自然杀伤细胞功能的早期变化表明干扰素治疗丙型肝炎的病毒学反应

摘要

介绍

目前慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染的治疗包括24或48周聚乙二醇化干扰素-α（IFN-α）和利巴韦林疗程。了解干扰素诱导丙型肝炎病毒清除的机制很重要，因为只有大约50%的接受治疗的患者获得了持续的反应，而且干扰素仍将是直接抗病毒药物新治疗方案的重要组成部分¹根据治疗期间血清HCV滴度的数学模型，有人提出IFN-α介导的HCV复制和病毒释放阻断会导致第一阶段，即48小时血清HCV效价下降²病毒血症的迅速减少伴随着缓慢的第二阶段下降，这被认为是感染肝细胞的消除²由于IFN-α的免疫调节活性，清除HCV感染的肝细胞可能是免疫介导的。然而，迄今为止，负责消除受感染肝细胞的免疫细胞尚未被鉴定。

多项研究已经得出结论，HCV特异性T细胞对治疗诱导的HCV清除没有帮助（在^三). 事实上，在基于干扰素的治疗过程中，HCV特异性CD8+T细胞反应下降，治疗结果与HCV特异的CD8+和CD4+T细胞的反应强度和质量无关^三.

一些发现促使我们在丙型肝炎治疗的背景下研究NK细胞。首先，NK细胞是肝脏中最常见的淋巴细胞亚群，约占肝内淋巴细胞的30%⁴第二，目前慢性丙型肝炎的治疗方案包括干扰素-α，一种NK细胞的有效激活剂⁵第三，调节NK细胞活性的某些受体的基因型与HCV自发清除和治疗诱导清除的可能性较高相关^6,7.

NK细胞由激活和抑制细胞表面受体的信号整合控制，这些受体包括杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）、凝集素样受体（NKG2A-F）和天然细胞毒性受体（NKp30、NKp44和NKp46）。在没有炎症或感染的情况下，NK细胞主要接收抑制信号。当通过激活受体传递信号克服抑制作用时，NK细胞激活。此外，NK细胞可以被炎症细胞因子激活，如I型干扰素（IFN-α和IFN-β）和IL-12，这些通常是对病毒感染的反应⁵.

在效应器功能方面，NK细胞传统上根据CD56和CD16的表达被划分为不同的效应器亚群。CD56型^明亮的NK细胞约占外周血NK细胞群的10%，不表达CD16，被认为是细胞因子和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的主要产生者⁸TRAIL与靶细胞上的死亡受体DR4和DR5结合并诱导凋亡。更成熟的CD56^昏暗的NK细胞亚群占NK细胞总数的其余90%。这些细胞表达高水平的CD16，并通过穿孔素/颗粒酶发挥主要的细胞毒性效应功能。然而，当CD56dim NK细胞被发现在激活后的前2-4小时内产生大量细胞因子时，NK细胞在两个具有不同功能的主要亚群中的传统分裂受到了挑战^9,10.

在丙型肝炎病毒感染中，NK细胞表现出活化的表型，受体如NKG2C、NKp30、NKp 44、NK p46和CD122的表达增加^11–13与血液相比，肝脏中的激活增强，细胞毒性NK细胞效应器功能（由脱颗粒和TRAIL生成确定）与丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平（肝损伤的标志物）相关¹²在自发性乙型肝炎爆发中也观察到TRAIL生成增加，可能是由于内源性IFN-α¹⁴以及在以干扰素-α为基础的慢性丙型肝炎治疗期间¹⁵.

在目前的研究中，我们对慢性丙型肝炎干扰素治疗期间NK细胞表型和功能的变化进行了详细分析，并将结果与病毒学反应相关联。

材料和方法

结果

聚乙二醇干扰素/RBV治疗期间EVR患者NK细胞表型的变化

为了研究干扰素-α治疗对NK细胞的影响，我们前瞻性评估了接受PegIFN/RBV治疗的慢性HCV感染患者血液中该淋巴细胞亚群的表型和功能。为了描述NK细胞表型和功能的最佳变化，我们首先关注了22名安装EVR的患者。

对单个细胞（正向散射-高度与正向散射-面积）、淋巴细胞（正向散射与侧向散射）进行门控，并排除CD14+单核细胞、CD19+B细胞和EMA+死亡细胞，通过多色流式细胞术鉴定NK细胞为CD3-CD56+细胞(图1A). 如所示图1B在治疗的前2天，血淋巴细胞群中NK细胞的频率增加（6.79%±1.29%，0h平均±SEM，而48h后为9.81%±1.28%，P<0.01），并维持在该水平2周。与此同时，CD56也有所增加^明亮的(图1C)和CD56^昏暗的单元格(图1D). CD56型^明亮的从第2周（1.40±0.40%）到第12周（2.18±0.58%），细胞进一步增加，但CD56^昏暗的细胞没有。

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图1

PegIFN/RBV治疗期间NK细胞及其亚群的频率

（A） 选通策略。（B–D）CD56+CD3−NK细胞（B）及其CD56的频率^明亮的（C） 和CD56^昏暗的PegIFN/RBV治疗期间PBMC中的亚群（D）。显示平均值±SEM（n=22名患者）。h、 小时；周。（***）P<0.001，重复测量方差分析*P≤0.05，**P<0.01，配对Student t检验，比较指示的单个时间点与0小时时间点。

为了进行详细的NK表型分析，对PBMC进行染色，以检测活化和抑制NK细胞受体、活化标记物和趋化因子受体(补充图1).图2详细描述了治疗前12周内NK细胞群体的显著变化。例如，激活受体NKG2D的表达水平最早在治疗开始后24小时达到峰值（0小时时MFI为839±51；24小时后1080±68，P<0.001图2A)NKp30的表达水平在治疗至少12周前稳定增加（0 h时MFI为1567±171；12周时为2352±190，P<0.0001，图2B)这一观察结果在CD56中最为明显^昏暗的NK细胞群(补充图2B). NKp44和NKp46表达保持不变（未显示），2B4表达略微下调（0小时MFI为1019±48；第1周为919±35，P<0.01；未显示）并且NKG2C表达显著降低（0小时的MFI为76±14；第12周为49±7，P=0.0004，图2C).

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图2

PegIFN/RBV治疗中外周血NK细胞的表型

CD56+CD3−NK细胞上NKG2D（A）、NKp30（B）、NKG2C（C）、SIGLEC7（D）和CD69表达（E）的（A–E）MFI。（F） CD56+CD3−NK细胞群中CXCR3+细胞的频率。显示平均值±SEM（n=22名患者）。h、 小时；周。（***）P<0.001，重复测量方差分析*P≤0.05，***P<0.001，采用配对学生t检验，将指定的个人时间点与0小时时间点进行比较。

在抑制性受体组中，SIGLEC7的表达在治疗的前12周显著下降（0小时时MFI为1297±76；12周时为1018±47，P<0.0001，图2D)这种下降在CD56中最为明显^昏暗的人口(补充图2). NKG2A的表达在6 h时点略有降低（0 h时MFI为984±134，而6 h时为850±101，P=0.46），但在治疗12周时由于CD56的增加而升高（MFI为1344±156，P=0.007，未显示）^明亮的NK细胞(图1C). CD85j和CD300表达保持不变（数据未显示）。总的来说，这些数据表明NK细胞活性增加而抑制减少的趋势。与这一解释一致，激活标记CD69的表达在开始治疗后的24小时内在大量NK细胞群中显著增加(图2E)和CD56^明亮的和CD56^昏暗的子集(补充图2)在整个观察期内，表达量持续增加。

最后，我们分析了与肝脏淋巴细胞募集相关的趋化因子受体的表达。有趣的是，CXCR3+的频率(图2F)开始治疗后6小时，血液中的CCR5+NK细胞（未显示）显著减少（CXCR3+NK细胞0小时为11.4%±1.8%，24小时为7.7%±0.8%，P=0.034；CCR5+NK细胞在0小时为8.8%±0.8%，6小时为6.5%±0.6%；P=0.001），这可能表明趋化因子受体阳性NK细胞从血液中募集到感染部位。

PegIFN/RBV治疗使NK细胞功能极化，导致脱颗粒和TRAIL生成增加，但IFN-γ生成减少

NK细胞通过杀死感染细胞和产生抗病毒和免疫调节细胞因子（如IFN-γ）来调节抗病毒效果。为了评估治疗期间NK细胞细胞毒性的变化，我们用MHC阴性靶点K562培养PBMC，并通过在细胞表面染色CD107a来测量脱颗粒(补充图1). 治疗24小时内，CD107a+NK细胞的频率及其CD107a表达水平均显著增加（CD107a+NK细胞0小时时为12.5%±1.4%，24小时时为22.8%±2.2%；0小时时MFI为410±51，24小时为877±128；图3A)并维持至少4周。与这些结果一致，作为NK细胞毒性介质的TRAIL在体外的表达增加（TRAIL+NK细胞在0小时时为13.8%±2.1%，24小时时为24.1%±3.0%；MFI在0小时为163±23，24小时为245±33，图3B). 这两个CD56都观察到了^昏暗的和CD56^明亮的NK细胞（未显示）。

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图3

PegIFN/RBV治疗使NK细胞功能极化，导致脱颗粒和TRAIL生成增加，IFN-γ生成减少

（A–C）PegIFN/RBV治疗期间NK细胞CD107a（A）、TRAIL（B）和IFN-γ表达（C）的变化。NK细胞频率和MFI的平均值±SEM分别显示在21、20和22名患者中。统计分析：配对学生t检验，将指定的个人时间点与0小时小时进行比较；周*P≤0.05，**P<0.01，***P<0.001。

与NK细胞的细胞毒性相反，IFN-γ的产生在开始治疗后6小时即被抑制（0小时IFN-γ+NK细胞31.2%±3.9%，6小时17.7%±2.7%；0小时MFI为806±155，6小时511±81；图3C). 虽然24小时和48小时后，IFN-γ+NK细胞的频率及其平均IFN-γ表达水平略有恢复，但这两个参数至少需要12周才能达到预处理水平(图3C). 治疗第4周至第12周IFN-γ产生的恢复与CD56百分比的增加平行^明亮的细胞。

PegIFN/RBV治疗早期肝内细胞毒性NK细胞的增加

NK细胞的抗病毒功能在HCV复制的肝脏中发挥。因此，我们对患者的肝内NK细胞进行了横断面分析，这些患者在开始PegIFN/RBV治疗前（0 h）或6 h后随机接受肝活检。如左面板所示图4A与基线相比，开始治疗6 h后肝内CD16+NK细胞亚群（细胞毒性的主要介质）的大小增加。同样，表达TRAIL的NK细胞的百分比(图4A中间面板）和TRAIL表达水平（MFI）增加(图4A，右侧面板）。相反，治疗6小时后，T细胞上TRAIL的表达在肝脏和血液中仅略有增加（数据未显示）。

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图4

PegIFN/RBV治疗早期肝内NK细胞亚群的变化

（A） 在横断面分析中，CD16+NK细胞亚群的大小、表达TRAIL的NK细胞的百分比和TRAIL MFI，这些患者随机在开始PegIFN/RBV治疗之前（n=19）或之后（n=9）接受肝活检。线表示中间带。

（B） PegIFN/RBV治疗期间的相对血清ALT水平。统计分析：Wilcoxon配对检验将各个时间点与0 h进行比较。显示平均值±SEM；h、 小时；周，周。

总的来说，在治疗的前6小时内观察到的循环和肝内NK细胞的表型和功能变化与细胞毒性增加一致。作为肝细胞转换的临床相关性，我们测量了血清ALT水平。确实，血清ALT水平在最初24小时内略有增加（与0小时相比P=0.027），并在48小时达到峰值(图4B). 这些结果表明，肝细胞在治疗的前48小时内正在死亡。

PegIFN/RBV治疗期间NK细胞脱颗粒与病毒学反应相关

最后，我们研究了早期NK细胞应答和第一阶段治疗病毒学应答之间的可能关系，这是持续病毒学反应的预测¹⁸为此，我们纳入了一组对之前的PegIFN/RBV治疗和再治疗无反应的患者¹⁶在PegIFN/RBV再治疗的前2周内对NK细胞反应进行了研究(表1). 有趣的是，表达抑制标记NKG2A和SIGLEC7的NK细胞频率的早期降低与第一阶段病毒学反应相关(表2,补充图3). 沿着这条路线，在最初的24小时内诱导NK细胞脱颗粒(图5A左图）和48小时(图5A右图）也与第一阶段病毒学反应相关。CD56的这些观察结果更为明显^昏暗的NK子集(图5B)这是更成熟的细胞毒性NK细胞群。当分析仅限于CC IL28B rs12979860 SNP患者时，它们被保留下来，并且在IL28B RS12979860SNP基因型患者亚群中，NK细胞功能没有差异（未显示）。

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图5

外周血NK细胞脱颗粒与治疗反应相关

（A–B）所有血液NK细胞（A）或其CD56上CD107a表达的24小时和48小时变化之间的相关性^昏暗的亚群（B）和第一阶段病毒学反应（在PegIFN/RBV治疗的前48小时内HCV滴度的对数下降）。

（C） CD56上CD107a表达的比较^昏暗的有应答者（实心圆圈，n=10）和无应答者（开放圆圈，n=15）的NK细胞。显示平均值±SEM；h、 小时；周。通过方差分析计算p值。

表1

应答者和非应答者的流行病学和临床数据^*

	响应者 （n=10）	无应答者（n=15）
性别（男/女）	6/4	10/5
治疗开始时的年龄，中位数（IQR）年	54.5 (33–64)	53 (41–61)
种族（亚裔/非裔美国人/白种人）	2/4/4	0/2/13
体重指数中位数（IQR）	33.2 (21.2–40.4)	27.9 (22.3–31.9)
IL-28B rs12979860单核苷酸多态性（CC/CT/TT）	6/2/1	1/7/3
KIR基因型（2DL2/2DL3/2DL2、2DL2/2DT3、2DL3）	5/10/0/5	11/12/3/4
HLA基因型（C1/C2/C1C1/C2C2）	11/8/2/2	11/11/4/4
HCV基因型1/基因型4	9/1	15/0
治疗开始时的HCV RNA滴度，	2.8 × 106	2.3 × 106
中位数（IQR）IU/mL	(13,600-1.5 × 107)	(0.5 × 106−7.5 × 106)
治疗开始时的ALT水平，中位数（IQR）U/mL	79 (29–386)	58 (25–150)
Ishak炎症评分中位数（IQR）	6.5 (4–13)	7 (5–12)
Ishak纤维化评分中位数（IQR）	1 (0–3)	2 (0–6)

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^*如所示图5C

表2

NK细胞表型变化与第一期病毒学应答的相关性

第一阶段病毒学反应与NK细胞群中NKG2A或SIGLEC7表达NK细胞的频率及其各自表达水平（MFI）的相对变化相关。图如所示补充图3.

标记	时间点[h]	货币金融机构		NK细胞百分比
		皮尔逊r	P值	皮尔逊r	P值
NKG2A公司	6		不另说明。	−0.71	<0.001
	24		不另说明。	−0.42	0.031
	48		不另说明。	−0.41	0.049
SIGLEC7公司	6		不另说明。		不另说明。
	24	−0.47	0.026	−0.56	0.007
	48	−0.49	0.027	−0.34	0.011

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^*P（P）≤0.05;

^**P（P）<0.01;

^***P（P）<0.001;

n.s.：不重要

NK细胞功能变化与病毒学反应之间的联系促使我们比较了有应答者和无应答者在治疗前2周内NK细胞脱颗粒的动力学(图5C). 与NK细胞脱颗粒和第一阶段病毒学应答之间的相关性相一致，无应答者的NK细胞在治疗的前24小时内表现出NK细胞脱粒的显著增加量小于应答者(图5C). 值得注意的是，有应答者的NK细胞脱颗粒率持续增加至少两周，而无应答者组在第1周时恢复到基线水平（p<0.003）。当比较EVR患者和无EVR患者的NK细胞时，获得了类似的结果(补充图4). 总的来说，这些结果证明了NK细胞反应性，特别是NK细胞毒性标记物与治疗反应之间的相关性。

讨论

本研究证明了NK细胞反应性，特别是细胞毒性NK细胞功能的诱导与第一阶段（48小时）病毒学反应以及基于干扰素-α治疗的早期（12周）病毒理学反应之间的相关性。

NK细胞表型的峰值变化在开始治疗后6小时内最为明显。特别是，NKp30、NKG2C、SIGLEC7、CD85j和CD69的表达水平在治疗过程中发生了显著变化。相反，NKG2A和NKG2D表达的变化仅在干扰素注射后的前48小时内观察到，持续时间不到1周。一些观察结果将这些表型变化与观察到的NK细胞细胞毒性增加联系起来。例如，NKp30是一种天然细胞毒性受体，其表达与细胞毒性相关¹⁹NKp30水平在HCV感染者的NK细胞中高于感染者，这可能表明其具有抗病毒作用¹⁹同样，激活受体NKG2D的表达与NK细胞的细胞毒性直接相关，并且在HCV感染的肝脏中NKG2D配体上调²⁰最后，抑制性受体NKG2A表达的减少可能会间接增强细胞毒性NK细胞的功能，因为它减少了HLA-E应答的信号，HLA-E通过内源性加工的HCV核心肽稳定，在HCV感染细胞上过度表达^21,22.

细胞毒性NK细胞表型表现为脱颗粒增加、TRAIL表达NK细胞的频率增加以及TRAIL在NK细胞上的表达增加(图3). TRAIL是丙型肝炎的重要分子，因为HCV通过增加死亡受体DR4和DR5的表达，增强了原代人肝细胞对TRAIL介导的杀伤的敏感性²³在体外，NK细胞以TRAIL依赖的方式杀伤HCV感染的肝癌细胞也证明了这一点¹⁵在以干扰素为基础的丙型肝炎治疗期间，TRAIL的表达先前显示增加，但其峰值出现在晚期时间点，即该研究的第11-13周。此外，未对治疗诱导的NK细胞反应和病毒血症下降进行统计分析¹⁵.

在这里，我们有机会研究NK细胞的表型和功能，不仅在早期血液中，而且在肝脏中。我们观察到血液中细胞毒性增加，即脱颗粒和表达TRAIL的NK细胞，这在治疗开始24小时后最为明显(图3A和B). 肝内细胞毒性CD16+NK细胞亚群的大小显著增加，以及开始治疗6小时后肝内TRAIL表达NK细胞的百分比和MFI增加的趋势支持了这一观点(图4A). 肝脏中细胞毒性NK细胞的增加可能是由于肝旁NK细胞激活或外周血NK细胞募集所致。血液中CXCR3+和CCR5+NK细胞数量的减少支持了后一种情况(图2). 值得注意的是，NK细胞脱颗粒和TRAIL产生的峰值与治疗后24小时内丙氨酸氨基转移酶（ALT）的小幅度但显著升高相一致。虽然血清ALT水平被认为是肝损伤的弱相关因素，但应注意的是，早期对慢性丙型肝炎患者的研究已经描述了ALT水平和NK细胞活性之间的相关性^12,13,24.

根据我们早期关于NK细胞体外暴露于IFN-α的数据，观察到的NK细胞细胞毒性增加和IFN-γ生成减少也很有趣¹²最近的一份报告显示，慢性HCV感染患者的NK细胞产生的IFN-γ低于成功治疗的患者²⁵因此，IFN-α治疗似乎可以增强慢性HCV感染中已经建立的NK细胞表型^12,13暴露于IFN-α可能增加信号转导子和转录激活子（STAT）1的表达和磷酸化²⁶，导致NK细胞的细胞毒性增强，并降低STAT4磷酸化，导致IFN-γ生成减少。抑制IFN-γ产生的一种可能的补偿机制可能是观察到的NK细胞亚群比例向细胞因子产生CD56增加的转变^明亮的我们后来在治疗过程中观察到的NK细胞亚群，这与已发表的文献一致(图1C)^{15,22,25–27}.

这项研究还表明，导致病毒清除的免疫机制在自发和治疗诱导的感染消退之间存在差异。众所周知，在自然感染过程中，内源性I型干扰素反应不会诱导HCV清除（在^三). 自发清除HCV需要额外的免疫成分，例如产生IFN-γ的T细胞。这与T细胞的IFN-γ反应与HCV自发清除相关的已发表数据一致^三.

相反，治疗方案中使用的高剂量外源性I型干扰素具有较强的抗病毒作用。NK细胞可增强这种抗病毒作用和/或作为患者干扰素反应性的生物标志物，如早期诱导NK细胞毒性和第一阶段病毒学反应之间的相关性所示(图5). 虽然这种相关性相对较弱（24小时丙型肝炎病毒滴度下降的r=0.56，48小时丙型流感病毒滴度降低的r=0.48），但它是干扰素应答者和无应答者NK细胞细胞毒性差异的最早指标，并在随后的几周内保持不变(图5C). IFN-γ的产生似乎不那么重要，这与治疗反应与HCV特异性T细胞的IFN-γ反应增加无关的报道一致（综述于^三).

治疗反应也受遗传因素的影响。而治疗反应组图5IL28B患者比例较高12979860卢比CC SNP（66%）比无应答组（9%；p=0.016），不同IL28B基因型亚组的NK细胞表型和功能没有差异，当仅限于IL28B CC患者时，NK细胞应答与第一阶段病毒学应答之间的相关性保持不变12979860卢比SNP公司。这与淋巴细胞对III型干扰素（包括IL28B）没有反应的事实一致，因为它们表达受体的短剪接变异体²⁸第二个感兴趣的遗传成分是KIR/HLA复合单倍型(表1,补充表1)但我们发现患者亚组之间没有差异。干扰素治疗中KIR和IL28B的联合作用是可能的²⁹但需要对更多患者进行额外研究。

这些结果至少有两种解释。首先，血液中的NK细胞反应可作为干扰素反应性的生物标记物，并补充肝内生物标记物（如干扰素诱导基因的表达水平）。第二，值得注意的是，在以后的时间点，应答者和非应答者之间的NK细胞反应差异变得更加明显(图5C)这可能反映了第二阶段病毒下降的差异。因此，可以想象，在基于干扰素的治疗中，NK细胞很早就被激活，但NK细胞介导的HCV感染细胞清除可能需要更长的时间。需要进一步随访以评估这些早期NK细胞反应是否预示着持续的病毒学反应。如果NK细胞有助于病毒清除，则靶向增强NK细胞功能可能是补充抗病毒治疗的有益选择³⁰.

补充材料

致谢

缩写

脚注

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