癌症相关的异柠檬酸脱氢酶突变使NADPH依赖的还原性羧化失活^*

摘要

介绍

细胞溶胶乙酰辅酶A是支持脂肪酸和胆固醇生物合成以及其他代谢功能所必需的。乙酰辅酶A的主要来源是葡萄糖衍生的丙酮酸，它进入线粒体，通过丙酮酸脱氢酶脱羧为乙酰辅酶A，并通过柠檬酸合成酶与草酰乙酸缩合。柠檬酸盐退出线粒体，通过胞浆ATP：柠檬酸裂解酶裂解为乙酰辅酶A和草酰乙酸。然而，还有另一条通往细胞溶质柠檬酸盐和乙酰辅酶A的途径，称为还原羧基化途径。1948年，奥乔亚(1)注意到心脏提取物吸收一氧化碳的能力₂合成三羧酸，随后用特定标记的前体进行的实验表明，αKG的还原羧基化²由IDH负责固定CO₂变成三羧酸(2). IDH1和IDH2是密切相关的同源二聚体，显著区别在于IDH1是细胞溶质，IDH2为线粒体。IDH3是一种使用NAD的线粒体异源三聚体⁺在三羧酸循环中具有不可逆作用(三). 细胞溶质IDH1生物化学已经进行了一些详细的研究。酶的底物添加顺序是随机的(4,5)并使用CO₂还原羧化反应中的（非碳酸氢盐）(6). 谷氨酰胺被认为对棕色脂肪细胞中的脂肪生成乙酰辅酶a起主要作用(7,8). 尽管在代谢研究中认识到了还原羧基化途径，但这种脂肪生成途径往往被忽视。一个原因是培养的细胞在21%O中生长₂和5%CO₂几乎完全由谷氨酰胺衍生的草酰乙酸和葡萄糖衍生的乙酰辅酶A缩合生成柠檬酸(9). 然而，最近的一系列研究表明，依赖IDH的还原羧基化途径对低氧条件下柠檬酸盐的合成至关重要（0.5-1%O₂)或者线粒体电子传递链受损(10–12). 因此，IDH的还原羧基化有助于在正常生理环境中合成乙酰辅酶A，并且在线粒体功能受损时对脂肪生成至关重要。

当两个同二聚体IDH中的一个突变与包括胶质瘤和白血病在内的多种癌症亚型相关时，人们对IDH生物化学的兴趣增加(13–16). IDH正向反应，即异柠檬酸脱羧反应，被IDH1的Arg-132或IDH2的类似Arg-172发生的常见癌症相关突变所灭活(17–21). 相反，这些突变型IDH从NADPH和αKG产生2HG。这种新形态的活性导致2HG的积累，2HG作为αKG依赖酶的抑制剂，反过来通过影响蛋白质和核酸甲基化的程度改变细胞生理学(22,23). 然而，突变IDH对αKG进行NADPH依赖性还原羧基化的能力尚未被研究，因为在缺乏CO的分析中无法检测到反向反应₂pH值>7。这项研究表明，主要由NADP引起的产物抑制⁺其次通过ICT调节依赖IDH的还原羧基化。主要的癌症相关IDH突变使IDH的正向和反向反应失活，只留下αKG产生2HG的新形态活性。这些特性与高细胞还原环境和低线粒体柠檬酸盐生成相一致，作为通过还原羧基化激活通量的先决条件。突变型IDH酶的表达可能会降低细胞进行还原代谢和应对缺氧或线粒体损伤的能力。

实验程序

结果

IDH1还原羧基化的生化调控

通过NADPH氧化后的荧光光谱法研究了IDH1的还原羧基化（“反向反应”），这取决于αKG和CO的存在₂.CO₂通过溶解35 m来提供来源米pH 6.0缓冲液中的碳酸氢钠。明显的K（K）_米碳酸氢盐含量为18±1.2 m米（未显示数据）。首席执行官₂ K（K）_米在这些实验中，是根据碳酸氢盐和一氧化碳之间的pH依赖平衡进行计算的₂(6). 该等式计算K（K）_米对于CO₂为12.6±1.7 m米pH值6.0。由于CO的浓度，还原羧化分析不能在pH 7.5下进行₂无论碳酸氢盐浓度如何，都很低。这解释了为什么其他人在分析IDH及其突变衍生物时忽略了反向反应(17–20). IDH1催化了还原羧基化的线性速率，该速率持续了约3分钟(图1一). 明显的K（K）_米αKG为1.4±0.2米米，NADPH为35±10μ米在这些实验条件下，当NADP的量⁺（和ICT）产品达到～20μ米这些数据表明，这些产品可能是反向反应的负调节剂。NADP的滴定⁺在分析中有效地抑制了还原羧基化K（K）_我7.6±1.6μ米(图1B类). ICT也抑制αKG羧基化，但不如NADP有效⁺(图1C类). 明显的K（K）_我ICT为110±28μ米。IDH1的正向反应在30分钟内呈线性，一直持续到ICT消耗超过90%（数据未显示）。明显的K（K）_米正向反应值为9.8±2.4μ米对于NADP⁺和43±17μ米用于ICT。动力学参数与组织中代谢物浓度的顺序相同：αKG，0.07-3.5 m米; NADPH，0.12-1.5米米; NADP公司⁺, 20–200 μ米; ICT，～30μ米; 和柠檬酸盐70–400μ米(24,25). 这些数据表明，NADP⁺在较小程度上，ICT是IDH1还原羧化的产物抑制剂；然而，NADPH和αKG都不是ICT脱羧反应的有效产物抑制剂。这是因为IDH1对NADP具有较高的亲和力⁺和ICT，而不是NADPH和αKG。然而，NADP的能力⁺将IDH1转换为只能通过ICT释放的非活性构象(26,27)也有助于NADP对IDH1的有效调节⁺这些数据表明，细胞内还原环境（高NAD（P）H/NAD（P））促进了IDH1的逆流⁺线粒体产生柠檬酸的能力较低。

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图1。

NADP对IDH1还原羧基化的调控⁺.根据“实验程序”中描述的NADPH荧光随时间的变化而降低，从而确定反应速率一，IDH1使αKG羧基化的时间过程仅在分析的前几分钟呈线性。根据反应前3分钟的数据计算初始速率。B类NADP抑制αKG的IDH1还原羧基化⁺使用荧光光谱测定法。C类，使用荧光分光光度法通过ICT抑制IDH1还原羧基化。这些实验中的IDH1比活性（100%活性）为142 pmol/min/mg，数据点一式三份。

癌症相关IDH1/IDH2突变蛋白不能催化还原羧基化

我们使用IDH1（R132H）突变作为模型，因为Arg-132突变是与癌症相关的最常见IDH1突变(13). 已知与癌症相关的IDH1和IDH2突变可从αKG和NADPH产生2HG(17,18). 根据NADPH消耗量以荧光分光光度法测量还原羧基化速率无法区分ICT或2HG的形成。放射化学/色谱分析使用[¹⁴C] αKG用于同时测量这两种产品。放射化学分析的灵敏度低于荧光分光光度分析，并且由于1m的低比活度，需要更多的产物形成才能获得背景以上的信号米[¹⁴C] α千克。这一实际问题导致产品形成率低于[¹⁴C] NADP导致反应停止前的αKG检测⁺堆积(图1一). 在第一次爆炸后[¹⁴C] ICT形成，分析中的产品数量实际上随时间而减少(图2一). 通过使用Glc-6-P脱氢酶作为NADPH再生成系统来防止NADP对还原性羧化的严格抑制，消除了还原性羧基化反应的这个问题⁺NADPH再生成系统的放射化学分析增加了IDH1还原羧基化的线性和程度(图2一). 实验测定了维持还原羧基化所需的Glc-6-P脱氢酶水平，因为商业酶制剂可以在没有IDH1的情况下将αKG转化为2HG（数据未显示）。还原羧基化反应的程度仅受放射化学分析中ICT积累的限制，导致产物生成量增加(图2一). 本试验用于比较IDH1、IDH1（R132H）同源二聚体和IDH1的还原羧基化活性^重量/R132H异二聚体(图2B类). IDH1仅从αKG产生ICT，而突变体IDH1（R132H）同源二聚体仅产生2HG。这些数据表明，Arg-132突变灭活了IDH1的反向反应。通过比较IDH1和IDH1（R132H）的ICT和2HG形成率，证实了这些单点分析(图3). IDH1只产生ICT，平均比活性为148±32 pmol/min/μg，而IDH1（R132H）同源二聚体只产生2HG，平均比活力为102±6 pmol/min/μg。我们确认IDH1（R132H）在正向NADP中也有缺陷⁺-如前所述，ICT的依赖性脱羧（数据未显示）(17–20). 因此，活性位点Arg-132的突变使IDH1的正向和反向反应失活，并促进2HG生成的新形态活性。

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图2。

野生型和突变型IDH1蛋白还原ICT和2HG的形成。 一，放射化学的比较([¹⁴C] 在存在和不存在Glc-6-P脱氢酶的情况下，IDH1的αKG转换为ICT和2HG）分析(G6P DH公司)NADPH再生成系统。B类IDH1同型二聚体形成的产物分析(重量/重量)，编号1^重量/R132H异二聚体(重量/R132H)和IDH1（R132H）同二聚体(R132H/R132H)使用放射化学分析和NADPH再生成系统同时检测[¹⁴C] ICT和[¹⁴C] 如“实验程序”所述，通过薄层色谱进行2HG

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图3。

野生型和突变型IDH1蛋白产生ICT和2HG。 一，IDH1同源二聚体形成ICT的代表性时间过程(重量/重量; ●), IDH1（R132H）同二聚体(R132H/R132H; ○), 和IDH1^重量/R132H异二聚体(重量/R132H; ■). 由于ICT对产品的抑制，反应速度随时间而减慢。B类，三种类型的IDH1蛋白形成2HG的代表性时间过程。C类，使用放射化学分析法检测至少两个不同批次的单独纯化蛋白中单个IDH1蛋白的IDH1特异性活性[¹⁴C] ICT和[¹⁴C] 2HG形成。

野生型/突变型异二聚体中的还原羧基化

在所有情况下，癌症相关的IDH突变只发生在一个等位基因中(13). 因此，预计野生型和突变亚单位之间的异二聚体构成这些肿瘤中50%的IDH酶。野生型/突变异源二聚体的初步表征表明，突变亚基对野生型亚基具有显性负效应(21). 随后的工作得出结论，异二聚体的每一半在正向反应中功能独立(19). IDH1^重量/R132H异二聚体产生ICT和2HG(图2B类). 印尼盾1^重量/R132H异二聚体产生ICT的平均比活性为70±22 pmol/min/μg，2HG的平均比活力为27±2 pmol/min/μg(图3,一和B类). IDH1的ICT形成^{重量/132小时}异二聚体受到NADP的双相抑制⁺使用荧光分光光度法(图4一). 低浓度NADP阻碍了部分NADPH的利用⁺与野生型酶一样严格(图1B类); 然而，仍有一部分NADPH氧化对NADP不起作用⁺与突变单体产生2HG相对应的调节。IDH1（R132H）同源二聚体对NADP不敏感的观察证实了这一结论⁺抑制(图4一). 同样，ICT也抑制了IDH1^重量/R132HNADPH氧化，但仍存在对ICT抑制不敏感的显著氧化速率(图4B类). IDH1（R132H）同源二聚体对ICT的存在不敏感。NADP对NADPH消耗的最大抑制作用⁺IDH1中^重量/R132H异二聚体大于最大ICT抑制与NADP一致⁺将IDH1转化为开放非活性构象的结合，只有ICT才能克服(26,27). NADP最初缺乏ICT⁺滴定图4一，但ICT在滴定中持续存在图4B类我们接下来探讨了新生产物2HG对IDH1的调节。2HG对IDH1的还原羧基化作用影响最小(图4C类). 相反，2HG通过IDH1（R132H）同源二聚体阻断NADPH的利用K（K）_我1.2±0.3米米将2HG添加到IDH1^重量/R132H该反应阻止了50%的NADPH氧化。在IDH1的放射化学分析中^重量/R132H，2HG阻止放射性标记2HG的形成，但不抑制ICT的形成（数据未显示）。这些数据与2HG抑制突变单体而不抑制野生型亚单位的模型一致。因此，IDH1中的两个IDH1亚单位^重量/R132H异二聚体均能正常工作。

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图4。

NADP公司⁺IDH1和IDH1（R132H）的ICT和2HG监管。 一、NADP⁺IDH1（R132H）同源二聚体对NADPH氧化的抑制作用(R132H/R132H; ○) 和IDH1^重量/R132H异二聚体(重量/R132H; ■).B类IDH1（R132H）同二聚体（○）和IDH1对NADPH氧化的ICT调节^重量/R132H异二聚体（■）。C类IDH1同型二聚体对NADPH氧化的，2HG抑制作用(重量/重量; ●), IDH1（R132H）同二聚体（○）和IDH1^重量/R132H异二聚体（■）。这些实验中使用了αKG-依赖NADPH氧化后的荧光分光光度法。绘制了三次测量的平均值±S.E。

最常见的突变发生在IDH1的Arg-132和IDH2的等效Arg-172，这些氨基酸的替换使正向反应失活，并导致在NADPH存在下形成2HG(17,18). IDH1（R132S）和IDH1突变体（R132H）在还原羧基化方面都存在缺陷，并产生大量的2HG(图3C类). 突变酶的性质与活性位点精氨酸的缺失有关，而与精氨酸替代的特定氨基酸类型无关。大规模测序工作已确定与Arg-132突变相比，胶质瘤和白血病中罕见的其他IDH1突变(13). IDH1（V71I）和IDH1(图3C类). 与IDH1（R132H）突变体相比，IDH1突变体（G97D）缺乏还原羧基化，并产生少量2HG。IDH2蛋白表达差，获得的产量远低于IDH1。IDH2还在与IDH1相同的测定条件下进行了强有力的还原羧化，比活性平均为136±15pmol/min/μg。活性位点精氨酸（IDH2（R172K）和IDH2，R140Q）处的癌症相关IDH2突变除了产生2HG外，还存在还原羧基化缺陷（数据未显示），如其他报告所述(16,18). 这些结果与IDH1和IDH2之间的高度结构相似性一致(26,28). 因此，活性位点精氨酸的常见突变使正向和反向IDH反应失活，并将单体亚单位转化为仅产生2HG的αKG还原酶。其他位点的罕见突变不符合这一范式，其催化特性无法预测。

讨论

这项工作的一个关键发现是，活性位点Arg-132的常见突变（最近与几种癌症亚群相关）使IDH1反向反应（NADPH/CO）失活₂-依赖于αKG羧基化），除了阻止正向反应（NADP⁺-依赖性ICT脱羧）(17). IDH2在还原羧基化中也很活跃，两个活性位点精氨酸中任何一个的突变都会使反向反应失去活性，并将酶转化为2HG的生成物。还原羧基化的失活对于理解突变型IDH对代谢的贡献具有重要意义。IDH1的实验^重量/R132H异二聚体表明，突变亚基并没有使野生型亚基的正常反应失活；因此，表达一个突变的IDH等位基因的净作用是将细胞进行还原羧基化的总能力降低约一半。此外，用于柠檬酸盐的αKG碳被转化为2HG，这降低了αKG水平(29). 这可能对在高O条件下使用丰富谷氨酰胺生长的细胞中的脂肪生成几乎没有影响₂但线粒体功能受损或缺氧条件下产生乙酰辅酶A的能力可能会因细胞进行还原羧基化能力的50%失活而减弱。这些代谢问题可能有助于降低表达IDH1（R132H）突变的胶质瘤细胞系的侵袭性(30). 然而，我们的生化研究，以及对培养细胞的敲除研究(12)，表明IDH1和IDH2功能互换支持还原羧基化。考虑到IDH1之间的高度序列和结构相似性，这一结论并不令人惊讶(26)和IDH2(28). 因此，很难得出IDH1或IDH2突变对还原代谢的影响的一般结论，因为这种影响取决于剩余的野生型酶活性和特定细胞系中其他亚型的表达水平。活性位点精氨酸中复发的癌相关突变使IDH的正向和反向反应失活，这与突变IDH形成2HG是改变细胞生理学的重要事件这一观点是一致的(22,23).

参考文献