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自然。作者手稿；PMC 2012年9月29日发布。
以最终编辑形式发布为：
自然。2012年3月28日；483(7391): 570–575.
2012年3月28日在线发布。 数字对象标识：10.1038/自然11005
预防性维修识别码：项目经理3349233
EMSID:英国MS47188
PMID：22460902

肿瘤细胞药物敏感性基因组标记的系统鉴定

马修·加内特,1,* 埃琳娜·埃德尔曼,2,* 索尼娅·海顿,1,* 克里斯·格林曼,1,†‡ 阿纳希塔·达斯图,2 刘伟景（King Wai Lau）,1 帕特里夏·格雷宁格,2 I.理查德·汤普森,1 西罗,2 豪尔赫·索尔斯,1 刘庆松,三，4 弗朗西斯科·伊奥利奥,1,5 迪迪埃·苏尔德斯,6 李晨,2 兰迪·J·米兰诺,2 格雷厄姆·R·比格内尔,1 阿塔姆,2 传教士牒喜莲女士,1 杰西·史蒂文森,2 西德·巴索普,1 斯蒂芬·R·卢茨,2 菲奥娜·科杰拉,1 卡尔·劳伦斯,1 安妮·麦克拉伦·杜格拉斯,1 爪蟾,2 塔蒂亚娜·米罗连科,1 海伦·蒂,2 劳拉·理查森,1 周文军（Wenjun Zhou）,三，4 弗朗西斯·杰维特,1 Tinghu Zhang（张廷虎）,三，4 帕特里克·奥布莱恩,1 杰西卡·博伊斯弗特,2 斯泰西·普莱斯,1 Wooyoung Hur公司,三，4 杨万娟,1 邓显明,三，4 亚当·巴特勒,1 Hwan Geun Choi先生,三，4 张在元,三，4 何塞·巴塞尔加,2 伊万·斯塔门科维奇,7 杰弗里·恩格尔曼,2 Sreenath V.Sharma公司,2,§ 奥利维尔·特拉特,6 朱利奥·塞兹·罗德里格斯,5 纳撒尼尔·S·格雷,三，4 杰弗里·塞特曼,2 P.安德鲁·福特雷尔,1 丹尼尔·哈伯,2,8 迈克尔·斯特拉顿,1 斯里达尔·拉马斯瓦米,2 乌尔坦·麦克德莫特,1和西里尔·H·贝内斯2
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

抗癌治疗的临床反应通常仅限于一部分患者。在某些情况下，突变的癌症基因是对靶向药物反应的有效生物标志物。为了发现癌症治疗药物敏感性和耐药性的新生物标记物，我们筛选了数百个癌细胞株，这些癌细胞株代表了人类癌症的大部分组织类型和遗传多样性，其中130种药物正在进行临床和临床前研究。总的来说，我们发现突变的癌症基因与细胞对目前大多数可用的癌症药物的反应有关。经典的癌基因成瘾范式被额外的组织特异性或表达生物标记物所修改，一些经常突变的基因与对广泛治疗药物的敏感性相关。意外的关系被揭示出来，包括尤因肉瘤细胞对EWS-飞行1PARP抑制剂的基因易位。通过将药物活性与癌症基因组的功能复杂性联系起来，癌症细胞系中的系统药物基因组图谱为指导合理的癌症治疗策略提供了强大的生物标记物发现平台。

简介

有令人信服的证据表明，癌症基因组的改变会强烈影响患者对治疗产生反应的可能性。例如，使用药物选择性靶向BCR-ABL公司慢性粒细胞白血病（CML）的易位给该病的治疗带来了革命性的变化，治疗患者的5年生存率为90%1虽然针对特定患者亚群中的特定基因变化已取得成功，但在患者中经常观察到对适当选择的治疗的反应范围解释不清2,三此外，许多抗癌药物尚未与特定的基因组改变联系起来，这些基因组改变可作为生物标记物来指定其选择性治疗效果4随着药物管道产生新的化合物类别，在早期开发过程中识别预测性生物标记物的系统方法可能会对新抗癌药物开发的设计、成本和最终成功产生深远影响。

NCI60细胞系小组和相关药物筛选开创了使用癌症细胞系将药物敏感性与基因型数据联系起来的方法5,6癌细胞系随后被用于鉴定罕见的药物敏感性基因型，包括突变型EGFR、BRAF和EML4-确认高度预测临床反应2,三,7在这里，我们报告了大规模筛选人类癌症细胞系的结果，其中包括详细的基因组和基因表达分析，以系统地识别多种癌症药物的药物敏感性生物标记物。

结果

治疗性生物标志物的系统筛选

为了捕获癌症中的高度基因组多样性，并识别药物敏感性改变的罕见突变亚群，我们组装了639个人类肿瘤细胞系，代表了成人和儿童上皮性、间叶性和造血起源的常见和罕见癌症的谱线(图1a和补充数据1). 对细胞株进行64个常见突变癌症基因的全编码外显子测序，使用Affymetrix SNP6.0微阵列对拷贝数增加和减少进行全基因组分析，并使用Affmetrix HT-U133A微阵列对14500个基因进行表达谱分析。还研究了7个常见的重排癌症基因和微卫星不稳定性（MSI）的存在。筛选出的130种药物涵盖了癌症生物学中涉及的广泛靶点和过程(图1b和补充数据2). 他们包括两个目标特工(n个=114）和细胞毒性化疗(n个=13），包括临床实践中使用的批准药物(n个=31），正在进行临床试验研究的药物(n个=47）和实验工具化合物(n个=52). 为了深入了解药物之间的差异，我们纳入了针对合格靶点设计的多种药物(图1b). 药物治疗72小时对细胞活力的影响被用来推导药物敏感性的多参数描述，包括半最大抑制浓度（IC50)，以及剂量响应曲线的斜率(补充图1). 我们总共分析了48178个药物细胞系组合，每个药物筛选了275-507个细胞系（平均值=每个药物368个细胞系；补充数据2). 基于IC的化合物跨细胞系聚类50数值表明，具有重叠特异性的药物高度相关，支持数据集中观察到的生物效应的选择性(补充图3和补充表1和2).

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癌症细胞系的系统筛查可识别治疗性生物标志物

一，根据组织类型分类用于筛选的肿瘤衍生细胞系数量(n个=总计639）。b条，130种筛选药物组成的小组，根据其治疗靶点、主要效应途径和细胞功能进行分类。一种药物可能包括在多个类别中。插图显示了针对选定的原型癌症靶点筛选的药物数量。c（c），MANOVA结果的火山图表示，显示所有药物基因关联的大小（效应；x轴）和显著性（p值；倒y轴）。每个圆圈代表单个药物-基因相互作用，其大小与筛选的突变细胞系数量成正比（范围1-334）。水平虚线表示统计显著性阈值（0.2 FDR，P（P）< 0.0099). 插图I和II是选定的高度显著关联的放大视图，分别给出了药物名称、治疗相关靶点（上标）和癌症基因（括号内）。尼罗替尼的p值ABL公司(BCR-ABL公司),P（P）= 2.54 × 10−65和nutlin-3aMDM2型(TP53型),P（P）= 2.78 × 10−37，已封顶为1×10−28在此表示中。

来自特定组织的肿瘤通常有一组共同的体细胞突变。为了深入了解这与药物敏感性的关系，我们进行了一项基于IC的分析，以确定癌症组织类型和药物敏感性之间的关系50值。正如预期的那样，在某些情况下，肿瘤类型特异性敏感性可能由癌症基因突变的流行率来解释（例如，乳腺癌对PI3Kinase通路抑制剂的敏感性，PI3Kinse通路在该肿瘤类型中通常发生改变；补充数据3和4). 然而，在其他情况下，我们目前对癌症基因组的理解无法解释所观察到的关联。例如，肾细胞癌（RCC）细胞对五种SRC抑制剂（例如AZD0530、，P（P）< 1 × 10−4,n个=9个碾压混凝土和294个非碾压混凝土）8将胶质瘤细胞转化为ROCK抑制剂（GSK269962A，P（P）< 1 × 10−6,n个=23胶质瘤和非胶质瘤266）9该分析还确定了临床上已经使用的具有不完全理解的分子基础的治疗相关性，例如骨髓瘤细胞对来那度胺的敏感性(P（P）< 1 × 10−5,n个=3骨髓瘤和非骨髓瘤455）10然而，对于大多数药物来说，敏感细胞系分散在多种癌症类型中。

癌症基因突变是药物反应的生物标志物

单基因突变越来越多地被用作肿瘤治疗最佳应用的临床生物标志物。为了确定单个突变癌症基因与整个细胞系的药物敏感性之间的关联，我们使用了包含IC的多元方差分析（MANOVA）50剂量反应曲线的斜率。该分析揭示了大量的个体基因与药物的关联，其中一个子集（448/9039，5%）具有高度显著性，本文对此进行了讨论(图1c和补充数据5). 有趣的是，所分析的大多数癌症基因，包括那些被测药物的未知直接靶点，与我们小组中至少一种药物的敏感性或耐药性相关（65/69，94%）(补充图4). 同样，对大多数测试药物的敏感性与至少一个癌症基因的突变有关（118/130，91%）。因此，多种癌症基因突变被认为是多种抗癌药物敏感性或耐药性的标志物，这表明基因组生物标志物可以告知许多抗癌药物的治疗选择性。

与药物敏感性最明显相关的突变癌基因是相关药物的直接靶点癌基因。例如BCR-ABL公司重排使其对多种ABL抑制剂（例如。P（P）= 2.54 × 10−65尼罗替尼，图1c和补充图5)1，其中一些被批准用于CML治疗。同样，BRAF公司突变与BRAF和MEK1/2抑制剂的敏感性有关（例如。P（P）= 1.25 × 10−24对于PLX4720，图1c和图2a、b和c)三包括Vemurafenib的结构类似物，在临床试验中延长了BRAF公司突变阳性的黑色素瘤患者。此外，ERBB2号机组（HER2）扩增与EGFR-家族抑制剂（包括拉帕替尼）的敏感性相关(P（P）< 1 × 10−7,图2d)11获得HER2阳性乳腺癌治疗许可。我们还能够检测到EGFR、FLT3、和PIK3CA公司针对这些基因产物的突变和药物(补充数据5)12,13一些关联是由小部分异常细胞系中的显著反应驱动的。例如，两个FGFR2型-突变细胞系对FGFR抑制剂PD-173074极为敏感(图2e;P（P）< 1 × 10−5)14,15，证实了需要大量细胞系来捕获低频药物致敏基因型。

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药物敏感性和耐药性的生物标志物

一，与药物敏感性相关的基因特异性火山图BRAF公司癌细胞系的突变(n个= 54).b-k公司、细胞系IC的散点图50来自选定药物基因关联的（uM）值。集成电路50值是在对数尺度上比较突变或非突变（WT）细胞系。每个圆代表IC50红条是几何平均值。药物名称显示在每个图的上方，治疗药物靶点括在括号内。

我们还发现了抑癌基因失活突变与几种药物之间的关联，在某些情况下，这为了解抑癌药物与细胞机制在介导药物敏感性方面的相互作用提供了线索。例如TP53型是细胞应激反应中细胞凋亡和细胞周期阻滞的重要调节器，对Nutlin-3a产生抵抗(P（P）< 1 × 10−36)，一种MDM2 E3-ligase的抑制剂，负调节p53蛋白水平(图2f)16类似地RB1型是正常细胞中细胞周期进程的关键阻遏物，对PD-0332991产生耐药性(P（P）< 1 × 10−10)是上游细胞周期素依赖激酶（CDKs）4和6的抑制剂，通过磷酸化抑制pRb来驱动细胞周期进程(图2g)17相反CDKN2A型编码CDK抑制蛋白p16，与PD-0332991敏感性相关(P（P）< 1 × 10−11;补充数据5)17，大概是因为CDKN2A型突变细胞对通过CDK4/6-pRb信号通路进行信号传递的需求增强。

在其他情况下，基因组关联似乎与特定组织类型的突变富集有关。协会布拉夫和国家可再生能源管理局甲磺酸奥巴曲松是一种靶向BCL2家族抗凋亡蛋白（BCL2、BCL-XL和MCL1）的促凋亡药物，对其敏感的突变可能是由于黑色素瘤中这些突变的富集所致，因为黑色素瘤细胞系的药物敏感性与这些突变的存在或不存在无关(补充图6). obatoclax的组织特异性作用可能与黑色素瘤生存介质MCL1的抑制有关18由于黑素瘤细胞对ABT-263（另一种不靶向MCL1的BCL-2抑制剂）的敏感性与布拉夫或国家可再生能源管理局突变。此外，ABT-263不敏感的黑色素瘤细胞系可以通过siRNA介导的MCL1缺失对该药物敏感(补充图7).

我们小组中13种临床批准的细胞毒性化疗药物的基因组关联性通常不如靶向药物显著，这表明单基因生物标记物对于这类在许多癌症中具有广泛作用的药物的信息量可能较少(补充图8和9). 有趣的是，我们没有发现靶向或细胞毒性药物敏感性模式与TP53型可能是p53的功能失活，通过突变或消除调节其活性的信号通路，几乎是癌细胞系的普遍特征，因此未观察到突变和非突变细胞系之间的药物敏感性差异19.

根据我们目前对信号通路的了解，还发现了其他一些新的基因药物关联，这些关联无法轻易解释，可能反映出未被认可的生物学关系。的突变槽口1与ABT-263敏感性相关(P（P）<1 × 10−9;图2h,补充图10)可能是由于BCL2家族成员在槽口1突变细胞系(补充图11). 放大CCND1号机组（CyclinD1）或损失座椅模块组件4与多种EGFR-家族抑制剂（包括拉帕替尼和BIBW2992）的敏感性相关；和用于SMAD4型这与升高表皮生长因子受体基因表达(图2i和补充图12). 停用STK11型(LKB1号机组;P（P）<0.01），被认为可以缓解mTOR的抑制，与对HSP90抑制剂17-AAG的敏感性相关。此外FBXW7型与组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂MS-275的敏感性相关(P（P）< 1 × 10−5;图2j)、和TET2测试WEE1/CHK1抑制剂681640敏感性损失(P（P）< 1 × 10−4;图2k). 这些协会，以及这里介绍的其他协会(补充数据5)，代表了药物敏感性的候选生物标志物，并可能最终用于癌症靶向治疗的部署。

药物敏感性的复杂基因组相关性

在大多数情况下，癌细胞对药物的敏感性可能取决于基因组和表观基因组变量的多样性。事实上，单基因药物关联很少能够解释在细胞系中观察到的任何给定药物的药物敏感性范围(图2). 因此，我们应用了弹性网（EN）回归20，一种惩罚线性建模技术，用于识别基因组中多个基因和转录物之间的合作相互作用，并定义每种药物的反应特征。EN确定26938个特征药物协会(补充数据6)其中，与69种不同药物相对应的534种关联具有高度显著性（定义为-2.95>效应（e）>2.79和频率(（f）) > 0.76;图3a和补充图13和补充数据7).

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药物反应的多特征基因组特征

一绘制了EN确定的主要药物特征关联的频率和影响大小。关联颜色为黑色表示表达特征，红色表示突变，蓝色表示拷贝数，绿色表示组织。b-c。与响应相关的高度重要EN特征的热图b条达沙替尼（SRC、ABL抑制剂）和c（c），17-AAG（HSP90抑制剂）用于14个最敏感（紫色）和耐药（黄色）细胞系。对于每个细胞系，突变特征位于热图的顶部，以黑色（存在）或灰色（不存在）显示，然后是表达特征（蓝色表示低表达，红色表示高表达）。每个功能的左侧都有一个指示效果大小绝对值的条。紫色条表示负面影响，表示与敏感性相关的特征；黄色条表示正面影响，表示阻力相关的特征。自然对数IC50值在底部表示。为清楚起见，仅显示了与17-AAG敏感性和耐受性相关的前4个特征。

在许多情况下，转录特征显示与药物敏感性的相关性等于或强于基因突变的敏感性(图3a和补充表3). 例如，虽然对EGFR/ERBB2抑制剂拉帕替尼的敏感性与ERBB2号机组表达和突变，这种药物的最强相关性实际上是基质金属蛋白酶的表达基质金属蛋白酶28（e=−29.28，（f）=1) (图3a). 值得注意的是，对于大多数药物，包括那些与癌症基因突变有明确联系的药物，EN建模确定了药物敏感性的多特征特征。例如，与BRAF公司突变、对RAF或MEK1/2抑制剂的敏感性与67个特征反复相关。这些特征包括喷雾器2和DUSP4/6号机组，是MAP激酶信号传导的已知调节因子(补充图14)21,22有趣的是，作为MEK抑制剂AZD6244敏感性标记的8个基因的表达与该药物敏感性的18个基因特征显著重叠（重叠显著性超几何检验：P（P）=3×10−9)23在某些情况下，EN建模确定了与敏感癌细胞系的不同亚群相对应的生物标志物的复杂模式。因此，对达沙替尼（一种包括ABL和SRC在内的多种激酶抑制剂）的敏感性与两者相关BCR-ABL公司易位和在缺乏基因融合的敏感细胞系中表达的多基因转录特征(图3b).

EN建模还确定了药物敏感性的转录相关性，而没有已知的致敏突变事件。这包括LAG3的表达，它与SGK抑制剂GSK-650394的敏感性相关（e=−29.9，（f）=1）和NADPH脱氢酶家族成员表达之间的相关性NQO1号机组对HSP90抑制剂17-AAG敏感（e=−22.21，（f）=1,图3c). 与这些发现相一致的是，NQO1先前被证明将17-AAG代谢为更有效的HSP90抑制剂24.

少数特征与不同类别药物敏感性的改变反复相关，表明它们可能通过药物外排（例如。澳大利亚广播公司1;补充数据6). 为了进一步了解该数据集，我们将EN药物特征映射到药物靶点(补充数据7)以及457个已知癌症基因(http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census网站/;补充数据8). 总之，这些观察结果表明，在许多情况下，多特征基因组特征结合与突变、组织谱系、细胞分化状态和细胞通路相关的标记，有可能扩大和完善我们目前对药物敏感性的理解。

EWS-FLI1是PARP抑制剂敏感性的生物标志物

我们发现EWS-飞行1尤因肉瘤肿瘤的特征性重排和对奥拉帕林（AZD2281）的敏感性，奥拉帕利是多聚腺苷核糖聚合酶（PARP）的抑制剂(P（P）= 1.03 × 10−26,图1c和​和4a）。4a类). 在一大组细胞系中筛选结构独特的PARP抑制剂AG-014699，证实了尤因肉瘤细胞系的敏感性（几何平均IC50对于EWS-飞行1=4.7 uM，野生型为64 uM，P（P）<0.0001 Mann-Whitney试验，n个=291个细胞系；图4a,补充图15和补充数据9). 尤因肉瘤细胞对奥拉帕林更敏感(P（P）= 2.84 × 10−11)比其他肿瘤类型的细胞，包括骨骼和软组织肉瘤(补充图15和补充数据3). PARP抑制剂在巴西1/2由于这些肿瘤中存在同源重组缺陷而导致的突变癌及其对这些抑制剂靶向的替代性DNA损伤修复途径的依赖25使用6天存活率测定和集落形成实验对一组细胞系中的奥拉帕布和AG-014699敏感性进行比较，证实了尤因肉瘤对PARP抑制剂的显著敏感性，该效果与BRCA缺乏细胞中观察到的效果相当(图4b和c、和补充图16和17)26此外，与对照细胞相比，奥拉帕林治疗选择性诱导尤因肉瘤细胞凋亡(图4d). 与尤因肉瘤不同，我们没有观察到巴西1/23天筛选格式中的突变和对PARP抑制剂的敏感性，这可能是因为需要在这些细胞中进行几轮分裂以积累DNA损伤的毒性水平。

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尤因肉瘤细胞系对PARP抑制敏感

一、IC50WT值和EWS-飞行1olaparib和AG-014699融合阳性细胞系。b条，持续用药6天后对奥拉帕林的剂量反应曲线。细胞系按组织亚型分类。c（c）在一定浓度范围内（0.1、0.32、1、3.2或10 uM）进行7-21天的菌落形成分析，并显示每个细胞系的菌落数减少>90%的浓度。d日，Olaparib在72小时治疗后诱导尤因肉瘤细胞系凋亡。e（电子），对奥拉帕尼的敏感性EWS-飞行1和熔断器转化的小鼠间充质细胞与SK-N-MC细胞系（含有EWS-飞行1融合）。（f），瞬时转染有（siEF1）和没有（siCT）EWS-FLI1特异性siRNA的A673细胞对olaparib的敏感性。除b条为清晰起见，删除了误差条。

为了评估对PARP抑制剂的敏感性是由于EWS-FLI1重排的存在，还是由产生尤因肉瘤的间充质前体细胞类型所固有，我们比较了用EWS-FLI1或相关脂肪肉瘤相关易位FUS-CHOP转化的小鼠间充质细胞对奥拉帕林的敏感性27,28EWS-FLI1转化细胞的敏感性与人类尤因肉瘤细胞相当，而FUS-CHOP转化细胞相对耐药(图4e和补充图18). 此外，在NIH3T3细胞中EWS-FLI1的表达增加了对奥拉帕林的敏感性(补充图19)，而奥拉帕尼的敏感性通过短暂消耗尤因肉瘤细胞中的EWS-FLI1而部分恢复(图4f和补充图20). 即使仅考虑非尤因肉瘤细胞系，较高的FLI1表达也与奥拉帕尼的敏感性相关（IC之间的r=−0.3250和FLI1表达，n个＝413，P（P）= 1.68 × 10−11)表明尤因肉瘤株对奥拉帕林的敏感性可能与EWS-FLI1转录活性有关。

中的突变巴西航空公司1或巴西航空公司2在这些尤因肉瘤细胞系中不存在(补充数据1)，我们没有发现证据表明尤因肉瘤细胞的DNA损伤反应有缺陷（数据未显示）。然而，由于目前尚不清楚的原因EWS-飞行1易位与细胞毒性药物的敏感性有关，包括喜树碱等DNA损伤剂(P（P）< 1 × 10−5)，顺铂(P（P）< 1 × 10−4)和丝裂霉素C(P（P）< 0.001)(补充图21和22). 结合表达ETS基因融合的前列腺癌细胞系TMPRSS2-ERG对奥拉帕林敏感性的报告29，我们的数据支持ETS基因融合作为PARP抑制剂敏感性生物标记物的潜在用途。然而，值得注意的是，与前列腺癌的疗效不同，我们观察到单独使用奥拉帕林治疗尤因肉瘤细胞会导致细胞死亡。这些观察结果增加了PARP抑制剂在治疗尤因肉瘤（一种儿童和年轻人肿瘤）中有用的可能性，对于转移性疾病或化疗后复发的患者，五年生存率为15%30.

讨论

高通量肿瘤细胞系药物敏感性模式筛选提供了一种策略，以确定适当的癌症亚型和生物标记物，从而指导正在开发的多种新化合物的早期临床试验。该方法的有效性得到了其对临床上已经建立的药物基因型关联的有效识别的支持，并为新的治疗性生物标记物的临床测试奠定了基础，例如药物与药物之间的关联EWS-飞行1尤因肉瘤细胞的易位和对PARP抑制剂的敏感性。本报告随附的数据发布，以及来自未来筛查的正在进行的公共网络资源（癌症药物敏感性基因组学；网址：www.cancerRxgene.org)，有望加强其他癌症预测生物标记物的发现和验证。

虽然筛选出的大量细胞系有助于表征罕见的癌症基因型，并减轻了单个样本的影响，但此处提供的数据集受到可用基因型数量以及当前可用药物所检测目标数量的限制。尽管使用在二维培养中生长的肿瘤衍生细胞系具有明显的效用，但在某些情况下，更好地模拟肿瘤环境的实验模型可能会进一步提高我们对药物敏感性的理解，并提供更多的见解。尽管如此，我们可以在广泛的不同癌症类型和基因组背景中辨别出药物敏感性模式的初步情况。

由于靶向通路中的特定基因异常，对药物极为敏感的“异常值”的识别仍然是靶向癌症治疗最引人注目的愿景。BCR-ABL公司正CML，BRAF公司突变黑色素瘤和表皮生长因子受体突变阳性肺癌和靶向这些基因的蛋白质产物的药物现在已经成为公认的关联。PARP抑制剂敏感性的观察EWS-飞行1阳性的尤因肉瘤细胞系表明，随着新的化学和基因组空间的探索，有可能出现新的强效基因-药物关联。即使在没有“离群”效应的情况下，药物基因组分析也揭示了丰富的生物标记物，这些生物标记物可能被证明对患者分层有用。尽管还需要进一步的工作来评估其潜在的临床效用，但在某些情况下，这些生物标志物可能有助于解释临床反应的异质性，即使在预选的患者群体中也是如此。

这项工作以及附带的报告31，提供了人类癌症细胞株对目前正在使用或正在开发的多种癌症药物敏感性的基因组学的系统和广泛观点。这幅图展现了一个复杂的生物因素网络，这些生物因素影响着大多数抗癌药物的敏感性。这突出了为靶向治疗确定预选患者群体的挑战，以及通过确定更多预测性生物标记物来改进现有治疗和确定新治疗途径的机会。

方法总结

在测量相对于对照组的细胞数之前，用9种浓度（2倍稀释）的药物处理细胞72小时。MANOVA用于检查药物IC50斜率值与组织类型、64个癌基因的突变状态（包括基因扩增和纯合缺失）、重排和MSI有关。弹性网络使用了与MANOVA相同的基因组数据集，并结合了总共426个癌症基因、转录谱和组织类型的额外拷贝数数据，以确定与细胞系IC测量的药物反应相关的特征50.

补充材料

1

单击此处查看。（50K，pdf）

2

单击此处查看。（11M，pdf）

三

单击此处查看。（14M，xlsx）

致谢

我们感谢斯克里普斯研究所的菲利普·洛·格拉索提供抑制剂JNK9L。这项工作得到了威康信托基金（086357；M.R.S，P.a.F，J.S.，D.a.H.）的资助，以及国家卫生研究所（P41GM079575-02；N.S.G和1U54HG006097-01；N.S.G.，D.a.H）的资助。S.R.得到了霍华德·休斯医学研究所颁发的医师-科学家早期职业奖的支持。U.M由英国癌症研究临床科学家奖学金资助。

附录

方法

细胞系

所有细胞系均来自商业供应商。细胞生长在添加了5%FBS和青霉素/链霉亲和素的RPMI或DMEM/F12培养基中，并在5%CO2的湿化环境中保持在37°C。细胞系在这两种培养基中繁殖，以尽量减少不同培养基对我们的分析中治疗性化合物敏感性的潜在影响，并促进高通量筛选。为了排除交叉污染或同义品系，对每个细胞系（加州圣地亚哥Sequenom）的92个SNP进行了分析，并计算了成对比较得分。此外，我们进行了短串联重复序列（STR）分析（AmpFlSTR Identifiler，Applied Biosystems，Carlsbad，CA），并将其与提供的存储库生成的现有STR配置文件进行了匹配。有关筛选的细胞系的更多信息，包括其SNP和STR图谱，请访问癌症药物敏感性基因组学网站(网址：www.cancerRxgene.org).

筛选药物

化合物来自学术合作者或商业供应商。我们提供了每种化合物的完整描述，包括其名称、来源、PubChem和/或CHEMBL ID、筛选浓度以及治疗相关的分子靶点(补充数据2). 化合物以10 mM等分样品的形式在−80°C下储存，最多经历5次冻融循环。为每种化合物选择的浓度范围基于在体外抑制相关激酶活性和细胞活力的浓度数据。

细胞活力测定

细胞接种在96孔或384孔微孔板中，培养基中添加5%的FBS和青霉素/链霉亲和素。确定每个细胞系的最佳细胞数，以确保每个细胞在试验结束时都处于生长期（约70%汇合）。贴壁细胞系在治疗前一天用液体处理机器人对每种化合物进行9点2倍稀释，然后在72小时的时间点进行分析。将细胞在4%甲醛中固定30分钟，然后用1μM荧光核酸染色剂Syto60（Invitrogen）染色1小时。悬浮细胞系在电镀后立即用化合物处理，培养72小时，然后用在无谷胱甘肽培养基中制备的55μg/ml Resazurin（Sigma）染色4小时。在Syto60和Resazurin的激发和发射波长分别为630/695nM和535/595nM时，使用荧光板阅读器定量荧光信号强度。对所有筛选板进行严格的质量控制措施，并计算所有筛选板的阴性和阳性对照孔的Z因子得分（中位数=0.70，上四分位数=0.86，下四分位数=0.47，n=4857个板）。使用匹配的细胞系收集在两个地点进行药物筛选（药物筛选地点和每个IC的平板格式50在中进行了描述补充数据2和10). 作为对照，喜树碱（药物ID 1003和195）在两个地点进行了筛选。IC50s高度相关（r2=0.3244，斜率=1.030，n个=252个细胞株），这些药物是我们药物聚类分析中最近的邻居(补充表1). 根据制造商的说明，使用细胞滴定蓝（Promega）在96个平板上使用3倍稀释系列的奥拉帕林进行6天分析期间的细胞活力测量。根据制造商的说明，A673和NIH3T3细胞也暴露于奥拉帕林的3倍稀释系列中，并在药物暴露72小时后使用cell Titer 96水溶液细胞（Promega）测量细胞活力。按照制造商的说明，使用载脂蛋白-ONE半胱天冬酶分析（Promega）进行细胞凋亡测量。用allstars非靶向siRNA对照（Qiagen；siCT）或靶向EWS-FLI1融合蛋白的siRNA瞬时转染A673尤因肉瘤细胞系32（siEF1，5′-GGC AGC AGA ACC CUU ACG）和olaparib在siRNA-转染后立即治疗。使用以下siRNA序列瞬时敲除HT-144和A549细胞中的MCL1：寡核苷酸1，5′-CTG GTT TGG CAT ATC TAA TAA；寡核苷酸2，5′-CCC GCC GAA TTC ATT AAT TTA；寡核苷酸3，5′-AAG GGT TAG GAC CAA CTA CAA；寡核苷酸4，5′-CCC TAG CAA CCT AGC CAG AAA）和对照组进行模拟转染。

菌落形成分析

以低密度将细胞接种到35 mm细胞培养板中，第二天用指定的药物浓度或载体对照（DMSO）处理。每3-4天更换培养基并重新加固细胞。当足够的菌落可见时，通常在7-21天后，细胞在PBS中清洗一次，然后在冰镇甲醇中固定30分钟，同时摇晃。抽吸甲醇，摇晃时以1:20的稀释度加入Giemsa染色剂过夜。第二天，用蒸馏水冲洗细胞并进行空气干燥。

癌症细胞系的基因组和转录特征

在我们的人类癌症细胞系小组中，共有64个最常见突变的癌症基因通过毛细管测序在每个基因的所有编码外显子上进行了碱基对分辨率测序，这为本次药物筛选选择的细胞系奠定了基础。通过设计断点特异性序列引物来检测毛细血管测序后的重排，在药物筛选细胞株面板上确定了7个最常见的重排癌症基因（例如BCR-ABL、MLL-AFF1和EWS-FLI1）的存在。根据“微卫星不稳定性和RER表型在癌症检测和家族易感性中的国际研讨会”制定的指南进行了微卫星不稳定（MSI）分析33使用标记BAT25、BAT26、D5S346、D2S123和D17S250筛选样本，如果两个或多个标记显示不稳定，则将其表征为MSI。使用“PICNIC”算法从Affymetrix SNP6.0微阵列数据中确定癌症基因足迹的总完整拷贝数值，以预测每个细胞系中的拷贝数片段34对于被分类为扩增的基因，整个编码序列必须包含在PICNIC定义的一个相邻片段中，并且总拷贝数必须为8或更多。选择拷贝数为8，以确保超过该阈值的大多数片段由更可能被选择性放大的焦点放大组成。删除必须发生在拷贝号为零的单个连续段中。对于基因表达分析，使用标准Trizol方案从每个细胞系提取RNA，并将其杂交到HT-HGU133A Affymetrix全基因组阵列。使用稳健多阵列平均（RMA）算法生成标准化基因表达强度35。用于此分析的基因组数据见补充数据和转录数据可从ArrayExpress获得（登录号E-MTAB-783）。癌症基因组项目网页也提供了我们癌症细胞系收集的完整描述(http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines网站/).

药物敏感性数据的曲线拟合

剂量-反应曲线拟合荧光信号强度。我们需要一种方法，首先允许我们对发光数据中的异方差进行建模，其次允许我们结合反应的先验知识，特别是在数据信息较少的药物浓度下。因此，实施了一个定制的贝叶斯-乙状模型来促进这一点，对数据中的不确定性进行了全面描述，并允许合理解释测试范围外浓度的预测响应。使用贝叶斯S型模型将响应曲线拟合到荧光信号强度。药物反应数据包括16个（96-well格式）或42个（384-well）无药物阳性对照，8个（96-well）或32个（384-well）阴性（无细胞）对照，以及九个半倍浓度的药物反应点。平均技术复制强度响应。广义S形响应曲线拟合如下。

强度x信用证假设具有平均值x我c（c）=我最小值+我最大−我最小值(1+e（电子）β(我c（c）−α))（f）.参数我最大和我最小值是阳性和阴性对照的平均强度。α和β是尺度和梯度响应。（f）是一个形状参数。信用证表示日志内容。我们假设强度x信用证有差异变量(x信用证) =B.工程(x信用证)，其中B类表示噪波参数。我们假设x信用证具有伽马分布：

P（P）(x我c（c）)=B类E类(x我c（c）)∕B类Γ(E类(x我c（c）)∕B类)x我c（c）E类(x我c（c）)∕B类−1e（电子）−B类x我c（c）

阳性和阴性对照x最大和x最小值也是伽马分布的：

P（P）(x最大)=B类我最大∕B类Γ(我最大∕B类)x最大我最大∕B类−1e（电子）−B类x最大

P（P）(x最小值)=B类我最小值∕B类Γ(我最小值∕B类)x最小值我最小值∕B类−1e（电子）−B类x最小值

给出响应百分比的浓度第页由以下公式给出：

我C类第页=α+1β日志((100100−第页)1（f）−1)

我们使用马尔可夫链蒙特卡罗模拟来获得平均后验参数估计。根据最大似然估计值初始化参数，并获得100000次迭代。最后的10000个值用于后续推断。这个集成电路50具有正常先验，95%的概率质量覆盖范围从低于测试的最低浓度1000倍到高于测试的最高浓度1000倍。我们假设其余参数的先验信息不丰富。使用平均后验值绘制响应曲线集成电路第页对于第页范围在0%到100%之间。的置信区间集成电路第页从相关的后部获得。作为质量控制的一部分，对结果进行手动管理。

多元方差分析

采用固定效应多元方差分析（MANOVA）将反应与基因组学相关联。一个n个由IC组成的×2剂量反应矩阵50和坡度参数β对于n个为每种药物构建细胞系。线性（无交互作用项）模型用组织类型、癌基因突变状态、染色体重排和MSI状态等因素解释了这些观察结果。获得了尺寸效应及其意义。如果一个基因符合以下任一标准，则该基因被定义为突变：癌症基因中的编码序列变异，总拷贝数=0（纯合子缺失）或>=8（扩增）。只有那些在小组中有>1个突变细胞系的基因被纳入分析（共有65个癌症基因和3个染色体重排）。该效应测量平均IC的相对差异50从野生型到突变型（例如，0.1或10的效应分别表示药物浓度减少或增加约10倍）。为了本文的目的，使用错误发现率为20%的Benjamini-Hochberg多重测试校正阈值来识别重要关联的候选列表。

弹性网分析

我们采用Zou和Hastie的弹性网方法20，一种带有惩罚方法的多元变量选择技术。基因组数据，包括64个癌症基因的突变状态、重排、426个致癌基因的连续拷贝数数据(http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census网站/)和全基因组转录谱以及组织类型被用作输入变量(补充数据1和11). 使用弹性网来选择这些特征中的哪些与IC测量的药物反应相关50跨单元格行面板。

让X成为n个×第页输入特征矩阵（其中第页是功能的数量和n个是细胞系的数量）和年是长度药物敏感性的载体n个对于任何非负λ1和λ2

L（左）(λ1,λ2,β)=∣年−X（X）β∣2+λ2∑j个=1第页βj个2+λ1∑j个=1第页∣βj个∣.
1

让β^是天真的弹性净估计量。然后β^=参数最小值β{L（左）(λ1,λ2,β)}.比例因子为（1+λ2)添加到天真的弹性网中，以防止双重收缩。

β^(有弹力的网)=(1+λ2)β^(天真有弹力的网).
2

确定最佳λ1和λ2我们让α=λ2/(λ1+λ2). 然后(1−α)∑j个=1第页βj个2+α∑j个=1第页∣βj个∣是弹性净惩罚。进行10倍交叉验证以优化λ1和λ2在里面方程式2，表示为λ^1和λ^2分别是。为了找出与药物反应相关的变量，λ^1,λ^2、X和y输入到等式中(2)求解向量β.非零变量βs被确定为与药物反应相关的特征。

该程序对每种药物重复100次，以评估应用10倍交叉验证程序时特征的稳定性。对于100次跑步中的每一次，都会为药物建立一个特征列表，该列表由基因、转录物和组织组成，并为每个基因、转录产物和组织分配权重。药物标记物的最终特征包括100次跑步中出现的所有特征，以及该特征出现的频率和100次跑步时该特征的平均权重的统计数据。权重（β）用于评估药物标记特征的效应大小。特征的效果大小是通过将特征的权重乘以其在单元格行面板上的标准偏差来计算的。因此，效应大小是特征权重的标准化，以说明用于测量不同基因组特征的不同尺度。交叉验证中相关性稳定性较高的特征(（f）)被认为是真正与药物反应相关的最高信心。与药物反应相关的最显著特征是频率和效应大小都较大的特征。高度显著关联被定义为效应大小与平均值相差±2 s.d.，−2.95>e>2.79，频率为(（f）)比平均值高出两个标准差，（f）> 0.76.

基于IC的药物聚类50值

对数据集进行过滤，以删除对小组中少于50%的药物进行测试的细胞系，从而剩下400个细胞系。根据IC之间的Pearson-Correlation（PC）得分，使用最近邻法输入缺失数据点50值。我们还应用了一个步骤来减少数据中固有的影响，这是由于整合了从两个不同的筛查点获得的数据，并且这些数据可能会被最近邻缺失点插补放大。为了做到这一点，我们对每个细胞系进行了方差分析，以评估平均IC的差异50两个筛查点的药物值。根据过滤掉的测试，p值<0.01的细胞系。在原始数据集中，265个细胞系（41.47%）用于聚类分析。

与缺失点插补一样，我们通过考虑每种药物的IC模式，明智地测量了药物敏感性/耐药性谱与皮尔逊相关（PC）评分配对之间的相似程度50跨细胞系的值（考虑了对数值）。然后我们以递归的方式将这些相似性分数作为Affinity-Propagation聚类（APC）算法的输入36APC算法基于“在数据点之间传递消息”策略，它要求输入一个成对相似矩阵，并给出一组不相连的簇作为输出。它还指出，对于每个计算出的集群，一个称为“集群样本”的数据点（即“集群质心”）：最好插入其集群中所有其他数据点的数据点。APC算法要求包含一个方阵，其中包含每对数据点之间的相似性分数和一组概率，每个数据点对应一个概率，作为其簇的样本。这些概率隐含地决定了要计算的簇数。如果它们均匀分布，则来自数据的ATC算法会自动确定簇数。在聚类策略的第一步中，我们将APC算法应用于筛选中的整组药物，假设每种药物被选为均匀分布的聚类样本的概率（因此聚类数由APC算法自动确定）。特别地，我们将用于计算此概率的输入参数设置为所有成对相似性的中值。该算法提供了22个集群。在每个簇中，一种药物被指定为簇样本。社区的簇内相似性得分（奇数比）C类包含n个药物计算为平均相似性（即IC之间的相关性50模式）在所有可能的药物之间C类（总平均校正值）除以随机选择的一组中所有可能药物之间的预期平均相似性n个药物。我们将每个药物视为一个网络节点，并在同一簇中对应药物的两个节点之间添加链接，从而导出了簇数据的网络表示。这就产生了用不同颜色表示的“网络社区”补充图3然后，我们使用APC算法递归地再次对集群样本进行聚类，以获得“社区社区”（或“富裕俱乐部”），并如上所述向网络添加链接。此过程在集群示例上递归地重新应用，直到聚合（没有数据点聚集在一起）最终形成如所示的分层网络补充图3和中所述37中的网络可视化补充图3通过使用Cytoscape获得38.

每对社区的簇间相似性得分一个和B类计算如下：

ρ(一个,B类)=∑X（X）∈一个Y（Y）∈B类ρX（X）,Y（Y）∣一个∣∣B类∣

在哪里？ρ十、 Y（Y）是IC模式之间的皮尔逊相关系数50药物的价值X（X）和毒品Y（Y）.

经验主义的第页-通过排列测试计算每个分数的值：对于一个数字n个=10000次试验，每次ρ(A、 B类)，我们随机抽取了两组药物一个*和B类*（包含|一个|毒品和|B类|分别是药物），然后我们计算ρ(一个*,B类*). 然后我们计算了经验值p值对于给定的ρ(A、 B类)≥0（分别≤0）作为ρ(一个*,B类*)大于或等于ρ(A、 B类)穿过n个排列三元组，除以n个.

脚注

作者贡献

M.J.G、U.M、S.V.S和C.B.监督数据收集和分析。C.D.G.和K.W.构思并编写了曲线填充算法，并执行了MANOVA；E.J.E和S.R.进行了弹性网分析，并对数据进行了分析。P.G.、I.R.T和J.So.在A.B和W.Y.的协助下开发和管理筛查数据库。；S.J.H.在D.S.A.D.、X.L、F.K.和L.C.的帮助下完成了大多数与尤因肉瘤相关的研究，I.S.和O.D.提供了关键试剂；R.J.M.、A.T.T.、J.A.S.、S.B.、S.R.L.、K.L.、A.M.、X.M.、T.M、H.T.、L.R.、F.J.P.O.进行了细胞系筛选实验。Q.L.、W.Z.、T.Z.、W.H.、X.D、H.G.C.和J.W.C.合成了筛选化合物，N.S.G对其选择和使用提供了指导；F.I.和J.SR.进行复合活性聚类；G.R.B.和H.D.进行细胞系基因分型和遗传分析；J.A.E.和J.B.就工作的临床相关性提供了指导；M.J.G.和C.B.撰写了手稿，S.R.、S.J.H.和U.M.做出了重要贡献。；M.R.S.、D.A.H、J.Se.和P.A.F构思了这项研究，分析了数据并编辑了手稿。

作者信息

作者们宣布了相互竞争的经济利益。J.Se.目前是Genentech的员工，也是罗氏的股东。

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