肝病学。作者手稿；PMC 2013年1月1日提供。
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尼姆斯：NIHMS31998年
干扰素信号的早期变化定义了丙型肝炎的自然杀伤细胞反应和干扰素治疗的难治性
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比吉特·埃德利希
1马里兰州贝塞斯达DHHS国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所免疫科，邮编：20892
2马里兰州贝塞斯达DHHS国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所肝病分所，邮编：20892
戈洛·阿伦斯蒂尔
1马里兰州贝塞斯达DHHS国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所免疫科，邮编：20892
2马里兰州贝塞斯达DHHS国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所肝病分所，邮编：20892
Aintzane Zabaleta Azpiroz公司
1马里兰州贝塞斯达DHHS国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所免疫科，邮编：20892
2马里兰州贝塞斯达DHHS国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所肝病分所，邮编：20892
乔纳森·斯托尔茨福斯
1马里兰州贝塞斯达DHHS国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所免疫科，邮编：20892
2马里兰州贝塞斯达DHHS国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所肝病分所，邮编：20892
马森·努里丁
2马里兰州贝塞斯达DHHS国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所肝病分所，邮编：20892
埃利萨维特·塞尔蒂
1马里兰州贝塞斯达DHHS国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所免疫科，邮编：20892
2马里兰州贝塞斯达DHHS国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所肝病分所，邮编：20892
乔丹·J·费尔德
2马里兰州贝塞斯达DHHS国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所肝病分所，邮编：20892
T.杰克·梁
2马里兰州贝塞斯达DHHS国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所肝病分所，邮编：20892
Yaron Rotman公司
2马里兰州贝塞斯达DHHS国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所肝病分所，邮编：20892
芭芭拉·雷赫曼
1马里兰州贝塞斯达DHHS国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所免疫科，邮编：20892
2美国国立卫生研究院，美国糖尿病、消化和肾脏疾病研究所肝病科，DHHS，马里兰州贝塞斯达，20892
1马里兰州贝塞斯达DHHS国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所免疫科，邮编：20892
2美国国立卫生研究院，美国糖尿病、消化和肾脏疾病研究所肝病科，DHHS，马里兰州贝塞斯达，20892
联系方式：Barbara Rehermann博士，国立卫生研究院NIDDK肝病分院免疫学科，DHHS，10号楼中心大道10号，室。马里兰州贝塞斯达9B16，邮编：20892。电话：301-402-7144；传真：301-402-0491；vog.hin@nnamreheR *同等贡献。
- 补充资料
补充图S1。
GUID:E6A3AB5F-D6DC-4D83-B64B-F21EE3747F8A
补充图S2。
GUID:41BF84ED-9949-4442-8BFB-D954126AAB8E
补充图例。
GUID:FBE4B0A7-0D75-4711-B2CC-FEBC5BA3390A
摘要
自然杀伤（NK）细胞在慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染中表现出极化表型，细胞毒性增加，IFN-γ生成减少。在这里，我们询问这是否是由于I型干扰素（IFN）诱导NK细胞中信号转导子和转录激活子（STAT）分子的表达和磷酸化水平，以及它是否影响NK细胞对基于IFN-α的丙型肝炎治疗的反应和难治性。慢性HCV感染患者NK细胞中STAT1水平显著高于未感染对照组。STAT1水平和磷酸化STAT1（pSTAT1）的诱导在基于IFN-α的治疗中进一步增加，STAT1优先于STAT4磷酸化。pSTAT1的诱导与NK细胞毒性增加（TRAIL表达和脱颗粒）和IFN-γ生成减少相关。大于2 log患者的NK细胞10第一阶段HCV RNA下降到基于IFN-α的治疗（>99%IFN有效性）显示出强大的pSTAT1诱导体内对进一步的刺激没有反应在体外相反，来自小于2 log患者的NK细胞10第一阶段HCV RNA下降表现出较低的pSTAT1诱导体内（p=0.024）但仍保持较高的IFN-α反应性在体外（p=0.024）。在第二阶段病毒学应答期间，所有患者的NK细胞对IFN-α在体内和体外的刺激都变得难以耐受。
结论
这些数据表明，干扰素-α诱导的STAT1/4磷酸化的调节是NK细胞极化的基础，在HCV感染中，NK细胞的细胞毒性增加，IFN-γ生成减少，并且NK细胞反应性和难治性与基于干扰素的治疗的抗病毒效果相关。
关键词：干扰素、先天性、丙型肝炎病毒、治疗、自然杀伤
介绍
自然杀伤（NK）细胞是一种天然免疫细胞，以其对病毒感染细胞和肿瘤细胞的即时效应而闻名(1). 这些效应器功能包括通过穿孔素/颗粒酶介导的裂解或TNF-相关凋亡诱导配体（TRAIL）介导的凋亡破坏靶细胞，以及产生诸如TNF-α、MIP-1β和IFN-γ等细胞因子(1). 尤其是干扰素-γ引起了人们的极大兴趣，因为它大量产生，具有直接抗病毒活性，并通过促进启动CD4+和CD8+T细胞，以及通过诱导趋化因子向靶器官募集T细胞，在先天性免疫和适应性免疫之间建立联系(2).
传统上，不同的效应器功能与特定的NK细胞亚群有关，可以根据CD56的表达进行区分。外周血中约90%的NK细胞在其细胞表面表达低水平的CD56。这些CD56昏暗的NK细胞对病毒感染反应迅速，产生细胞毒性，并在数小时内产生趋化因子和细胞因子(三–5). 其余10%的NK细胞具有高水平的CD56表达（CD56明亮的)反应较慢，产生大量IFN-γ和TRAIL，而穿孔素/颗粒酶介导的细胞毒性很小。
我们和其他人最近发现，慢性HCV感染患者表现出极化的NK细胞表型，细胞毒性和TRAIL产生增加，IFN-γ产生减少(6–8). 如之前在淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒诱导的肝炎小鼠模型中所示，诱导细胞毒性和产生IFN-γ需要差异STAT1/4信号(9). 在该模型中，病毒诱导的I型干扰素导致STAT1表达增加，在干扰素-α/β受体下游的信号事件中与STAT4竞争(9). 结果是STAT1优先于STAT4磷酸化，增加NK细胞的细胞毒性并减少IFN-γ的产生(9,10). 有趣的是，宫城等人证明，与健康对照组相比，HCV感染患者的NK细胞中STAT1水平增加，并表明在体外IFN-α刺激导致STAT1优先于STAT4磷酸化(11). 然而，尚未证明干扰素信号的变化与HCV感染患者NK细胞功能的变化相关。此外体内人类NK细胞对IFN的反应性尚不清楚，可能对IFN-α的治疗应用非常重要，例如对慢性HCV感染的治疗。
为了解决这些问题，我们对慢性HCV感染和基于IFN-α治疗的前12周内NK细胞中STAT的表达和磷酸化进行了前瞻性分析。这个时间段定义了早期病毒学反应（EVR），它是最终治疗结果的预测(12). 在此期间STAT信号的变化与NK细胞效应器功能的变化相关。此外，该研究包括治疗前48小时的几个时间点，这使我们能够将干扰素诱导的NK细胞信号的变化与HCV滴度的第一阶段下降联系起来(13). 这一结果为研究病毒感染和干扰素期间NK细胞对干扰素的反应性和难治性机制提供了新的见解-一-基础治疗。
材料和方法
研究队列
对10名无HCV感染的健康受试者和35名未经治疗的慢性HCV感染患者的外周血NK细胞进行了研究。24名慢性HCV感染患者()在使用聚乙二醇干扰素（PegIFN）α-2a（180μg/周皮下注射）和基于重量的利巴韦林（RBV）治疗期间，对HCV基因型1和4的患者进行了前瞻性研究；HCV基因类型2和3的患者在治疗前4周和0小时，以及治疗后6、24和48小时，以及1、2、，治疗开始后4周和12周。在每周注射聚乙二醇干扰素之前，抽取第1周、第2周、第4周和第12周的样本。两名患者同意在第12周注射聚乙二醇干扰素6小时后再次抽血。根据NIDDK机构审查委员会批准的协议，所有受试者均出具了书面知情同意书，该协议符合1975年《赫尔辛基宣言》的道德准则。
表1
| 慢性HCV患者，未接受PegIFN/RBV治疗（n=35） | PegIFN/RBV治疗期间研究的慢性HCV患者（n=24） |
|---|
| 早期病毒学反应，n（%） | 不适用。一 | 23 (100%)b条 |
| 性别（男/女） | 20/15 | 16/8 |
| 治疗开始时的年龄中位数（IQRc（c）)年 | 49.0 (44–55) | 53.5 (50–55) |
| 种族（亚裔/非裔美国人/高加索人/西班牙裔） | 7/10/18/0 | 3/5/15/1 |
| 体重指数中位数（IQR） | 29.0 (23.7–34.1) | 28.9 (23.6–33.5) |
| IL-28B rs12979860单核苷酸多态性d日（CC/CT/TT） | 未注明日期。e（电子） | 13/6/3 |
| HCV基因型（1/2/3/4/6） | 19/5/5/4/1/未注明日期。 | 13/8/2/1 |
| 治疗开始时的血清HCV RNA滴度，平均值（±SEM）log10单位/毫升 | 6.04 (±0.11) | 6.30 (±0.15) |
| 治疗开始时的ALT水平，中位数（IQR）U/mL | 74 (44–88) | 80 (45–112) |
NK细胞分析
（i） IFN-α信号
直接评估STAT1、pSTAT1和pSTAT4的表达体内或之后在体外在37°C下，在没有或使用600 ng/mL一致序列IFN-α（IFN-αcon1；InterMune Inc.，加利福尼亚州布里斯班）的情况下，刺激预先加热的肝素化血液5分钟。在37°C下，用20倍过量的Lyse/Fix缓冲液（BD Biosciences，San Jose，CA）培养10分钟，固定细胞并溶解红细胞。离心后，用Perm Buffer（BD Biosciences）将细胞在冰上渗透20分钟，清洗两次，然后再悬浮在染色缓冲液（BD bioscience）中。
所有样本分别用抗CD56-PE（Beckman Coulter，Brea，CA）和抗CD20-PerCP/Cy5.5染色以鉴定NK细胞和B细胞，用抗CD3-FITC或抗CD3-APC染色以排除T细胞。此外，在室温下用抗STAT1-Alexa647、抗pSTAT1-Alexa488（评估Y701时的酪氨酸磷酸化）或抗pSTAT4-Alexa488，对细胞进行20分钟的染色，并在FacsDiva 6.1.3版（BD Biosciences）和FlowJo 8.8.2版（Tree Star，Ashland，or）的LSRII上进行分析软件。
（ii）脱粒
解冻的PBMC在37°C、5%CO下培养过夜2RPMI1640中含有10%胎牛血清（血清来源国际，北卡罗来纳州夏洛特）、1%青霉素/链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、10 mM HEPES（弗吉尼亚州马纳萨斯州塞尔格罗）。第二天，在K562细胞（ATCC，Manassas，VA）存在或不存在的情况下对PBMC进行计数和刺激，以评估脱颗粒情况，如所述(6)但缺乏额外的细胞因子。（iii）TRAIL表达：解冻的PBMC用单叠氮乙锭（EMA）、抗CD19-PeCy5（BD Biosciences，加利福尼亚州圣何塞）、抗CD14-PeCy 5（Serotec，北卡罗来纳州罗利）、抗-CD56-PeCy7、抗CD3-AlexaFluor700（BD bioscience）和抗TRAIL-PE（BD Biosciences）染色。
（iii）IFN-γ生产
将解冻的PBMC与IL-12（0.5 ng/ml；研发系统）和IL-15（20 ng/ml研发系统）一起或不与IL-12（0.5 ng/ml；研发系统）一起孵育14小时，然后加入布雷费尔丁A 4小时，并对IFN-γ进行细胞内染色，如前所述(6).
病毒动力学
使用Cobas TaqMan实时PCR（Roche Diagnostics，Palo Alto，CA）测量HCV RNA水平，检测下限为15 IU/mL。第一阶段病毒学反应定义为治疗前48小时HCV RNA滴度的对数下降。
基因分型
对IL28B的DNA样本进行基因分型12979860卢比TaqMan基因分型分析的多态性（加州福斯特市应用生物系统公司）。
统计分析
GraphPad Prism 5.0版（GraphPad-Software Inc，San Diego，CA）和JMP（SAS Inc，Cary，NC）用于执行（i）Mann-Whitney非参数双样本秩检验，以比较健康受试者和患者以及第一阶段反应强和弱患者的NK细胞，（ii）重复测量ANOVA，以评估治疗期间STAT1和pSTAT1表达的变化，（iii）Wilcoxon符号秩检验，以确定治疗期间从基线检查到时间点pSTAT1,pSTAT4水平以及pSTAT1/pSTAT4比率的变化，以及（iv）Spearman相关分析，研究pSTAT1信号转导与NK细胞功能的关系。双侧p值小于0.05被认为是显著的。
结果
丙型肝炎病毒感染期间NK细胞STAT1表达的增加在PegIFN/RBV治疗期间进一步增强
我们之前已经描述过，NK细胞在丙型肝炎病毒感染中被激活，但这种激活并不导致所有效应功能的同等刺激(6). 具体而言，慢性HCV感染患者的NK细胞表现出更强的细胞毒性，与未感染对照组相比，脱颗粒和TRAIL生成增加，IFN-γ生成减少(6). 我们证明这种表型可以通过在体外用干扰素-α刺激健康、未感染对照的NK细胞(6).
为了评估以干扰素-α为基础的慢性丙型肝炎治疗如何调节NK细胞表型和功能，我们首先研究了体内慢性HCV感染者外周血NK细胞STAT1水平()和健康控制。如所示HCV感染患者的NK细胞总数及其CD56明亮的和CD56昏暗的与健康对照组相比，各亚组STAT1水平升高。在T细胞中没有观察到STAT1表达的增加(补充图1A). 然后，我们前瞻性地跟踪了一组丙型肝炎病毒感染患者在基于干扰素的丙型肝炎治疗的前12周。所有患者都出现了早期病毒学反应（即血清HCV RNA水平至少为2 log10第12周时低于治疗前）。STAT1在NK细胞总数和CD56中的表达显著增加明亮的和CD56昏暗的治疗24小时内的亚群和STAT1水平在12周的研究期间进一步增加(所有人群p<0.0001）。在CD3+CD56-T细胞中观察到STAT1表达同样增加(补充图1B).
丙型肝炎病毒感染期间NK细胞中STAT1表达的增加通过PegIFN/RBV治疗进一步增强（A）体内STAT1在CD3-CD56+NK细胞及其CD56中的表达明亮的和CD56昏暗的HCV感染患者和健康未感染献血者的亚群。
（B–D）体内所有CD3-CD56+NK细胞（B）及其CD56的STAT1表达水平明亮的（C） 和CD56昏暗的（D） PegIFN/RBV治疗期间的亚群。14名接受PegIFN/RBV治疗的患者的平均值±SEM。h，h；周。***通过重复测量方差分析，P<0.001。
PegIFN/RBV治疗诱导NK细胞中STAT1优先于STAT4磷酸化
为了评估干扰素-α/β受体下游信号的变化，我们接下来研究了所有治疗时间点的STAT1和STAT4磷酸化。pSTAT1和pSTAT4表达的变化在治疗的前48小时内最大。体内pSTAT1水平在CD3-CD56+NK细胞和CD56细胞中达到峰值明亮的和CD56昏暗的治疗后6小时内的亚群（基线时MFI163±16，最大时205±20，分别为p=0.005、p=0.018和p=0.003，).
PegIFN/RBV治疗导致NK细胞中STAT1的磷酸化优先于STAT4（A–B）慢性丙型肝炎患者CD3-CD56+NK细胞总数及其CD56中pSTAT1（A）和pSTAT4（B）表达水平的最大变化明亮的（中间面板）和CD56昏暗的（右面板）PegIFN/RBV治疗开始前后的子集。（C） pSTAT1/pSTAT4比值（MFI）贯穿治疗的前48小时*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001（将显示的单个时间点与0h时间点进行比较）。
相比之下，pSTAT4在CD3-CD56+NK细胞群及其CD56中的水平下降明亮的和CD56昏暗的亚群对基于干扰素的治疗反应，在48小时时达到最小值（MFI分别为0小时183±10和48小时149±8，p=0.011，p=0.023和p=0.028，). 由于STAT1和STAT4信号分子都在IFN-α/β受体上竞争磷酸化(9)这些数据表明STAT1的表达增加()在基于干扰素的治疗中导致STAT1优先于STAT4的磷酸化(). 与这一解释一致，pSTAT1/pSTAT4比率在开始治疗6小时后达到峰值，CD56在48小时后仍保持增长昏暗的NK细胞亚群().
PegIFN/RBV诱导的STAT1磷酸化与NK细胞功能极化相关
在一项详细的前瞻性分析中，我们先前表明，干扰素-α强烈诱导NK细胞效应器功能(14). TRAIL表达测定NK细胞的细胞毒性(，左侧面板）和脱颗粒(左侧面板）分别在6h和24h达到峰值。相反，产生IFN-γ的NK细胞的频率在治疗开始后6小时达到最低值(，左图），并且在以后的时间点从未增加到高于预处理水平(14). 重要的是，TRAIL产生所证明的细胞毒性的增加与pSTAT1水平的增加直接相关（r=0.586，p=0.014，NK细胞脱颗粒率的增加趋势相同（r=0.453，p=0.078，，右侧面板）。相反，IFN-γ产生的变化与pSTAT1水平的增加呈负相关（r=0.549，p=0.015，，右侧面板）。这些结果支持了慢性丙型肝炎患者NK细胞功能极化是由IFN-α介导的解释，因为基于IFN-的治疗通过诱导pSTAT1进一步推动了这种功能二分法。
PegIFN/RBV诱导的NK细胞pSTAT1表达变化与NK细胞功能变化相关PegIFN/RBV治疗开始后，TRAIL生成（A，左图）、脱颗粒（B，左图，）和IFN-γ生成（C，左图：）的变化与pSTAT1表达水平从0h到6h的变化相关（A–C右图）。r： 斯皮尔曼相关系数。
长时间的PegIFN/RBV治疗导致NK细胞对在体外干扰素-α刺激
评估以干扰素为基础的治疗是否能最大限度地刺激NK细胞体内在治疗的第一周内，我们在许多时间点分离出PBMC，并将其置于在体外用IFN-α刺激并测定其pSTAT1水平。如所示在PegIFN/RBV治疗的最初6h后，体外诱导的pSTAT1水平下降，在Peg干扰素/RBV治疗的第一周后达到最低水平，并在接下来的11周内保持在较低水平（0小时的MFI为407±37；24小时的MFI:279±25；第12周的MFI:181±24，p=0.039）。当在体外pSTAT1的诱导性标准化为体内pSTAT1水平()或每个单独治疗时间点的总STAT1水平(补充图2). 这些结果表明，在PegIFN/RBV治疗期间（6小时到48小时之间），pSTAT1诱导达到最大值，NK细胞对进一步刺激仍不敏感。为了确保这些观察结果不是在最低点取样的结果，即在每周注射聚乙二醇干扰素之前，我们研究了两名患者在第一次注射后和第12周注射聚乙二醇后的情况。如所示,体内第一次注射聚乙二醇干扰素后6小时内，NK细胞中pSTAT1水平升高。然而，在注射第12周聚乙二醇干扰素后的6小时内未观察到增加。因此，长期暴露于干扰素-α似乎会使NK细胞在治疗过程中变得难治。
PegIFN/RBV治疗中NK细胞pSTAT1诱导的难治性（A） 治疗后CD3-CD56+NK细胞中pSTAT1的水平在体外IFN-α刺激（pSTAT1诱导）。
（B）体外在指定的PegIFN/RBV时间点相对于体内pSTAT1在同一时间点表达。诱导率计算为pSTAT1 MFI的折叠变化在体外在每个时间点用干扰素治疗。显示21名患者的平均值±SEM*通过重复测量方差分析，P 0.05，**P≤0.01。
（C）体内PegIFN/RBV治疗开始时（左侧面板）和12周（右侧面板）注射PegIFN后6小时NK细胞中的pSTAT1水平。h、 小时；周，周。
第一阶段病毒学应答较弱的患者体内未达到最大pSTAT1诱导
为了评估NK细胞反应性与治疗效果的潜在关联，我们测定了治疗前48小时外周血中HCV RNA的下降。这被定义为第一阶段病毒学反应并预测治疗结果(13). 因为HCV基因型1和4的慢性感染比HCV基因类型2和3的慢性感染需要更长的疗程(15)，我们将此分析局限于感染HCV基因型1和4的患者(). 如所示，具有强烈第一阶段病毒学应答（定义为在最初48小时内HCV RNA滴度降低超过2 log）的患者，表现出明显更大的增加体内前6小时NK细胞中pSTAT1的水平()和24小时()第一阶段病毒学反应弱的患者（减少不到2 log）。这与IL-28基因型（治疗结果的另一个决定因素）无关(16)因为两者都不是体内pSTAT1水平或在体外NK细胞中pSTAT1的诱导率与IL28B单核苷酸多态性相关12979860卢比是治疗反应性的独立因素。
pSTAT1表达与第一阶段病毒学应答的相关性（A） 折叠更改体内在PegIFN/RBV治疗的前6个小时，CD3-CD56+NK细胞在有（实线）和无（虚线）的个体患者中的pSTAT1表达大于2 log10HCV RNA滴度的第一阶段下降。
（B–C）折叠变化体内在PegIFN/RBV治疗的前6h（B）和24h（C）期间，单个患者CD3-CD56+NK细胞的pSTAT1表达大于2 log10HCV RNA滴度的第一阶段下降。
（D） pSTAT1诱导性的折叠变化在体外干扰素治疗标准化为体内单个患者（实线）和无实线（虚线）的PegIFN/RBV治疗开始前（0小时）或6小时后的水平大于2 log10HCV RNA滴度的第一阶段下降。
NK细胞中pSTAT1诱导性的（E–F）折叠变化在体外干扰素治疗标准化为体内单个患者在PegIFN/RBV治疗开始后（0h）或6h（E组）或24h（F组）前的水平，log大于或不大于210HCV RNA滴度的第一阶段下降。
表2
具有或不具有强第一阶段病毒学应答的患者的流行病学和临床数据。
| 大于2log的患者10HCV滴度下降48小时（n=4） | 小于2log的患者10HCV滴度下降48小时（n=10） |
|---|
| HCV滴度下降0h-48h，中位数log10（IQR一) | 2.59 (2.2– 2.9) | 1.15 (0.7–1.6) |
| 早期病毒学反应，n（%） | 4 (100%) | 9 (100%)c（c） |
| 性别（男/女） | 3/1 | 6/4 |
| 治疗开始时的年龄，中位数（IQR）年 | 57.5 (54.3–60.8) | 53.0 (47.3–55.5) |
| 种族（亚裔/非裔美国人/高加索人/西班牙裔） | 1/1/2/0 | 1/3/5/1 |
| 体重指数中位数（IQR） | 30.8 (22.9– 34.5) | 29 (25.6–35.9) |
| IL-28B rs12979860单核苷酸多态性b条（CC/CT/TT） | 3/0/0 | 4/4/2 |
| HCV基因型（1/4） | 4/0 | 7/1 |
| 治疗开始时的血清HCV RNA滴度，平均值（±SEM）log10单位/毫升 | 6.6 (±0.15) | 6.6 (±0.31) |
| 治疗开始时的ALT水平，中位数（IQR）U/mL | 61 (36– 98) | 83 (62–179) |
对于第一阶段病毒学反应较弱的患者，NK细胞的IFN反应性较低，有两种可能的解释。一种可能性是，他们的NK细胞对干扰素的反应水平是由基因决定的。另一种可能性是他们的NK细胞受到次优刺激体内为了区分这两种可能性，我们对有或无强烈第一阶段病毒学反应的患者进行PBMC进一步研究在体外IFN-α刺激。有趣的是，来自<2 log患者的NK细胞10第一阶段HCV RNA下降幅度较大在体外pSTAT1比来自具有更大第一阶段反应的患者的NK细胞的诱导性(). 这些结果表明，第一阶段病毒学反应弱的患者的NK细胞被次优刺激体内.
讨论
这项研究表明，干扰素-α诱导的STAT1磷酸化调控是体内NK细胞向细胞毒性增加和IFN-γ产生减少的方向极化。该结果与LCMV诱导小鼠IFN-α分泌增加NK细胞STAT1表达的观察结果一致，导致STAT1优先于STAT4磷酸化(6,9,11). 它还扩展了Miyagi等人关于HCV感染患者优先STAT1磷酸化的发现(11)因为我们表明IFN-α暴露体内导致pSTAT1水平升高，并与TRAIL生成和脱颗粒增加以及IFN-γ生成减少相关(). 我们的观察表明，NK细胞的应答性和难治性与基于IFN-α的治疗的第一阶段病毒学反应相关，这表明了NK细胞中IFN-α信号的临床相关性().
这种对NK细胞的分析与目前预测干扰素反应性和治疗结果的生物标记物的研究相关。使用NK细胞作为干扰素反应性生物标记物的优点是，它们很容易从外周血中获得，并且两者都可以体内和在体外通过检查pSTAT1水平，可以很容易地在一种基于标准化流式细胞术的简短分析中评估NK细胞的反应性。我们的系统与其他IFN反应性生物标记物相比如何？干扰素反应性的一个公认的生物标志物是干扰素刺激基因（ISG）的肝内表达。通常，ISG是HCV感染患者对IFN-α治疗反应不佳的预处理中表达最高的(17). 作为潜在的解释，有人提出内源性干扰素系统的高基线激活不允许在干扰素治疗期间进一步增加ISG，可能是因为ISG反应已经达到最大水平和/或诱导了抑制性自分泌反馈机制(18). 与这些ISG数据相比，我们没有发现任何证据表明预处理pSTAT1水平或在体外HCV感染患者的诱导性不同（数据未显示）。因此，pSTAT1诱导是对干扰素反应性的独立测量，可能是对ISG分析的补充。
NK细胞反应与治疗反应有何关联？由于我们研究中的所有患者在第12周时对PegIFN/RBV治疗均获得早期病毒学应答，因此我们无法在最终治疗结果的背景下评估NK细胞应答。另一方面，我们认为PegIFN/RBV治疗的后期时间点与我们的研究相关性较小，因为NK细胞在治疗的第一天内表现出与第一阶段病毒学反应平行的最大反应(–). 我们的数据清楚地表明，在首次注射PegIFN后的数小时内，NK细胞可以达到接近最大的活化，因为在体外在随后的治疗时间点，IFN-α的刺激显著减少(). 在这里，我们进行了一项有趣的观察，即HCV滴度第一阶段较弱的患者的NK细胞下降，这些患者的血清体内pSTAT1诱导比HCV滴度第一阶段下降强烈的患者，尽管如此，仍保持对在体外IFN-α刺激。因此，两组患者在体内对基于干扰素的治疗的反应性，但不是对干扰素-α的总体反应(). 这些结果表明，NK细胞的反应性在一定程度上取决于环境。一种解释是体内不同患者的干扰素水平和药代动力学不同。另一种可能的解释是，某些因素，如抑制性细胞因子，会干扰NK细胞对聚乙二醇干扰素治疗的反应性体内一旦NK细胞受到高剂量IFN-α的刺激，这些问题就会得到解决在体外然而，可以排除抑制因子的去除，因为在体外对全血进行NK细胞刺激。第三种可能性是遗传决定因素，如IL28B SNP12979860卢比(16)和KIR/HLA复合基因型(19)由于分析的患者队列规模较小，不能完全排除(,). 然而，如果12979860卢比单核苷酸多态性发挥了作用，它对NK细胞的影响是间接的，而不是直接的，因为NK细胞对在体外IFN-α刺激()因为它们对包括IL28B在内的III型干扰素没有直接反应(20). 因此，我们的研究打开了一个有趣的可能性：体内对基于干扰素-α的治疗的反应性可能会得到改善。
本研究的另一个相关结果是观察到NK细胞对在体外IFN-α刺激，在基于IFN-α的治疗的第一周内发生在所有患者身上，并在整个研究中保持(). NK细胞不仅对在体外干扰素-α刺激但表现出难治性体内如在第12周注射聚乙二醇干扰素之前和之后6小时同意抽血且没有增加的患者所示体内在此期间pSTAT1水平(). 这种对STAT1磷酸化的抵抗力显著，因为在NK细胞中STAT1水平持续增加，而pSTAT1浓度下降。至少有三种可能的解释：
首先，STAT1的半衰期比pSTAT1长，因为已证明STAT1对干扰素的反应持续了许多天，而pSTAT1水平因SHP1、SHP2和SOCS1依赖性负调控和酪氨酸磷酸酶介导的去磷酸化而降低。其次，累积的非磷酸化STAT1本身能够诱导ISG子集的表达，如2'5'OAS、Mx1和STAT1，从而形成pSTAT1独立的正反馈回路(21). 第三，STAT1也可以独立于通过NK细胞中的IFN-α/β受体进行的信号传导而被诱导，正如观察到STAT1缺陷小鼠的NK细胞比缺乏IFN受体的小鼠的NK细胞表现出更大程度的细胞毒性损伤和排斥移植瘤的能力(22).
总之，这些结果表明，持续暴露于高水平的IFN-α可能主导NK细胞的反应，以防止间接损伤。在急性丙型肝炎病毒感染中也可能存在类似的机制，已知该感染可诱导高水平的I型干扰素诱导基因，而在整个1-2个月的潜伏期内没有明显的肝损伤迹象(23). 因此，干扰素-α诱导的NK细胞不耐症可能导致急性HCV感染的临床无症状性，但其机制尚不清楚。
致谢
财务支持：本研究得到NIDDK、NIH内部研究项目的支持。
本研究得到NIDDK、NIH内部研究项目的支持。我们感谢NIDDK赵雄策博士的统计分析。
缩写
| 中高音 | 丙氨酸氨基转移酶 |
| EVR公司 | 早期病毒学反应 |
| 丙型肝炎病毒 | 丙型肝炎病毒 |
| 中国人民银行 | 外周血单个核细胞 |
| 美国公共广播电视公司 | 磷酸盐缓冲盐水 |
| 聚乙二醇干扰素 | 聚乙二醇化干扰素-α |
| RBV公司 | 利巴韦林 |
工具书类
1.Vivier E、Raulet DH、Moretta A、Caligiuri MA、Zitvogel L、Lanier LL、Yokoyama WM等。先天或适应性免疫？自然杀伤细胞的例子。科学。2011;331:44–49. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 2Billiau A，Matthys P.干扰素-γ：历史观点。细胞因子生长因子评论。2009;20:97–113.[公共医学][谷歌学者] 三。Fauriat C，Long EO，Ljunggren HG，Bryceson YT。通过靶细胞识别调节人类NK细胞细胞因子和趋化因子的产生。鲜血。2010;115:2167–2176. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4De Maria A、Bozzano F、Cantoni C、Moretta L.重新研究人类自然杀伤细胞亚群功能发现，细胞溶解性CD56（dim）CD16+NK细胞是大量IFN-γ激活的快速产生细胞。美国国家科学院院刊。2011;108:728–732. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Ahlenstiel G、Martin MP、Gao X、Carrington M、Rehermann B。不同的KIR/HLA复合基因型影响人类抗病毒自然杀伤细胞反应的动力学。临床投资杂志。2008;118:1017–1026. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Ahlenstiel G、Titerence RH、Koh C、Edlich B、Feld JJ、Rotman Y、Ghany MG等。在慢性丙型肝炎中，自然杀伤细胞以干扰素依赖性的方式向细胞毒性极化。胃肠病学。2010;138:325–335. e321-322。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Oliviero B、Varchetta S、Paudice E、Michelone G、Zaramella M、Mavilio D、De Filippi F等。慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎病毒感染中的自然杀伤细胞功能二分法。胃肠病学。2009;137:1151–1160. 1160 e1151–1157。[公共医学][谷歌学者] 8Stegmann KA、Bjorkstrom NK、Veber H、Ciesek S、Riese P、Wiegand J、Hadem J等。干扰素-α诱导的自然杀伤细胞TRAIL与丙型肝炎病毒感染的控制相关。胃肠病学。2010;138:1885–1897.[公共医学][谷歌学者] 9Miyagi T，Gil MP，Wang X，Louten J，Chu WM，Biron CA。通过STAT1诱导平衡高基础STAT4，以控制自然杀伤细胞中的1型干扰素效应。《实验医学杂志》。2007;204:2383–2396. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Nguyen KB、Cousens LP、Doughty LA、Pien GC、Durbin JE、Biron CA。干扰素α/β介导的抑制和促进干扰素γ：STAT1解决了一个悖论。自然免疫学。2000;1:70–76.[公共医学][谷歌学者] 11Miyagi T、Takehara T、Nishio K、Shimizu S、Kohga K、Li W、Tatsumi T等。慢性丙型肝炎病毒感染患者自然杀伤细胞中干扰素-α-唾液酸的改变。肝素杂志。2010;53:424–430.[公共医学][谷歌学者] 12Davis GL、Wong JB、McHutchison JG、Manns MP、Harvey J、Albrecht J。聚乙二醇干扰素α-2b联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎患者的早期病毒学反应。肝病学。2003;38:645–652.[公共医学][谷歌学者] 13Parruti G、Polilli E、Sozio F、Cento V、Pieri A、Di Masi F、Mercurio F等。聚乙二醇干扰素和利巴韦林开始治疗48小时后，通过评估RNA衰变，快速预测慢性HCV感染患者的持续病毒学反应。抗病毒研究。2010;88:124–127.[公共医学][谷歌学者] 14Ahlenstiel G、Edlich B、Hogdal LJ、Rotman Y、Noureddin M、Feld JJ、Holz LE等。自然杀伤细胞功能的早期变化表明对干扰素治疗丙型肝炎的病毒学反应。胃肠病学。2011 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Ghany MG、Strader DB、Thomas DL、Seeff LB。丙型肝炎的诊断、管理和治疗：最新进展。肝病学。2009;49:1335–1374. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Ge D、Felley J、Thompson AJ、Simon JS、Shianna KV、Urban TJ、Heinzen EL等。IL28B的遗传变异预测丙型肝炎治疗诱导的病毒清除。自然。2009;461:399–401.[公共医学][谷歌学者] 17He XS、Ji X、Hale MB、Cheung R、Ahmed A、Guo Y、Nolan GP等。干扰素的全球转录反应是丙型肝炎病毒治疗结果的决定因素，并受种族的影响。肝病学。2006;44:352–359.[公共医学][谷歌学者] 18Feld JJ、Nanda S、Huang Y、Chen W、Cam M、Pusek SN、Schweigler LM等。聚乙二醇干扰素和利巴韦林治疗期间的肝脏基因表达：确定治疗反应的分子途径。肝病学。2007;46:1548–1563. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Knapp S、Warshow U、Hegazy D、Brackenbury L、Guha IN、Fowell A、Little AM等。接触丙型肝炎病毒后杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL3和第1组人类白细胞抗原C的持续有益作用。肝病学。2010;51:1168–1175. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Witte K、Gruetz G、Volk HD、Looman AC、Asadullah K、Sterry W、Sabat R等。尽管IFN-lambda受体表达，但血液免疫细胞（而非角质形成细胞或黑素细胞）对III型干扰素的反应受损：这些细胞因子在治疗应用中的意义。基因免疫。2009;10:702–714.[公共医学][谷歌学者] 21Cheon H，Yang J，Stark GR.转录1和转录3的信号转导子和激活子作为细胞因子诱导蛋白的功能。干扰素细胞因子研究杂志。2011;31:33–40. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22.Lee CK、Rao DT、Gertner R、Gimeno R、Frey AB、Levy DE。干扰素和STAT1在NK细胞功能中的不同要求。免疫学杂志。2000;165:3571–3577.[公共医学][谷歌学者] 23.Shin EC、Seifert U、Kato T、Rice CM、Feinstone SM、Kloetzel PM、Rehermann B.病毒诱导的I型干扰素刺激感染部位产生免疫蛋白酶体。临床投资杂志。2006;116:3006–3014. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
