人肾脏型谷氨酰胺酶（KGA）变构抑制机制的结构基础及其在癌细胞代谢中的Raf-Mek-Erk信号调节

摘要

癌症生物学中的Warburg效应描述了癌症细胞比大多数正常细胞吸收更多葡萄糖的趋势，尽管存在氧气(1,2). 除了改变葡萄糖代谢外，谷氨酰胺分解（谷氨酰胺分解为ATP和乳酸）是癌细胞的另一个特征(2,三). 在谷氨酰胺水解中，线粒体谷氨酰胺酶催化谷氨酰胺转化为谷氨酸(4)在克雷布斯循环中进一步分解代谢，生成ATP、核苷酸、某些氨基酸、脂质和谷胱甘肽(2,5).

人类表达两种谷氨酰胺酶亚型：KGA（肾脏型）和LGA（肝脏型），来自两个密切相关的基因(6). 尽管KGA对促进生长很重要，但对其激活或抑制的确切机制以及其功能在生理或病理生理条件下是如何调节的尚不清楚。反义mRNA抑制大鼠KGA活性导致Ehrlich腹水肿瘤细胞生长和致瘤性下降(7)谷胱甘肽水平降低，诱导细胞凋亡(8)而Myc，一种致癌转录因子，刺激KGA表达和谷氨酰胺代谢(5). 有趣的是，miR23a和miR23b的直接抑制(9)或TGF-β的激活(10)增强KGA表达。类似地，控制细胞骨架和细胞分裂的Rho GTPase也以NF-κB依赖的方式上调KGA表达(11). 此外，KGA是泛素连接酶后发复合体/环体（APC/C）-Cdh1的底物，将谷氨酸分解与细胞周期进展联系起来(12). 相比之下，虽然最近发现LGA与p53通路有关，但LGA的功能和调节还没有得到很好的研究(13,14). 尽管正在加紧努力开发一种特定的KGA抑制剂，如BPTES[双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚](15)，其抑制和选择性的机制尚不清楚。同样重要的是了解KGA功能在正常细胞和癌细胞中是如何调节的，以便考虑更好的治疗策略。

微生物（Mglu）和大肠杆菌谷氨酰胺酶显示KGA的保守催化结构域(16,17). 然而，人类谷氨酰胺酶（尤其是KGA）的详细结构信息和调控尚不可用，这阻碍了我们开发抑制剂的战略。在这里我们报告了人类催化结构域的晶体结构阿波罗KGA及其与底物的配合物(我-谷氨酰胺），产品(我-谷氨酸）、BPTES及其衍生抑制剂。此外，Raf-Mek-Erk模块被确定为KGA活动的调节器。虽然BPTES在活性位点中不被识别，但其结合导致关键环（Glu312-Pro329）的剧烈构象变化，这对稳定催化囊至关重要。值得注意的是，EGF激活KGA活性，Mek2（Mek2-K101A）或其上游激活物Raf-1（Raf-1-K375M）的激酶头、显性阴性突变体可以消除KGA活性。Raf-Mek2-Erk信号节点是促生长的激酶成分。此外，磷酸酶PP2A的共表达和Mek-特异性抑制剂或碱性磷酸酶的处理均消除了细胞内和体外增强的KGA活性，表明KGA的刺激是磷酸化依赖性的。因此，我们的结果为BPTES抑制KGA及其通过EGF-介导的Raf-Mek-Erk模块在细胞生长和可能的癌症表现中的调节提供了机制上的见解。

结果

cKGA及其与我-谷氨酰胺和我-谷氨酸。

人类KGA由669个氨基酸组成。我们将Ile221-Leu533称为KGA的催化结构域（cKGA）(图1A类). 的晶体结构阿波罗cKGA与我-谷氨酰胺或我-测定谷氨酸(表S1). cKGA的结构有两个域，活性位点位于界面。域I由五链抗平行β-片（β2↓β1↑β5↓β4↑β3↓）组成（Ile221-Pro281和Cys424-Leu533），其周围有六个α-螺旋和几个环。结构域II（Phe282-Thr423）主要由七个α螺旋组成。我-谷氨酰胺/我-谷氨酸结合在活性位点裂隙中(图1B类和图S1B类). 总的来说，活性位点是高度碱性的，结合配体与Gln285、Ser286、Asn335、Glu381、Asn388、Tyr414、Tyr 466和Val484进行了几个氢键接触(图1C和图S1C)，这些残基在KGA同源物中高度保守(图S1天). 值得注意的是，假定的丝氨酸-赖氨酸催化二元（286-S公司个人简历K（K）-289），对应于S公司XX个K（K）D类β-内酰胺酶的基序(17)，位于结合配体附近。在阿波罗结构上，两个水分子位于活性部位，其中一个被底物复合体中的谷氨酰胺取代。底物侧链与活性位点Ser286之间的氢键距离（2.9°）内。其他参与催化的关键残基，如Lys289、Tyr414和Tyr466，位于活性位点附近。Lys289与Ser286（3.1º）之间的氢键距离很近，通过接受来自Ser286的质子，Lys289成为亲核攻击的一般基础。Tyr466靠近Ser286，与谷氨酰胺呈氢键接触（3.2μl），在催化过程中参与质子转移。此外，谷氨酰胺的羰基氧与Ser286和Val484主链氨基进行氢键结合，形成氧阴离子孔。因此，我们认为，除了假定的催化二元体（Ser286 XX Lys289）外，Tyr466还可以在催化中发挥重要作用(图1C和图S2).

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图1。

cKGA的示意图和结构-我-谷氨酰胺复合物。(A类)人类KGA域和特征基序（参见图S1A类详细信息）。(B类)cKGA与结合底物的结构(我-谷氨酰胺）显示为青色棒。(C)傅里叶2F类_o个-F类_c（c）电子密度图（1σ等高线）我-谷氨酰胺与活性位点残基形成氢键。

BPTES的变构装订袋。

cKGA:BPTES复合物的晶体结构表明，BPTES在cKGA二聚体界面的溶剂暴露区占据了一个之前未曾预料到的变构口袋，该区域距离活性位点丝氨酸（Ser286）约18°(图2A类)_.BPTES的化学结构具有内部对称性，有两个完全相等的部分，包括噻二唑、酰胺和苯基(图S3A类)，并且它与每个单体都平等地相互作用。噻二唑基团和脂肪族连接体被很好地埋藏在由两个单体的Leu321、Phe322、Leu323和Tyr394组成的疏水簇中，形成变构口袋(图2B–E类). Phe322的侧链位于变构口袋的底部。BPTES的苯基-乙酰氨基部分部分暴露在环（Asn324-Glu325）上，在环中它与Phe318、Asn324和Glu324侧链的脂肪族部分相互作用。根据我们的观察，我们合成了一系列BPTES衍生的抑制剂（化合物2——5) (图S3A类——F类和SI结果)并解决了化合物的共晶结构2——4类似于BPTES，化合物2——4它们都位于变构口袋的疏水簇内(图S3C——F类).Tyr394的侧链是Phe322和Leu323的主链酰胺，与抑制剂形成氢键接触。此外，残基Leu321和Phe322翻转约180°，以增强与抑制剂的疏水相互作用。因此，构象变化是形成变构口袋所必需的。进一步的动力学研究表明，化合物2——5抑制cKGA的程度低于BPTES(图S3B类)，我们认为BPTES的结合特异性由噻二唑、酰胺和疏水连接子区域决定，而其效力主要取决于两端是否存在苯环。因此，BPTES随后被用于进一步描述KGA的结构、功能和调节方面。

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图2。

cKGA:BPTES复合物的结构和BPTES的变构结合模式。(A类)cKGA二聚体和BPTES的结构显示为青色棒。(B类)cKGA变构抑制剂结合囊中BPTES相互作用的特写视图。(C)电子密度图(2楼_o个\x{2013年}F_c（c）图中显示了BPTES的等高线为1.0σ）。(天)二聚体界面处环Glu312-Pro329的表面暴露区域上的BPTES结合囊的特写视图。(E类)硫酸根离子、氢键、盐桥和每个单体残基之间的疏水相互作用形成的二聚体界面的垂直视图。(F类)BPTES结合引起的cKGA构象变化。为了清晰起见，只显示了一半的BPTES。单体BPTES络合物（品红）和阿波罗cKGA（绿色），显示Glu312-Pro329环上关键残基的构象变化。BPTES结合位点位于距活性位点（Ser286）约18°处。

BPTES诱导变构构象变化，使KGA的催化功能失稳。

随后，我们通过比较cKGA:BPTES抑制剂复合物和阿波罗cKGA结构。由于环Glu312-Pro329位于活性位点附近，我们假设BPTES结合诱导环的关键残基（Glu31i-Pro329）的构象变化，以稳定催化位点的开放和非活性构象。为了验证这一假设，野生型KGA和结构导向型KGA突变体Phe318Ala、Leu321Ala、Phe322Ala和Leu323Ala以及来自二聚螺旋的Tyr394Ala变异体在人类胚胎肾上皮细胞293T中以相同水平表达，并测定细胞内谷氨酸的稳态水平。图3A类结果表明，与载体控制细胞相比，过度表达KGA的293T细胞产生更高水平的谷氨酸。最重要的是，除Phe322Ala外，所有这些突变体都大大降低了KGA活性。

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图3。

变构环和BPTES结合囊的突变会削弱KGA活性和BPTES敏感性。(A类)将表达野生型、单点或多点HA-标记KGA突变体的载体控制或质粒转染293T细胞24小时，然后制备细胞裂解物用于谷氨酰胺酶分析。为了清楚起见，包括虚线以指示基准面。用Western blots验证野生型和突变体KGA的表达水平相等。每个值代表三个独立实验的平均值±SD。(B类)BPTES结合囊中cKGA残基的突变分析。测量了BPTES对所示野生型和cKGA突变体的敏感性及其IC₅₀计算的值。每个值代表重复进行的三个独立实验的平均值±SD。

接下来，我们研究了这些残基是否专门参与稳定BPTES–KGA相互作用。与所有先前具有Ala取代以敲除其对实际酶活性的直接贡献的突变体不同，取而代之的是产生一组重组cKGA突变体（Phe318Tyr、Phe322Ser、Phe318Tyr/Phe322Ser和Tyr394Ile）来测试其BPTES敏感性。特别是，使用Phe318Tyr/Phe322Ser双突变体模拟谷氨酰胺酶（LGA）肝脏形式中的相应残基。结果表明，所有这些突变体仍保持与野生型对照相同的KGA活性(图S7A类). 然而，三个突变体Phe322Ser或Phe318Tyr/Phe322-Ser和Tyr394Ile对BPTES的敏感性显著降低（分别为1140-、970-和910-倍）(图3B类). 相比之下，Phe318Tyr保留了芳环并仍然具有活性，对BPTES仍然高度敏感。总之，与我们的结构分析一致，环Glu312到Pro329和Tyr394的所有关键残基对于赋予KGA活性至关重要，至少Phe322和Tyr 394参与稳定BPTES–KGA相互作用。BPTES结合上的任何构象变化都会严重影响KGA催化核心的稳定性，从而影响其活性。

Raf-Mek-Erk信号模块调节KGA活动。

因为KGA支持细胞生长和增殖，我们首先验证了用BPTES治疗细胞确实会抑制KGA活性和细胞增殖(图S5A类——天和SI结果). 其次，当细胞对各种生理刺激作出反应以调节其代谢时，许多代谢酶是调节的主要目标(18)，我们研究了KGA活性是否可以由生理刺激调节，特别是EGF，它对细胞生长和增殖很重要。将过度表达KGA的细胞静止，然后用EGF刺激不同时间点。图4A类显示EGF刺激后30分钟，基础KGA活性保持不变，但1小时后活性显著增强，4小时后逐渐恢复到基础水平。因为EGF激活Raf-Mek-Erk信号模块(19)，用Mek特异性抑制剂U0126处理细胞可以通过平行抑制Erk磷酸化来阻断增强的KGA活性(图4A类). 有趣的是，这种Mek-诱导的KGA活性对EGF和溶血磷脂酸（LPA）是特异的，但对其他生长因子，如PDGF、TGF-β和碱性FGF（bFGF）则不是特异的，尽管bFGF激活了Mek-Erk(图S6A类). 接下来，我们研究了EGF激活的Raf-Mek-Erk是否确实能够直接调节KGA活性。用野生型、“显性阴性和激酶缺失”或Raf-1和Mek2组成活性突变体的KGA转染细胞，并测定谷氨酸水平。引人注目的是，KGA活性被Raf-1（K375M）和Mek2（K101A）的显性阴性突变体完全抑制，而Raf-1的野生型和组成型活性突变体（Raf-1-Y340D）和Mek 2（Mek2-S222，226D）均未导致谷氨酸产量进一步增加(图4B类). 此外，这些突变体的表达并不影响外源表达或内源性KGA水平的表达水平(图4C和图S6B类)表明KGA活性的任何变化不是由于其蛋白质稳定性，而是由于KGA的一些翻译后修饰。为了检测这种调节是否与Raf-Mek-Erk复合物直接相关，从细胞中免疫沉淀过表达的KGA，并检测Raf-1、Mek2或Erk1/2（内源性或过表达）的存在。结果表明，KGA能与野生型或突变型Raf-1和Mek2同样有效地相互作用(图4C). 重要的是，内源性Raf-1或Erk1/2，包括磷酸化的Erk1/2(图4C和天)可以在KGA复合体中检测到。综上所述，这些结果表明KGA的活性由EGF受体下游的Raf-Mek-Erk直接调节。为了进一步证明Mek2增强的KGA活性需要Mek2的激酶活性和KGA催化的核心残基，KGA的野生型或三重突变体（Leu321Ala/Phe322Ala/Leu323Ala）与显性负Mek2-KA或组成活性Mek2-SD共存，并测量其KGA活性。结果表明，Mek2-KA的存在阻断了KGA的活性，而三重突变体即使在组成活性Mek2的存在下仍然保持惰性(图4E类)尽管Mek2与KGA三突变体结合(图S7B类). 因此，表达三重突变体并不支持细胞增殖和野生型控制(图S7C).

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图4。

EGFR-Raf-Mek-Erk信号刺激KGA活性。(A类)将表达HA标记KGA的293T细胞饥饿24小时，然后用EGF（100 ng/mL）刺激指定时间。细胞被裂解并测定其谷氨酰胺酶活性。通过Western blot分析验证了KGA的表达水平和Erk激活谱（如磷酸化Erk的水平所示）。(B类)对表达带有或不带有HA标记野生型、显性阴性突变体（Raf-1-K375M；Mek2-K101A）或组成活性突变体（Raf-1-Y340D；Mek2-S222，226D）的Flag-taged KGA的细胞进行裂解和谷氨酰胺酶活性分析。(C)为谷氨酰胺酶测定制备的同一批细胞裂解物B类用抗Flag M2微球进行免疫沉淀（IP）。用蛋白质印迹分析结合蛋白及其在全细胞裂解物（WCL）中的表达。(天)使用抗Flag M2微球对表达Flag标记KGA的细胞进行免疫沉淀，并通过Western blot分析内源性Raf-1或Erk1/2的存在。箭头表示Raf-1的带。(E类)在没有或存在Mek2-K101A或Mek2-S222226D的情况下，用表达野生型KGA或KGA三重突变体（L321A/F322A/L323A）的载体控制或质粒转染293T细胞24小时，然后制备用于谷氨酰胺酶分析的裂解物。通过蛋白质印迹分析验证了这些蛋白质的表达水平。所有值均为三个独立实验的平均值±SD，每个实验有多个重复。共享不同字母的数据在P（P）指示值，由方差分析或t吨测试。

有趣的是，当表达KGA和Mek2-K101A的细胞被阈下水平的BPTES处理时，细胞增殖协同减少(图S6C和SI结果). 最后，为了确定Raf-Mek-Erk对KGA的调节是否取决于其磷酸化状态，用KGA转染细胞，转染细胞中是否含有蛋白磷酸酶PP2A，并检测KGA活性。PP2A是一种普遍存在的保守的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，具有广泛的底物特异性。结果表明，在PP2A的存在下，KGA活性降低至基础水平(图5A类). 免疫共沉淀研究还显示KGA与PP2A相互作用(图5B类)表明该蛋白磷酸酶具有负反馈调节作用。此外，用小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）处理免疫沉淀和纯化的KGA几乎完全消除了KGA在体外的活性(图S6天). 综上所述，这些结果表明KGA活性受Raf-Mek2调节，EGF激活KGA可能是EGF刺激的Raf-Mek-Erk信号程序控制细胞生长和增殖的一部分(图5C).

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图5。

KGA活性受磷酸化调节。(A类)在蛋白磷酸酶PP2A的myc标记催化亚基存在或不存在的情况下，从表达Flag-tagged KGA的细胞制备裂解物，并检测谷氨酰胺酶活性。数值为三个独立实验的平均值±SD。共享不同字母的数据在P（P）<0.02，经测试方差分析. (B类)从为谷氨酰胺酶测定准备的同一批细胞裂解液中分离等分样品A类进行免疫沉淀（IP）。用Western blots分析结合myc-PP2A及其在全细胞裂解物（WCL）中的表达水平。(C)描述KGA介导的谷氨酰胺分解和EGF激活的Raf-Mek-Erk信号之间协同串扰的示意模型。外源谷氨酰胺可以通过膜转运，并通过谷氨酰胺酶（KGA）转化为谷氨酸，从而将代谢物送入产生ATP的三羧酸（TCA）循环。EGF受体介导的Raf-Mek-Erk信号可通过磷酸化依赖途径刺激这一过程，Raf-1（Raf-1-K375M）和Mek2（Mek2-K101A）的激酶头和显性阴性突变体、蛋白磷酸酶PP2A和Mek特异性抑制剂U0126对KGA活性的抑制证明了这一点。因此，用BPTES抑制KGA和用Mek2-K101A阻断Raf-Mek通路对细胞增殖具有协同抑制作用。有关更多详细信息，请参阅正文。

讨论

针对癌细胞中谷氨酰胺酶活性的小分子抑制剂正在开发中。早期使用谷氨酰胺类似物靶向谷氨酰胺酶的研究因其毒性而失败(2). BPTES作为一种选择性、无毒的KGA抑制剂引起了广泛关注(15)以及针对人类癌症的BPTES临床前测试刚刚开始(20). BPTES选择性抑制胶质瘤细胞的生长(21)在动物模型研究中抑制淋巴瘤肿瘤生长(22). Wang等人(11)报道了一种靶向谷氨酰胺酶活性和致癌转化的小分子。尽管进行了广泛的研究，但对KGA抑制机制的结构和分子基础以及它们在正常和癌细胞代谢过程中的功能是如何调节的，目前还一无所知。这些有限的信息阻碍了我们为更好的治疗方案生产更好代抑制剂的努力。

复杂结构与阿波罗cKGA结构具有明确的关键环电子密度，我们提供了BPTES变构结合囊的原子视图，并阐明了BPTES对KGA的抑制机制。环的关键残基（Glu312-Pro329）在结合BPTES时发生主要的构象变化。此外，基于结构的突变研究表明，该环对于稳定活性位点至关重要。因此，通过在变构口袋中结合，BPTES通过以下途径抑制KGA的酶活性(我)触发关键残基上的主要构象变化，通常参与稳定活性位点和调节其酶活性；和(ii（ii）)形成稳定的非活性四聚体KGA形式。我们的发现得到了最近两篇关于KGA亚型（GAC）的报道的进一步支持(23,24)尽管由于电子密度图的局限性，这些研究缺乏完整的细节。BPTES针对KGA，但不针对LGA(15). KGA与LGA的序列比较(图S8A类)揭示了KGA上的两个独特残基，Phe318和Phe322，它们在LGA对应物突变后，对BPTES产生耐药性。因此，我们的研究提供了BPTES特异性的分子基础。

最近有报道称，KGA被Myc和Rho上调，并受到泛素化的影响(9,11,12). 然而，关于谷氨酰胺酶分解途径如何与促生长信号途径在功能上联系，目前知之甚少。许多代谢酶被认为是管家酶，控制代谢物的流动以维持而不是主要调节细胞生长。在这里，我们表明高水平的KGA活性可导致细胞增殖增加，而BPTES可抑制细胞增殖。最重要的是，我们发现KGA活性是由EGF通过Raf-Mek-Erk信号模块激活的，因为这两种激酶都被其显性阴性突变体所抑制，或者用特定Mek抑制剂处理，从而完全消除了KGA活性。与磷酸化依赖的调节一致，KGA与蛋白磷酸酶PP2A共存或纯化KGA与碱性磷酸酶处理都会阻止KGA活性升高。当环上稳定KGA催化核心的关键残基发生突变时，这种刺激就会消失。这些结果表明，Raf-Mek-Erk信号与生长代谢的重新编程有关。

我们表明，Mek2和BPTES对KGA和细胞增殖的联合抑制作用可以为癌症的多药治疗提供一个令人兴奋的方案。了解KGA本身是如何被Raf-Mek信号激活的，也将为进一步研究KGA的放松调控及其过度激活是否与该途径有关提供另一种方法。这可能是癌症中细胞生长异常的基础，也可能是其他代谢和神经疾病的基础，包括谷氨酸或氨作为主要代谢物，如高胰岛素血症/高氨血症/肝性脑病和神经递质(25,26). 在这方面，我们表明KGA与Raf-1、Mek2和Erk1/2以及蛋白磷酸酶PP2A形成复合物，该复合物可以锚定在共同的支架蛋白上，也可以作为不同的亚复合物存在。这种激活是否会直接涉及KGA作为Raf-1、Mek2或/和Erk的底物，或是否存在这些激酶的其他直接底物作为KGA的协同调节物，尚待进一步研究。这是特别有趣的，因为我们表明，尽管bFGF激活了Mek/Erk，但它并不激活KGA活性。这一结果突显了这些三层激酶的严格调控，这些激酶可以通过不同的支架或其他未知的协同调节剂在空间上进行协调。此外，cKGA的结构域II与几个含有DEATH结构域的蛋白质同源(图S8B类)已知其调节许多信号通路，如NF-κB和凋亡(27).

总之，当前的结构、生物化学、分子和基于细胞的研究为BPTES对人类KGA的变构抑制、EGF受体介导的Raf/Mek/Erk信号模块对KGA活性和细胞增殖的调节以及癌细胞代谢中的磷酸化依赖机制提供了详细的见解。这可能为开发针对KGA和Mek2-连接途径的更特异的治疗性抑制剂铺平道路，并可能提供更有效的策略来更有效地治疗谷氨酰胺依赖的癌症。

材料和方法

cKGA结构的蛋白质生产、酶分析和晶体学研究在SI文本如前所述进行质粒纯化、转染、细胞增殖试验和免疫沉淀试验(28,29). 有关详细信息，请参阅SI文本.

补充材料

致谢

脚注

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