阿尔茨海默病是一种常见的神经退行性疾病，其定义是死后大脑中淀粉样斑块和神经纤维缠结增多2淀粉样斑块是主要由淀粉样β肽组成的细胞外沉积物，神经纤维缠结是神经元内高磷酸化tau的聚集物，tau是一种参与微管稳定的微管相关蛋白三淀粉样斑块/淀粉样β与人类tau病理之间的病因关系尚不清楚。尽管绝大多数阿尔茨海默病显然是散发性的，具有显著的非孟德尔遗传贡献4对阿尔茨海默病罕见的、主要遗传的家族性形式的细胞和动物模型的分析推动了对疾病机制的大多数想法。这些罕见的病例有突变或重复应用程序，编码淀粉样蛋白-β前体蛋白或早老蛋白基因突变，编码蛋白水解酶，将APP切割成淀粉样蛋白和其他片段。家族性阿尔茨海默病突变过度表达的小鼠模型会产生广泛的斑块沉积和淀粉样蛋白相关病理学，但神经原纤维缠结和显著的神经元丢失明显缺失5,6胎儿人类皮质培养物也被用于研究APP–tau关系。例如，用20μM淀粉样蛋白-β处理的皮层培养物的磷酸化tau（p-tau）升高7然而，淀粉样β的生理相关水平是否直接导致p-tau升高，以及哪些激酶直接参与这种异常磷酸化，目前尚不清楚。此外，使用胎儿人类神经元的实验方法受到样本可用性有限和未知遗传背景的阻碍。iPSC和诱导神经元的最新发展使人们能够研究神经系统疾病的表型在体外8,9,10然而，并不是所有的疾病都能用iPSC成功建模11目前尚不清楚iPSCs是否可以用于研究散发性疾病。
在这里，我们报告了家族性和散发性阿尔茨海默病患者以及非痴呆、年龄匹配的对照组iPSCs的来源和神经元分化。利用纯化的人类神经元，我们探讨了与阿尔茨海默病有关的三个关键问题：（1）iPSC技术能否用于观察阿尔茨海默氏病患者的表型，尽管显性疾病可能需要几十年才能显现出来；（2） APP处理和tau磷酸化之间是否存在因果关系；（3）携带sAD患者基因组的神经元是否能表现出家族性阿尔茨海默病样本中的表型？补充图1总结了实验方法和结果。
我们描述了应用程序重组iPSCs前成纤维细胞的代谢(补充图2).应用程序对两名非痴呆对照（NDC）个体、两名sAD患者和两名APP的早期传代原代成纤维细胞的表达和淀粉样β分泌进行定量Dp公司病人(). 在成纤维细胞中证实存在基因组复制。相对于NDC和sAD细胞，APPDp公司成纤维细胞表达较高水平的应用程序与NDC细胞相比，mRNA和分泌的淀粉样β（1-40）肽数量增加了1.5到2倍。与对照组相比，我们没有发现患者样本中淀粉样β（1-42/1-40）或淀粉样β的显著增加。
表1
| 代码 | 诊断 | 性别 | 家族史 | 发病年龄 | 活检时的年龄 | 活检时的MMSE | APOE公司 |
|---|
| NDC1（国家数据中心1） | 非强化控制 | M（M） | 可能 | 不适用 | 86 | 30 | 2-3 |
| 国家数据中心2 | 非强化控制 | M（M） | N个 | 不适用 | 86 | 30 | 3-3 |
| 上海AD1 | 零星AD | F类 | N个 | 78 | 83 | 4 | 3-3 |
| sAD2号机组 | 零星AD | M（M） | N个 | 78 | 83 | 18 | 3-3 |
| 应用程序Dp公司1 | 家族AD、APP复制 | M（M） | Y（Y） | 46 | 51 | 21 | 3-3 |
| 应用程序Dp公司2 | 家族AD、APP复制 | F类 | Y（Y） | 53 | 60 | 17 | 3-3号 |
我们通过转导带有逆转录病毒编码的成纤维细胞生成iPSC株华侨城4号,索2,KLF4型,c-MYC公司在三分之一的文化中，EGFP公司六个个体中的每一个都由三个克隆iPSC系代表。所有18个iPSC系均保持胚胎干细胞样形态，表达多潜能相关蛋白NANOG和TRA1-81，保持整倍体核型，表达内源性胞源性SOX2，抑制逆转录病毒转基因，并能分化为外胚层、中胚层和内胚层细胞系在体外(,补充图3a-e和4). 当注射到裸鼠体内时，所有被测品系（每个个体一个）都会形成畸胎瘤(补充图5).补充表1提供了每个iPSC线路的详细信息。
诱导多能干细胞系的建立及APP神经元的纯化Dp公司、sAD和NDC成纤维细胞一,b条、iPSC系列表示NANOG和TRA1-81。c（c）,d日、iPSC衍生、FACS纯化的NPC表达SOX2和巢蛋白。e（电子）——小时，iPSC-derived，FACS纯化的神经元表达MAP2和βIII-tublin。比例尺英寸一——小时，50微米。我，对体电流注入的代表性动作电位。来自iPSC线路APP的数据Dp公司2.2.j个，检测到自发突触活动（在钠的反转电位（0mV）下记录电压钳），并被GABA可逆阻断A类受体拮抗剂SR95531（10μ。每个面板代表约4分钟的连续记录，分为25次扫描（灰色痕迹）并叠加以保持清晰。黑色痕迹表示单个扫描。来自iPSC线路NDC2.1的数据。k个,我，在第11天，在神经干细胞和任何患者的培养物之间，诱导多能干细胞生成神经干细胞的能力没有显著差异(P（P）= 0.08,n个=9），或NPC在3周时形成神经元的能力(P（P）= 0.82,n个= 9). 误差条表示s.e.m。
多能干细胞系之间的分化效率存在差异。为了分析iPSC系的变异性，我们使用了一种基于荧光激活细胞分选（FACS）的神经元分化和纯化方法（总结于补充图6)，基于前面描述的工作12简单地说，18个iPSC系首先分化为含有神经玫瑰花结的培养物(补充图3f). 从这些培养物中，纯化神经前体细胞（NPC），并用CD184评估NPC形成的效率+CD15型+CD44细胞−CD271型−免疫反应性。这些FACS纯化的NPC在多次传代中保持NPC相关标记的表达，如SOX2和nestin(). 将NPC分化为含有神经元的异质培养物3周(补充图3g，h).应用程序在不同的培养基中，拷贝数保持不变(补充图3i). 从这些培养物中，神经元被纯化到接近同质性，并用CD24评估神经元生成的效率+CD184型−CD44细胞−免疫反应。在NPC或神经元分化效率方面，未发现任何个体之间存在显著差异().
虽然我们观察到每个个体的品系之间分化的变异性，但诱导间变异的程度小于观察到的诱导内变异。这些结果表明，如果在同一患者的多个细胞系中出现任何观察到的神经元生化异常，可能是由该患者基因型的特征引起的。纯化的神经元以2×10的密度进行电镀5每孔96周培养板上的细胞数，再培养5天。根据βIII-管蛋白的存在判断，这些培养物中90%以上的细胞是神经元+，地图2+投影(). 将五种具有代表性的纯化神经元培养物的全基因组信使核糖核酸表达谱与亲代iPSC系和胎儿大脑、心脏、肝脏和肺部的样本进行比较(补充图7和补充表2). 无监督的层次聚类分析显示，纯化的神经元与胎儿大脑样本最为相似，部分原因是神经元基因的整体上调。有趣的是，胎脑样本和纯化神经元之间最大的差异是河马信号级联中纯化神经元的下调（约6.1倍），该级联调节NPC和胶质细胞等细胞的增殖13,14.
我们测定了纯化神经元的多种电生理特性，以评估被动膜特性和突触连接(,补充表3和补充图8). 值得注意的是，几乎所有接受测试的神经元都会产生依赖于电压的动作电位和电流()被河豚毒素阻断(补充图8). 电离性受体激动剂（25μM麝香醇或10μM AMPA）的短暂浴浴应用可诱发瞬时电流，表明纯化的神经元分别表达功能性GABA和AMPA受体(补充表3). 为了确定神经元是否也能够形成功能性突触接触，我们分析了连续的全细胞电压钳记录。我们在一部分细胞（约40%）中检测到自发抑制和/或兴奋性突触电流。用GABA分析结合可逆阻滞的这些事件的动力学A类或AMPA受体拮抗剂证明，神经元不仅激发动作电位，而且进行功能性突触接触(补充表3). 谷氨酸能和GABA能神经元亚型（分别为VGluT1和GABA）的蛋白标记物的表达分析支持了电生理结果，免疫荧光检测到这两种亚型，约15%的细胞为VGlu T1而8%的细胞为GABA，剩下的大多数神经元模糊地染色以寻找其中一个标记(补充图9a). 表明谷氨酸能、GABA能和胆碱能亚型（即，VGLUT1型,GAD67型和CHAT（查特）用定量聚合酶链反应（qPCR）检测。重要的是，患者和对照组之间未检测到神经元亚型的显著差异(补充图9b–f).
成纤维细胞淀粉样β肽分泌增加或改变是迄今为止所有家族性阿尔茨海默病突变的共同特征15,16目前尚不清楚家族性阿尔茨海默病患者的iPSC-derived神经元是否能维持父母成纤维细胞中淀粉样β生成的升高。在sAD成纤维细胞和其他外周细胞中，APP表达和淀粉样β分泌没有持续改变17.确定iPSC-衍生神经元是否来自APPDp公司sAD患者淀粉样蛋白β分泌增加，测定神经条件培养液中淀粉样蛋白-β水平，并将其归一化为细胞裂解物的总蛋白水平。患者APP中纯化的神经元Dp公司1和APPDp公司2，每个由三个独立衍生的iPSC系代表，分泌的淀粉样β（1-40）水平显著高于平均NDC水平(). 与NDC神经元相比，患者sAD2神经元的淀粉样β（1-40）水平也显著升高，尽管sAD2和NDC个体的成纤维细胞之间没有观察到差异。我们发现，由于纯化的神经元数量相对较少，这些纯化的神经元培养物中的淀粉样β（1-42）和淀粉状β（1-38）水平通常低于我们的检测范围。根据细胞类型，APP之间的神经元淀粉样蛋白-β水平差异较大Dp公司和NDC，进一步表明成纤维细胞不能完全预测神经元表型().
sAD2和APP中淀粉样蛋白-β、p-tau和aGSK-3β增加Dp公司神经元培养一、从sAD2、APP纯化的神经元Dp公司1和APPDp公司与NDC样本相比，2分泌增加的淀粉样蛋白-β（1-40）（Aβ（1-四十））(P（P）分别为=0.0012、0.0014和<0.0001）。b条与成纤维细胞相比，患者和对照组之间的淀粉样β差异更大。数据集与NDC平均值相关。c（c）,d日、来自sAD2的神经元、APPDp公司1和APPDp公司与NDC样品（aGSK-3β，P（P）<0.0001、0.0005和0.0001；p-τ/总τ，P（P）<0.0001、0.0001和0.0002）。在一——d日,n个图表上的数值表示每名患者的生物复制次数，三个iPSC系平均贡献。e（电子），在另外两个iPSC系（sAD2.4和sAD2.5）中验证了sAD2的发现。sAD2（1-3）表示来自初始sAD2 iPSC线路的发现。对于淀粉样蛋白-β、aGSK-3β和p-tau/总tau，sAD2仍显著高于对照组(P（P）< 0.0001). 原始和次级sAD2株系之间无显著差异(P（P）= 0.14, 0.44, 0.63).（f），纯化神经元中淀粉样蛋白-β（1-40）、aGSK-3β和p-tau/总tau之间呈强正相关。皮尔逊R（右）分别为0.94、0.91和0.83。克与对照组相比，使用β-和γ-分泌酶抑制剂治疗20小时后，分泌的淀粉样β（1-40）减少。β-分泌酶抑制剂部分解救了sAD2和APP中的aGSK-3β和p-tau/总tauDp公司2个神经元(P（P）aGSK-3β<0.01，P（P）<0.03（对于p-tau）。γ-分泌酶抑制对aGSK-3β和p-tau/总tau没有显著影响。在克，治疗组数量如图所示(n个)，NDC分别由两条iPSC线和sAD2和APP表示Dp公司2由3表示。误差条表示s.e.m。
遗传证据表明APP处理和淀粉样β水平的改变或升高是家族性阿尔茨海默病的驱动因素2由于相同的神经病理学，偶发性阿尔茨海默病。然而，tau虽然在基因上与阿尔茨海默病无关，但会形成神经纤维缠结，与疾病严重程度的相关性比斑块数量更好18APP处理的改变可能导致p-tau升高和神经原纤维缠结病理的机制尚不清楚。几种Tau磷酸化表位之一Thr 231的Tau磷酸化调节微管的稳定性19与神经纤维缠结数量和认知能力下降程度相关20,21.确定APP中Thr 231处的tau磷酸化是否升高Dp公司和sAD神经元，我们测量了NDC、sAD和APP的三个iPSC系纯化神经元裂解液中相对于总τ水平的p-tau（Thr 231）量Dp公司患者。来自两个APP的神经元Dp公司患者的p-tau/总tau比率明显高于NDC细胞系的神经元(). 两名sAD患者的p-τ/总τ反映了淀粉样蛋白-β的结果：sAD1和NDC神经元之间没有差异，而sAD2神经元显著增加了p-τ的/总Tau。
Tau可以被多种激酶磷酸化。激酶GSK-3β可以在Thr 231磷酸化tau在体外在sAD死后神经元中与神经原纤维缠结和前缠结磷酸化tau共定位22GSK-3β被认为具有组成活性，但在Ser 9磷酸化时被钝化（参考。23). 为了确定p-tau升高的iPSC-derived神经元是否增加了GSK-3β活性，通过测量Ser 9处缺乏磷酸化的GSK-3α的量与总GSK-3γ水平的关系，计算纯化神经元中aGSK-3δ的比例。我们观察到患者APP的神经元Dp公司1、APPDp公司2和sAD2的aGSK-3β显著高于NDC神经元(). 通过分析另外两个iPSC系（sAD2.4和sAD2.5补充图10)我们观察到水平持续升高(). 每个患者的详细结果见补充表4a，每行细胞补充图11和中的每细胞培养补充表5.
尽管淀粉样蛋白-β、p-tau和GSK-3β在阿尔茨海默病发病机制中有明显作用，但它们之间的关系尚不清楚。我们观察到iPSC-derived神经元在淀粉样蛋白-β（1-40）、p-tau/total tau和aGSK-3β水平之间表现出强烈或非常强烈的相关性(和补充表4b). 我们推断，如果APP蛋白水解产物，如淀粉样蛋白-β或羧基末端片段（CTFs），在p-tau和aGSK-3β升高中具有致病作用，那么抑制γ或β分泌酶活性可以降低p-tau及aGSK-2β。我们处理了来自NDC1、NDC2、sAD2和APP的纯化神经元Dp公司2个（每个2–3个iPSC系）与γ-分泌酶抑制剂（CPD-E和DAPT）或β-分泌酶抑制物（βSi-II和OM99-2）联用24小时，并测量淀粉样蛋白-β、GSK-3β和p-tau/总tau，与车辆处理样品进行比较。所有抑制剂都将淀粉样β（1-40）降低了相似的水平（患者样本中为32-45%）(). 有趣的是，对于sAD2和APPDp公司2个神经元，我们观察到β-分泌酶抑制剂显著降低aGSK-3β和p-tau/总tau(中的iPSC线路所示补充图12). γ-分泌酶抑制剂与对照处理样品的aGSK-3β水平和p-tau/总tau均无显著差异。
我们扩展了sAD2和APP的表型特征Dp公司通过分析与星形胶质细胞共培养12天的FACS纯化神经元内体和突触标记物。大量RAB5的积累+在散发性阿尔茨海默病和某些家族性阿尔茨海默病的尸检中观察到神经元的早期内体24,25由于β-分泌酶定位于内体并具有最佳的酸性pH值，有人提出早期内体可能介导APP处理对下游病理的影响，如p-tau增加、神经原纤维缠结、突触丢失和凋亡26; 然而，如果没有活的、患者特有的神经元，这些假设很难直接测试。为了确定阿尔茨海默病患者iPSC-derived神经元中是否存在早期内体表型，从NDC1、NDC2、sAD2和APP纯化的神经元Dp公司采集2株（每株2个iPSC系）与星形胶质细胞共培养的大鼠和超大鼠Rab5+早期内体（1–2.1μm三和2.1–7微米三)在神经元胞体中计数。而对照神经元通常很少有Rab5+结构>1μm三，来自sAD2和APP的神经元Dp公司2名患者经常患有Rab5+早期内体的体积、形态和定位与尸检标本中观察到的非常相似(). 比较时，sAD2和APP的神经元Dp公司与对照组相比，2组大的和非常大的早期内体数量均显著增加(). 我们试图确定来自sAD2和APP的神经元培养物Dp公司2还含有水平降低的突触前标志物突触蛋白酶I。在阿尔茨海默病尸检中，突触丢失是与痴呆症严重程度最强的病理相关性之一，在受阿尔茨海默病影响的大脑区域，患者的突触前标志物突触蛋白酶I比对照组降低27,28为了分析与星形胶质细胞共同培养的iPSC衍生神经元中突触蛋白I的水平，我们量化了突触蛋白Ⅰ+MAP2上的punta+树枝晶(). 我们发现NDC与sAD2或APP之间没有显著差异Dp公司每μm枝晶的点状数量为2(). 研究阿尔茨海默病相关联的突触蛋白丢失可能需要延长培养期。
与星形胶质细胞共培养的纯化神经元早期内体和突触蛋白水平分析一——c（c）NDC1、sAD2和APP中Rab5染色神经元胞体的扩展聚焦图像Dp公司2.箭头输入b条标记为1–2.1μm三早期内体，箭头标记为2.1–7μm三早期内体。比例尺，10μm。d日、来自sAD2和APP的神经元Dp公司与NDC神经元相比，2个神经元的大的和非常大的早期内体数量显著增加(P（P）<0.0001时，n个=每个人两条iPSC线中的40个神经元）。e（电子），突触蛋白I（绿色）在MAP2上的代表性图像+枝晶（红色）。箭头标记突触I+泪点。比例尺，3μm。（f），患者和对照组之间的突触蛋白数量无显著差异+每μm枝晶的结构(P（P）= 1.00,n个=每个人两条iPSC线的40个树枝晶）。神经元的评分不考虑基因型。误差条表示s.e.m。
本研究的结果提供了强有力的证据，表明iPSC技术可以与尸检样本和动物模型一起用于研究散发性和家族性阿尔茨海默病的早期发病机制和药物反应。在一个散发性阿尔茨海默病和两个APP的纯化的电生理活性神经元中Dp公司我们观察到阿尔茨海默病的三个主要生化标志物：淀粉样蛋白-β（1-40）、aGSK-3β和p-tau/total tau水平显著升高。在亲代成纤维细胞中未观察到sAD2淀粉样β水平升高，表明存在细胞类型特异性表型。在本研究的个体中，不仅淀粉样蛋白-β（1-40）、p-tau/total tau和aGSK-3β之间存在强相关性，而且sAD2和APP神经元中的p-tau/total tau和a GSK-3Dp公司在用β-分泌酶抑制剂治疗后，表明APP处理途径在人类神经元中的tau-Thr231磷酸化中具有致病作用。由于γ-分泌酶抑制没有引起显著影响，除淀粉样蛋白-β外，APP加工产物可能在诱导GSK-3β活性和p-tau中发挥作用。一个潜在的罪魁祸首是β-CTF，其水平与APP复制小鼠模型中的轴突病变相关29并介导人唐氏综合征成纤维细胞的早期内体积聚30.患者sAD2和APP神经元的观察Dp公司2具有早期内体表型引发了一个问题，即异常的早期内体如何与阿尔茨海默病的其他表型相关，如人类神经元中的轴突病、突触丢失和细胞死亡。神经元和突触严重依赖内吞途径，因此iPSC技术现在可以用于研究这种动态过程在活体患者特定神经元中的作用。值得注意的一点是，我们所产生和研究的纯化神经元培养物可能尚未完全成熟，因为它们缺乏重复动作电位，自发活动有限。虽然某些类型的成熟神经元也具有这些特性，但可以想象，我们观察到的表型可能会因在体外文化。在这种情况下，虽然关于阿尔茨海默病表型何时开始存在争议，但有证据表明，阿尔茨海默氏病的疾病样病理学最早可发生在妊娠28周的唐氏综合征胎儿中24.
我们发现，患者sAD2的基因组，而不是患者sAD1，在纯化的神经元中产生显著的阿尔茨海默病表型，这一发现具有重要意义。首先，这一发现表明，未知频率的散发性阿尔茨海默病患者的基因组会产生强烈的神经元表型。这种基因组在散发性阿尔茨海默病人群中的频率无法从我们报告的小样本量中确定，需要更大的样本量来询问这种基因组在诊断为散发性阿尔茨海默病的临床人群中的出现频率。其次，sAD2的基因组清楚地包含一个或多个产生阿尔茨海默病表型的变体，这可以通过未来的分子遗传学研究加以阐明。第三，我们推测，散发性阿尔茨海默病可能会因神经元本身是否发生改变而细分，如sAD2，而不是其他类型的细胞，如星形胶质细胞，而星形胶质细胞在其他情况下可能发生改变，例如sAD1。因此，未来对更多患者和对照组进行iPSC研究，有可能深入了解散发性阿尔茨海默病发病机制中观察到的异质性背后的机制、不同细胞类型的作用、患者特异性药物反应和前瞻性诊断。
