·米尔沙希，理学硕士，1 周惠平，博士。，1 摄影师詹姆斯·马希尔医学博士。，2 约翰·凯勒姆医学博士。，2 罗素·沃尼克，博士，4 梅丽莎·孔托斯医学博士。，三和阿伦·桑亚尔医学学士、医学博士。1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

非酒精性脂肪肝（NAFLD）与心血管和肝脏相关死亡率增加有关。NAFLD的特征是甘油三酯和游离胆固醇（FC）积累，但胆固醇酯没有相应增加。本研究的目的是评估NAFLD中胆固醇代谢基因的表达，并将其与疾病表型联系起来。NAFLD与SREBP-2成熟度增加、HMG-CoA还原酶（HMGCR）表达增加和HMGCR磷酸化降低相关。通过循环桥甾醇与胆固醇的比值测量，胆固醇合成增加。miR-34a是NAFLD中增加的一种微RNA，通过AMP激酶和HMGCR的下游去磷酸化抑制sirtuin-1。胆固醇酯水解酶增加，而ACAT-2保持不变。在服用或不服用他汀类药物的NAFLD受试者中，LDL受体的表达显著降低且相似。HMGCR的表达与FC、NAFLD组织学严重程度和LDL胆固醇相关。这些数据表明，NAFLD患者胆固醇代谢失调，可能导致疾病严重程度和心血管风险。

关键词：非酒精性脂肪肝、非酒精性肝炎、脂肪肝、动脉粥样硬化、胆固醇、HMG-CoA还原酶、脂肪生成、高胆固醇血症

简介

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是慢性肝病的常见病因(Browning等人，2004年;Wanless和Lentz，1990年). NAFLD的临床组织学表型从非酒精性脂肪肝（NAFL）扩展到非酒精性肝炎（NASH）(Ludwig等人，1980年). NASH可在多达15%的受试者中发展为肝硬化(Adams等人，2005年;Ekstedt等人，2006年). 一些研究还将NAFLD与心血管疾病风险增加联系起来，心血管疾病是该人群的主要死亡原因(Brea等人，2005年;Hanley等人，2005年;Targher等人，2007年;Villanova等人，2005年). 这些发现背后的潜在机制尚待充分确定。

NAFLD通常与肝甘油三酯升高有关(Browning和Horton，2004年). 然而，NAFLD的脂质组学分析表明，在NAFL和NASH中，也存在游离胆固醇（FC）的积累，但胆固醇酯（CE）没有类似的增加(Puri等人，2007年). 我们评估了肝脏胆固醇代谢相关基因的表达，以更好地了解FC积聚的分子基础。已知FC的细胞毒性以及NAFLD与心脏病的联系(Devries-Seimon等人，2005年;Geng等人，2003年;金斯伯格，2006)我们进一步评估了胆固醇代谢分子途径的变化与肝病严重程度和已知心血管疾病危险因素的关系。

此前的一项研究发现，NASH中HMG-CoA还原酶（HMGCR）表达增加，但没有明确这是由于潜在的肥胖还是肝脏疾病所致(Caballero等人，2009年). 它也没有提供关于NAFLD各种表型中所有胆固醇代谢途径状态的详细信息。我们评估了活检证实患有NAFL或NASH的受试者中参与胆固醇代谢的基因的mRNA和蛋白质表达，并将其与苗条的正常人以及没有肝病的年龄、性别和体重匹配的对照进行了比较。我们证明了胆固醇代谢相关基因的表达状态发生了许多变化，并阐明了与潜在肥胖相关的基因与与NAFLD相关的基因的表达情况。我们通过测量胆固醇合成的替代标记物进一步评估了观察到的变化的功能意义。

一项关键发现是，HMGCR在NAFL和NASH中的表达均增加，且与FC水平和肝病严重程度相关。此外，HMGCR在NAFLD的两种表型中都相对去磷酸化，因此在其活性形式中(Beg等人，1985年,1987). MiR-34a是一种在NASH中过度表达的微RNA(Cheung等人，2008年). 它抑制已知的去磷酸化AMP激酶（HMGCR磷酸化的已知调节器）的sirtuin-1(Beg等人，1984年;Chaudhary和Pfluger，2009年;克拉克和哈迪，1990年). 为了评估miR-34a作为HMGCR磷酸化调节器的潜在作用，在Huh-7细胞中评估了miR-34b过度表达和沉默的影响。我们证明miR-34a增强HMGCR去磷酸化，这代表了在NASH中具有潜在临床相关性的miR-34a的一种新功能。

低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）是众所周知的心脏病危险因素。我们还证明，在NAFLD患者中，HMGCR和LDL受体（LDLR）分别与LDL-C直接和反向相关。虽然他汀类药物治疗可降低NAFLD患者的LDL-C，但LDLR和HMGCR的表达仍保持在未使用他汀类药患者的水平。总之，这些数据表明NAFLD患者的肝胆固醇代谢普遍异常，这与疾病活动和心血管危险因素密切相关，特别是LDL-C。

结果

1.研究的患者群体

共有20名患有NAFL和NASH的受试者被纳入研究，并与20名肥胖对照组和6名瘦正常对照组进行比较。人口统计学、临床和实验室数据汇总见表1NAFL或NASH患者的性别、种族、体重指数、碱性磷酸盐、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）与肥胖对照组相似。正如预期的那样，与NAFL或NASH受试者相比，瘦正常受试者的胰岛素浓度、LDL-C、天冬氨酸和丙氨酸氨基转移酶较低。NASH受试者的甘油三酯水平显著高于瘦肉和肥胖对照者（分别P<0.01和0.006）。与NAFL或NASH患者相比，瘦正常对照组患者的LDL-C较低（p<0.0001），而只有NASH患者的LDL-C显著高于肥胖对照组（p<0005）。肥胖对照组、NAFL组和NASH组的少数受试者患有仅通过饮食控制的2型糖尿病。这些亚群在其他参数方面与他们组中的其他受试者没有差异。

表1

基线人口统计学、临床和实验室数据

参数精益正常
N=6
平均值±标准偏差。		肥胖正常
N=20
平均值±标准偏差。		NAFL公司
N=20
平均值±标准偏差。		美国国立卫生研究院
N=20
平均值±标准偏差。		P值
年龄（岁）42.5 ± 7.544 ± 6.546.4 ± 7.552.2 ± 7.7不另说明。
雄性：雌性（n）3:56:147:138:12不另说明。
白种人（n）6161518不另说明。
体重指数（kg/m2）21.4 ± 2.233.2 ± 2.234.1 ± 334.2 ± 3< 0.0001*
2型糖尿病（n）0三55不另说明。
高血压（n）0812120.02**
天冬氨酸转氨酶（单位/升）18 ± 519 ± 747 ± 2156 ± 23<0.002**
丙氨酸氨基转移酶（单位/升）22 ± 624 ± 569 ± 3272 ± 37<0.003**
碱性磷（IU/l）86 ± 2190 ± 997 ± 18101 ± 21不另说明。
胆红素（mg/dl）0.2 ± 0.080.3 ± 0.10.2 ± 0.10.3 ± 0.1不另说明。
白蛋白（克/分升）4.2 ± 0.24 ± 0.43.9 ± 0.34 ± 0.3不另说明。
空腹血糖（mg/dl）78 ± 885 ± 992 ± 1293 ± 14不另说明。
空腹胰岛素（uIU/dl）6.5 ± 317.2 ± 818 ± 1222 ± 9<0.004*
血红蛋白A1C（%）5.9 ± 0.36.3 ± 16.5 ± 1.56.3 ± 1.2不另说明。
总胆固醇（mg/dl）135 ± 21142 ± 34155 ± 32146 ± 34不另说明。
低密度脂蛋白胆固醇（mg/dl）82 ± 27118 ± 16128 ± 17132 ± 14<0.01***
高密度脂蛋白胆固醇（mg/dl）62 ± 846 ± 1042 ± 1238 ± 13<0.03**
甘油三酯（mg/dl）145 ± 35152 ± 41175 ± 45186 ± 33<0.01*
脂肪变性等级002.52.8不适用
炎症等级0002.4不适用
细胞学气球分级0001.9不适用
纤维化阶段0001.6不适用
*精益与其他群体
**NAFL或NASH与任一对照组
***NAFL和NASH高于瘦肉对照组，但只有NASH显著高于肥胖对照组

2.胆固醇代谢途径的现状

A： NAFLD中胆固醇合成途径上调

HMGCR（胆固醇合成的速率限制酶）在正常瘦人和肥胖人中的表达相似。NAFL和NASH均与HMGCR mRNA表达增加2-3倍有关（与瘦肉或肥胖对照组相比p<0.001），HMGCR蛋白水平增加3-4倍(图1a和2a-b号机组). HMGCR表达的增加并没有伴随着SREBP-2 mRNA水平的增加，SREBP-2是HMGCR的主要转录调节因子(图1a). 然而，在NASH中SREBP-2的核蛋白含量显著增加(图2a和b). 在各个组中，糖尿病患者与非糖尿病患者之间没有显著差异。

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肝胆固醇代谢相关关键基因的mRNA表达。（A） 肥胖正常对照组HMGCR、SREBP-2、LDLR和LAL的表达水平与瘦肉正常对照组相同。然而，NAFL和NASH均与HMGCR显著增加（两组与任一组相比均p<0.001）和LAL表达显著增加（两者与任一组均p<0.02）以及LDLR表达降低（NAFL或NASH与任一组比较均p<0.01）相关，（B）：NAFL和NASH与nCEH表达显著升高相关（与瘦肉或肥胖对照组相比，两者均p<0.0001）。与瘦肉对照组相比，肥胖对照组、NAFL和NASH的CYP7A表达显著增加（*p<0.02）。所有数据的平均值±S.D。

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瘦对照组、肥胖对照组、NAFL和NASH（分别为A和B组）、nCEH、ACAT2、CYP7A和CYP27A（C和D组）以及ABCA1、ABCG1和ABCG8（E和F组）中HMGCR、LAL、SREBP-2和LDLR蛋白表达的Western blot分析和图形总结。β-肌动蛋白被用作除SREBP-2外的所有药物的负荷控制，SREBP-2是在核提取物上进行的，其中层粘连蛋白B被用作负荷控制。NAFL和NASH与HMGCR的高度显著增加相关（*p均<0.0001）。NASH组SREBP-2水平显著高于对照组（*p<0.02）。NAFL和NASH患者的LDLR均显著降低（与对照组相比，两者均p<0.03），而LAL均升高（与对照者相比，两者p<0.02）。NAFL和NASH也与nCEH显著增加（与对照组相比，两者均p<0.01）以及CYP7A表达降低（两者均p<0.05）相关。从正常到NAFL再到NASH，ABCG8的表达呈逐步下降趋势（NASH组与瘦肉和肥胖对照组相比p<0.05）。与对照组和NAFL相比，仅NASH组CYP27A降低（与对照组及NAFL组相比p<0.02）。

B： NAFLD患者胆固醇摄取途径下调

LDL-C通过LDLR摄取，然后在后期内体中脱酯化，FC返回到质膜或用于细胞需要(Ikonen，2008年;塔巴斯，2000). 瘦肉和肥胖对照组中LDLR和溶酶体酸脂肪酶（LAL）的mRNA和蛋白水平相似。与HMGCR表达增加相比，NAFL或NASH患者LDLR的mRNA和蛋白水平均显著降低(图1a和2a-b号机组). 已知LDLR调节因子PCSK9的表达(Wang等人，2011年)，在研究组中相似(补充图2). LAL在NAFL和NASH中的表达增加。同样，在个体组内，糖尿病患者与非糖尿病患者之间没有显著差异。

C： NAFLD中胆固醇脱酯途径的表达增加

中性胆固醇酯水解酶（nCEH）使CE脱酯化，并将胆固醇返回肝内FC池。与对照组相比，NAFL或NASH患者的nCEH mRNA和蛋白水平均显著增加(图1b和2c-d天).

D： NAFLD胆固醇代谢途径表达减少

与观察到的nCEH表达增加相反，在患有NAFL或NASH的受试者中，ACAT-2的表达没有显著改变(图1b和2c-d天). 肥胖对照组与瘦肉对照组相比，胆固醇7α羟化酶（CYP7A）mRNA水平显著升高；同时，肥胖对照组的CYP7A蛋白水平增加较小，但无统计学意义。另一方面，与两组对照组相比，NAFL和NASH中CYP7A蛋白呈高度显著的逐步下降(图2c-d). NAFLD患者CYP27A mRNA水平没有变化。然而，仅NASH组CYP27A蛋白水平显著降低(图2c-d).

E： NAFLD患者胆固醇出口蛋白表达降低

与两个对照组相比，NAFL和NASH中ABCA1和ABCG1的mRNA水平均显著降低(图1c). 然而，尽管四个组的ABCA1蛋白水平相似，但只有与两个对照组相比，NASH的ABCG1蛋白水平才显著降低(图2e-f). NAFL中ABCG1的蛋白水平介于对照组和NASH之间，两者之间没有显著差异(图2c-d). 胆管胆固醇转运蛋白ABCG5的表达没有明显变化；然而，从正常到NAFL到NASH，ABCG8 mRNA和蛋白水平逐步下降，这对NASH来说是显著的(图1c和2c-d天).

3.NAFLD表型与HMGCR表达和FC积累有关

HMGCR单独表达与肝FC密切相关(图3a). HMGCR的表达与肝脏脂肪变性或炎症的严重程度没有显著相关性。然而，细胞学气球样变的存在和严重程度与肝FC以及HMGCR的表达之间存在显著的直接关系(图3b). NAFLD活动评分也与HMGCR表达显著相关(图3c). 与NAFL患者相比，NASH还与CYP27A水平显著降低以及胆汁胆固醇转运蛋白ABCG8表达降低有关。

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8名NAFLD患者和8名对照组中HMGCR表达与FC（A）的关系，其中有足够的肝组织可用于同时进行FC测量、mRNA和蛋白质分析。HMGCR与肝FC之间有着密切而直接的关系（p<0.0001）。还显示了NAFL或NASH患者HMGCR与细胞学气球评分（B）和NAFLD活动评分（C）的关系。与细胞学膨胀和NAFLD总活性评分（NAS）也有着密切而直接的关系。与NASH的其他特征没有关系（数据未显示）。

4.NAFLD与HMGCR的去磷酸化和FC合成增加有关

与瘦肉和肥胖对照组相比，NAFL和NASH均与HMGCR磷酸化降低相关，这表明HMGCR不仅表达增加，而且其生物活性更强(图4a-b) (Burg和Espenshade，2011年). Mir-34a是NASH中增加的一种miRNA，抑制调节AMP激酶（AMPK）活性的sirtuin-1，AMPK是HMGCR磷酸化的已知调节器(Chaudhary和Pfluger，2009年;Cheung等人，2008年;克拉克和哈迪，1990年). 为了进一步评估miR-34a对HMGCR磷酸化的影响，研究了miR-34a过度表达或沉默对其下游序列靶点sirtuin-1、AMPK和HMGCR的影响(图4 c-d). MiR-34a过表达降低了sirtuin-1水平以及磷酸化AMPK和HMGCR水平。相反，沉默miR-34a具有相反的效果。HMGCR相对去磷酸化状态对NASH患者的功能影响通过这些受试者与对照组相比桥甾醇：总胆固醇比率显著增加得到证实(图4e) (Matthan和Lichtenstein，2004年;Matthan等人，2010年). 谷甾醇：总胆固醇比率，胆固醇吸收活性的标志(Matthan等人，2010年)，在患有NASH的受试者中没有显著变化。

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与瘦肉或肥胖对照组相比，NAFL和NASH与HMGCR的磷酸化程度较低相关（代表性受试者的Western blot（A）和数据的图形摘要（每组6个），两者均p<0.05（B）。在另一组实验中，miR-34a，一种在NASH中过度表达的微小RNA，在Huh-7细胞中过度表达或沉默（面板C和D）。miR-34a的过度表达抑制了Sirt1和下游AMP激酶和HMGCR的磷酸化。沉默miR-34a产生了相反的效果。这些数据表明miR-34a可以调节HMGCR的磷酸化。为了进一步确定这些变化是否反映在胆固醇合成活性增加中，对NAFLD受试者（n=10）与瘦肉对照者（n=10）（E）的循环桥甾醇与胆固醇比率进行了测量。NAFLD患者的桥甾醇与胆固醇比率几乎是对照组的两倍，证实胆固醇合成活性增加。谷甾醇与胆固醇的比值没有显著差异，表明胆固醇吸收没有显著差异。所有图形数据的平均值±S.D。

5.低密度脂蛋白胆固醇与肝胆固醇代谢途径有关

LDL-C水平与HMGCR表达密切相关，与LDLR表达呈负相关(图5a-b). 许多NAFL或NASH患者接受他汀类药物治疗，以降低其LDL-C，这是一个关键的致热危险因素。为了进一步研究他汀类药物治疗能否逆转或改变肝胆固醇代谢途径中的变化，将第二组NASH患者（n=6）在诊断NASH时接受他汀类药治疗，与未服用他汀类或任何其他降血脂药物的受试者进行比较。这两组在人口统计学、临床和实验室参数方面具有可比性，但他汀类药物组的低密度脂蛋白胆固醇较低（117±24 vs.132±14 mg/dl，p<0.02）。然而，服用他汀类药物的NASH受试者HMGCR和LDLR mRNA低于未服用他汀的受试者，并且两组的蛋白表达相似(图5c-e). 服用他汀类药物的患者的气球膨胀和NAFLD活动评分略低，但这在统计学上并不显著。

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循环LDL-C与HMGCR表达水平（A）直接相关，与LDLR表达水平（B）反向相关（显示所有组所有受试者的数据）。将服用他汀类药物6个月以上的NASH患者与未服用他汀的患者进行比较。HMGCR和LDLR蛋白水平在两组中相似，分别在三名有代表性的受试者（C）中显示为Western blot（蛋白质印迹）（图中显示的是D组中的六名受试者）。服用他汀类药物的受试者HMGCR和SREBP-2的mRNA水平与不服用他汀的受试人员相比，低得离谱（两者均p<0.05）。将6名服用他汀类药物的受试者与20名不服用他汀的受试对象的数据进行比较。所有图形数据的平均值±S.D。

讨论

肝脏在胆固醇稳态中起着核心作用。目前的研究为NAFLD的两种主要表型NAFL和NASH中胆固醇稳态途径的多重复杂改变提供了证据。虽然这些对人体组织的研究不允许干预来确定NAFLD中FC积累的具体变化的确切作用，但它们确实提供了这种情况下胆固醇代谢途径变化的详细快照，并为受影响受试者FC积累的基础提供了线索。

目前的研究表明，产量的增加、利用率的降低和运输(图6)可能有助于NAFLD中FC的积累。这包括一方面激活HMGCR和nCEH，另一方面抑制CYP7A和ABCG8。其中，HMGCR的增加最为显著，其表达与肝脏FC和NAFLD活动评分密切相关。它还与血清LDL-C水平相关。这些数据支持HMGCR过度表达是NAFLD中LDL-C和肝FC积聚的关键因素这一概念。

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图中显示了NASH与瘦肉或肥胖对照组相比胆固醇代谢途径的关键分子变化。HMGCR和nCEH表达增加预计会增加FC池。由于CYP7A和CYP27A表达减少，FC在胆汁酸合成中的利用减少。ABCG1和ABCG8的表达也降低，这可能会减少肝细胞胆固醇的输出。

NAFLD中HMGCR mRNA和蛋白质水平的增加表明它是转录激活的。HMGCR的主要转录激活物SREBP-2的激活增加(Horton等人，1998年)似乎是HMGCR表达增加的机制。这些发现似乎对NAFLD具有特异性，因为在肥胖、体重匹配的对照组中没有发现。我们也没有发现丙型肝炎中HMGCR mRNA表达增加（见补充图1). NAFLD中SREBP-2激活可能有几种潜在机制，包括FC含量增加、未折叠蛋白反应(Puri等人，2007年;Puri等人，2008年). 确切的机制现在有待实验证实。

HMGCR不仅在NAFLD中增加，而且还相对去磷酸化，在NAFLD中以其活性形式存在(克拉克和哈迪，1990年). HMGCR活性增加的功能性后果被桥甾醇与胆固醇比率（胆固醇合成活性的标志物）几乎加倍的水平所证实(Matthan等人，2010年)，NAFLD受试者。我们的数据表明，miR-34a可以调节HMGCR磷酸化，并支持miR-34a增加可能在维持NAFLD中HMGCR活性形式中发挥作用的概念。然而，人们认识到，唯一确定的方法是抑制miR-34a，并评估其对NAFLD中HMGCR和肝脏胆固醇积累的影响。不幸的是，目前还没有试剂可以选择性地抑制人类体内的miR-34a。此外，饮食诱导的NAFLD动物模型的FC和CE（个人观察）成比例增加，因此与NAFLD患者不同(Puri等人，2007年).

众所周知，通过LDLR摄取LDL-C通过抑制SREBP-2激活提供HMGCR的反馈抑制(Goldstein和Brown，2009年). 因此，有人可以假设，由于NAFLD中LDLR的降低，导致肝对LDL衍生胆固醇的摄取减少，从而导致SREBP-2成熟的去抑制和HMGCR的转录激活。然而，除非不能克服LDLR抑制的主要原因的影响，否则这也会增加LDLR的表达。PCSK9是一种已知的LDLR表达抑制剂(Horton等人，2007年). 然而，PCSK9 mRNA在我们的研究组中相似，这表明其他机制与NAFLD低LDLR表达有关。

NASH还与CYP7A和CYP27A水平的降低有关；CYP27A是一种线粒体蛋白，其减少可能反映了线粒体损伤，这种损伤在NASH中存在，但在NAFL中不存在(Caldwell等人，2009年;Perez-Carreras等人，2003年). 此外，胆汁胆固醇预计会因ABCG8的减少而降低。然而，胆固醇结石在肥胖人群中普遍存在(Chen等人，2006年). 这表明NASH存在ABCG5/ABCG8非依赖性的胆汁胆固醇分泌。这些可能性及其影响需要进一步澄清。

先前的研究侧重于游离脂肪酸在NAFLD中作为脂肪毒性关键驱动因素的作用，并支持以下概念：甘油三酯的合成通过充当油底壳来限制脂肪酸积累，从而降低脂肪酸毒性(Feldstein等人，2004年;山口等，2008年). 目前的研究通过提供HMGCR活性和FC积累与组织损伤严重程度和疾病分期之间关系的证据，将脂肪毒性的概念扩展到FC积累。从心血管角度来看，LDL-C和HMGCR表达之间的直接关系表明，肝病有助于LDL介导的心血管风险。此外，他汀类药物治疗中低密度脂蛋白受体的表达低于预期可能会对他汀类药在该人群中的益处产生负面影响。然而，这需要进行前瞻性验证，因为至少在理论上，服用他汀类药物的受试者在开始治疗前的低密度脂蛋白受体低于未服用他汀的受试人群。

纳入2型糖尿病患者可能被视为潜在的混淆因素。然而，考虑到NASH受试者中糖尿病的高发病率，未能包括这些受试者将限制数据的通用性。这些患者在其他方面与他们的其他队列相似，并且这些受试者与每组中的其他受试者之间没有差异。然而，对于更严重的糖尿病，可能会发现胆固醇代谢途径中的其他差异性变化。

总之，目前的研究为NAFLD中胆固醇稳态途径的广泛异常提供了证据。主要发现是HMGCR表达增加，LDL受体和胆汁酸合成酶表达减少。这些异常的机制以及特定通路的变化对NASH疾病活动和进展以及加速动脉粥样硬化的影响有待阐明。

实验程序

人体和肝脏活检

研究了四组受试者：（1）生物病理证实的NASH，（2）活检证实的非酒精性脂肪肝（NAFL），（3）肝组织学正常的体重和性别匹配的肥胖受试者，以及（4）肝组织结构正常的瘦肉受试者。正常肝状态定义为正常肝酶和影像学检查以及无症状状态。脂肪肝和脂肪性肝炎是根据以前使用的标准诊断的(Kleiner等人，2005年). 该疾病的非酒精性是通过临床确定的，在过去五年内，女性每日摄入酒精<20克，男性每日摄入酒精<30克，与该疾病的其他研究一样(Chalasani等人，2009年). 饮食控制的2型糖尿病受试者被允许纳入研究范围，因为许多NAFLD受试者患有2型糖尿病，排除这些受试者可能会限制数据的概括性。

该研究的排除标准包括未获得知情同意、同时妊娠、存在晚期肝纤维化（3或4期疾病）、肝衰竭（胆红素升高或INR>1.5）、前3个月内体重增加或减少超过5%、HIV感染、，同时出现其他肝病和使用已知会影响脂质代谢的药物，如他汀类药物、贝特类药物、多不饱和脂肪酸等，或影响NASH，如维生素e、噻唑烷二酮类和己酮可可碱。对于他汀类药物的疗效研究，研究对象为符合NASH或NAFL纳入标准但服用稳定剂量他汀类药超过6个月的受试者。

对于肥胖的正常受试者，在临床指示的肝活检时或非肝选择性手术（减肥手术或胆囊切除术）开始时获取肝组织。瘦的正常肝组织是从作者所在机构外科病理科的组织库中获得的。组织在液氮中快速冷冻以备将来使用。所有受试者均提供了知情同意书。该研究得到了机构IRB的批准（VCU IRB#1960）。

实时PCR定量基因表达

底漆是使用Beacon Designer™软件（Bio-Rad Laboratories，Inc.）并使用BLAST搜索进行验证(表S1). 其中包括ABCA1、ABCG1、ABGC5、ABCG8、ACAT2、CYP7A1、CYP27A1、HMGCR、LAL、LDLR、nCEH、PCSK9和SREBP-2型根据制造商的说明，使用商业RNA分离试剂盒（Trizol、Invitrogen）提取肝活检中的总RNA。在用无RNase DNA酶纯化以从制剂中去除基因组DNA后，从4微克使用Maloney鼠白血病病毒逆转录酶和寡核苷酸（dT）引物，并按照制造商的说明进行PCR。如前所述，在ABI Prism 7300序列检测系统上使用SYBR Green PCR主混合液（加州Hercules BioRad）进行定量RT-PCR(Puri等人，2008年)：50°C 2分钟，然后在95°C下10分钟，然后进行40次放大循环（95°C 15秒；60°C 30秒；80°C 30秒钟）。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）被用作内源性标准化物。qPCR的特异性是通过加入无模板和无逆转录对照来确定的。在活体供肝移植时，从一个瘦正常个体的组织学正常肝脏中提取的总RNA被用作所有实验的内部校准物。循环阈值（Ct）值归一化为GAPDH，并使用集成软件和Stratagene Mx3000P®QPCR系统通过ΔΔCt方法对靶mRNA进行比较定量。

miRNA的定量RT-PCR测量

这是按照前面的描述执行的。如前所述，从冷冻肝组织或细胞培养物中分离并提取总RNA和小分子RNA(Puri等人，2008年). 根据制造商的说明，使用TaqMan MicroRNA逆转录酶（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）合成cDNA。如Bloomston所述，使用Applied Biosystems 7300序列检测系统进行三次RT-PCR(Bloomston等人，2007年). 根据制造商的方案，将小核RNA U6（RNU6B，Applied Biosystems）归一化后，计算miRNA的相对丰度。

蛋白质提取和蛋白质印迹分析

这是按照我们之前的描述进行的(Puri等人，2008年). 使用裂解缓冲液（西格玛，圣路易斯，密苏里州）将人体肝组织均质化，然后使用声波细胞破碎器100型声波分解器（Thermo Fisher Scientific Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆；功率2，6脉冲×2）在冰上进行声波分解。细胞裂解物以12000 g x 30分钟离心，上清液中的蛋白质使用4-12%NuPAGE®Novex Bis-Tris Mini Gels（Invitrogen）进行定量和分离，并使用Western印迹设备（Invitrogen）在40 V下转移到硝化纤维膜上1小时。在与一级抗体孵育过夜后，洗涤膜并与HRP缀合的二级抗体（Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL）孵育，并使用SuperSignal化学发光试剂盒（Pierce）进行检测。如前所述进行信号捕获和蛋白质水平分析(Cheung等人，2008年).SREBP-2型和层粘连蛋白B如前所述，通过Western blot在核提取物中测量(Cheung等人，2008年).

细胞培养和转染协议

Huh-7细胞系在含有10%胎牛血清（FBS）、100IU/ml青霉素和100g/ml链霉素的DMEM中生长。根据制造商的说明，使用商业RNA分离试剂盒（Trizol，Invitrogen）提取Huh-7细胞的总RNA。miR-34a和miR-34a-抑制剂购自Dharmacon RNA Technologies（美国科罗拉多州拉斐特）。根据制造商的方案，细胞被镀至50%汇合处，并转染40 nmol/l miR-34a、miR-34b抑制剂或Opti-MEM（Invitrogen，Carlsbad，CA）中Lipofectamine 2000（Invit罗gen）的阴性对照。用FAM染料标记的Pre-miR™阴性对照品#1（Ambion.Co.）监测转染效率。48小时后，收集细胞进行分析。

桥甾醇、谷甾醇的测量

简单地说，将200微升血清加入氘化内标，并使用己烷从样品中提取样品中的甾醇。使用涡轮增压器在40°C下干燥有机上清液，并在80:20甲醇：异丙醇中重组样品，并通过液相色谱-串联质谱（LC-MSMS）进行分析，监测每个甾醇的特定m/z转换。分析是在AB Sciex 5500 MSMS和岛津Prominence 20系列泵上进行的。

统计分析和样本量估计

使用N Query Advisor 7.0进行样本量估计。为了检验NAFL和NASH的大小（平均水平控制vs.疾病）分别为1.25和1.5的假设，并假设各组的标准偏差为25%，在p值为0.05时检测变化的能力为80%，每个组总共需要6名受试者。如果NASH的影响大小是2倍变化，NAFL的影响大小为1.5倍变化，那么每只手臂的样本量减少到3名受试者。由于不知道每个待测生物参数的准确标准偏差，计划每组至少20名受试者的样本量，但研究6名受试对象的瘦正常人除外（主要是由于组织可用性有限）。使用Kruskal-Wallis方差分析（ANOVA）（一种无分布检验）对给定基因的RNA和蛋白质水平进行跨组比较。Bonnferroni后测用于多重比较。显著性设置为0.05。

​

亮点

  • NAFLD患者HMGCR升高，LDL受体表达降低。
  • HMGCR表达与FC积累和NAFLD的组织学严重程度相关。
  • LDL-C与HMGCR直接相关，与NAFLD中LDLR表达相反。
  • miR-34a使HMGCR去磷酸化，并可能增加NAFLD中胆固醇的合成。

补充材料

01

补充图1：比较瘦肉对照组、肥胖对照组和丙型肝炎患者（n=20）HMGCR mRNA的表达。丙型肝炎病毒感染者HMGCR mRNA表达显著低于对照组。

补充图2：在瘦和肥胖对照组（各6例）和NAFL或NASH受试者（各8例）中测量PCSK9 mRNA表达。方差分析显示，各组间无显著差异。

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缩写

NAFLD公司非酒精性脂肪肝
美国国立卫生研究院非酒精性脂肪性肝炎NAFL：非酒精性肝
常设费用游离胆固醇
总费用总胆固醇
总工程师胆固醇酯
低密度脂蛋白低密度脂蛋白
低密度脂蛋白受体低密度脂蛋白受体
nCEH公司中性胆固醇酯水解酶
ACAT公司酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶
CYP7A1公司胆固醇7α羟化酶
CYP27A1号胆固醇27α羟化酶
拉勒溶酶体酸脂肪酶
GAPDH公司甘油醛-3-磷酸脱氢酶

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们提供这份手稿的早期版本。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

这项研究仅在2008年旧金山举行的美国肝病研究协会年会上作了部分介绍。这项工作得到了国家卫生研究院对Sanyal K24 DK 02755和T32 DK-007150-33博士的两项资助。作者感谢迈克尔·潘达克博士、任顺林博士和菲利普·海利蒙博士的建议。

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