来自非洲捐赠者的广泛有效中和抗体揭示了新的HIV-1疫苗靶点

摘要

尽管进行了20多年的研究，针对HIV-1的保护性疫苗仍然难以捉摸。人们普遍认为，这种疫苗需要激发T细胞介导的免疫和广泛中和抗体反应(1-三). 所有已知的bNAbs在现有最佳灵长类动物模型中提供保护(4-9)因此被认为是疫苗应该引发的抗体类型。不幸的是，这些抗体往往对非支链B病毒显示有限的广度和效力，非支链病毒是北美和欧洲以外的大多数感染，它们识别病毒上的抗原表位，而这些抗原表位在与多种免疫原结合时迄今未能引起广泛的中和反应(10-12). 因此，为了开发一种成功的疫苗，首先要确定与抗原表位结合的新bNAb，这些表位可能更适合免疫原设计。

我们对来自泰国、澳大利亚、英国、美国和几个撒哈拉以南非洲国家的大约1800名感染艾滋病毒的捐赠者的血清进行了中和活性筛选，并确定了具有广泛和有效中和血清活性的捐赠人(13,14). 目前正在使用不同的方法从这些捐赠者中产生单克隆抗体。在本研究中，我们采用高通量策略从a分支感染供体的约30000个活化记忆B细胞中筛选出含有免疫球蛋白（Ig）G的培养上清液，用于与单体重组包膜糖蛋白gp120（HIV-1主要分离物JR-CSF）和gp41（HIV-1HxB2株）结合（三聚体gp120和gp41复合物，称为Env，介导病毒进入）和对HIV-1主要分离物JR-CSF和SF162的中和活性(表S1) (15). 记忆B细胞以接近克隆密度培养，这使我们能够很好地从每个培养物中重建真正的抗体重链和轻链对。出乎意料的是，97.7%的B细胞培养上清液中和了HIV-1_JR-CSF公司46.5%中和了HIV-1_SF-162型未与单体gp120结合_JR-CSF公司或gp41_{高x B2}只有2%的具有中和活性的培养物能中和这两种病毒(图S1). 从五种表现出不同功能特征的B细胞培养物中获得抗体基因；一个与gp120结合，仅中和HIV-1_SF162系列（PGC14），两种结合到gp120并弱中和两种病毒（PGG14和PG20），以及两种有效中和HIV-1_JR-CSF公司，未能中和HIV-1_SF162系列，在ELISA中未与gp120或gp41结合（PG9和PG16）(15). 对抗体可变基因的分析揭示了两对体细胞变体，其中一对包含长CDRH3环（PG9和PG16）(表S2). 长CDRH3环以前与多反应性（以中等亲和力与多种结构不同的抗原结合的能力）有关(16)因此，我们测试了PG9和PG16对一组抗原的反应性，并确认抗体不是多反应性的(图S2) (15).

首先对所有五种抗体进行中和活性测试，以对抗多刃16型假病毒(表S3) (15). 初始筛选中与gp120结合的两种抗体（PGG14和PG20）对任何测试的病毒都没有显示出显著的中和广度或效力，而与gp120（PGC14）结合的第三种抗体以不同的效力中和了4/16种病毒。相反，这两种抗体不能结合gp120或gp41并且不能中和HIV-1_SF162系列在最初的筛选中（PG9和PG16）以低于1μg/ml的浓度中和了大部分病毒。观察到93.3%的B细胞培养物中和了HIV-1_JR-CSF公司未与gp120或gp41结合或中和HIV-1_SF162系列表明该捐赠者的NAb对HIV-1的反应_JR-CSF公司可能由PG9和PG16型抗体介导。接下来，我们在一个由162种病毒组成的大型多叶假病毒面板上评估了PG9、PG16和PGC14，以进一步评估这三种抗体的中和广度和效力(表1,表S4和第5章). bNAbs b12、2G12、2F5和4E10以及供体血清也被纳入小组进行比较。总的来说，PG9和PG16表现出中和广度和效力的显著结合。PG9中和了162种病毒中的127种和162种中的PG16 119种，其效力经常大大超过四种对照bNAbs的效力。中间IC₅₀和IC₉₀PG9和PG16在所有分支中的中和病毒值比四种现有bNAb中的任何一种都低一个数量级(表1A,表S4和第5章)两种单克隆抗体的中和广度均大于b12、2G12和2F5(表1B,表S4和第5章). 在低抗体浓度下，PG9和PG16也表现出比4E10更大的中和宽度(表1B). 此外，两种单克隆抗体都能有效中和一种病毒（IAVI-C18），该病毒对所有四种现有的bNAb都表现出耐药性(表S4). 单克隆抗体中和曲线的检查表明，虽然PG9中和曲线通常显示出陡峭的斜率，但PG16的中和曲线有时在低于100%的中和度时显示出缓慢的斜率或平台(图S3和表S3). 尽管之前已经报告过具有类似剖面的中和曲线(17,18)，其机制尚不清楚。血清中和谱与PG9、PG16和PGC14的中和谱的比较表明，这三种抗体可以在大多数情况下重现血清中和谱的宽度(表S4). 例如，几乎所有被IC血清中和的病毒₅₀>1:500被＜0.05μg/ml的PG9和/或PG16中和。一种没有发生这种情况的情况是针对HIV-1_SF162系列，但该病毒被PGC14有效中和。虽然PG9和PG16是体细胞变体，但它们对一些测试的病毒表现出不同程度的效力。例如，PG9中和了HIV-1_6535.30大约是PG16的185倍，PG16可以中和HIV-1_{MGRM-AG-001公司}大约是PG9的440倍。在某些情况下，这两种抗体的中和广度也不同；PG9中和了九种对PG16不敏感的病毒，而PG16中和了两种对PG9不敏感的细菌。根据这些结果，该捐赠者的广泛血清中和可能由识别略有不同表位的体抗体变体介导，并显示不同程度的中和广度和对抗任何给定病毒的效力。选择这些类型的抗体可能反映免疫系统对不断进化的病毒包膜靶点的反应。

PG9和PG16不能结合单体gp120_JR-CSF公司或gp41_HxB2型在最初的筛查中有效中和HIV-1_JR-CSF公司提示这些抗体靶向的表位可能优先在三聚体HIV Env上表达。通过比较PG9和PG16结合来自几个不同菌株的单体gp120的能力、人工三聚体gp140构建物以及在转染细胞表面表达的三聚体Env来研究这种可能性(15). 虽然这两种抗体都与细胞表面Env具有高亲和力，但PG16并不与任何可溶性gp120或gp140结构物结合，而PG9仅与某些菌株的单体gp120和三聚体gp140弱结合(图1). 我们假设PG9和PG16对裂解的HIV-1三聚体不具有唯一的特异性，因为之前已经证明细胞表面Env的很大一部分由未裂解的gp160分子组成(19). 事实上，这两种抗体都与裂解缺陷型HIV-1高亲和力结合，这一事实证实了这一点_YU2公司转染细胞表面表达的三聚体(图S4) (15). 这些结果表明，在转染细胞表面表达的可溶性、重组gp140和未分离gp160之间存在显著的结构差异。

在单独的窗口中打开

图1

PG9和PG16的抗原结合特性

（A）ELISA测定PG9和PG16与单体gp120和人工三聚体gp140的结合。在所示的实验中，抗原被直接涂覆到ELISA微孔上，但当抗原被捕获到带有非竞争性表位抗体的微孔上时，也获得了类似的结果。（B）流式细胞术检测293T细胞表面表达的PG9和PG16与Env的结合。b12用作ELISA分析的对照。细胞表面结合分析中包括bNAb b12，它与Env的裂解和未裂解形式具有相似的亲和力，以及非中和抗体b6，它只与未裂解Env结合，以显示细胞表面上表达的裂解和非裂解Env的预期百分比(19). 实验重复进行，数据代表至少三个独立实验。

接下来，我们试图定义PG9和PG16表位。我们怀疑它们会识别相同或重叠的表位，因为这两种抗体是体细胞变体。事实上，这两种抗体都竞争与HIV-1的结合_JR-CSF公司转染细胞(图2A) (15). 可溶性CD4是Env受体的可溶性版本，减少了PG9和PG16与细胞表面Env的结合，尽管这两种抗体都没有与CD4结合位点抗体b12竞争三聚体结合(图2A-B). 这一结果表明，CD4结合引起的构象变化导致抗体靶向的表位丢失。竞争ELISA显示，PG9与针对gp120的V2和V3可变环的抗体竞争gp120结合，在较小程度上与CD4i抗体竞争（其识别依赖于CD4结合的gp120上的表位）(图2C和图S5) (15). PG9和PG16均未与HIV-1结合_JR-CSF公司在转染细胞表面表达缺失V1/V2或V3可变环的变体，这进一步表明可变环是表位的关键成分(图2D). 为了剖析PG9和PG16的精细特异性，使用大样本HIV-1进行丙氨酸扫描_JR-CSF公司先前描述的环境丙氨酸突变体(20-23)以及一些新的丙氨酸突变体。我们生成了包含单个Env丙氨酸突变的伪病毒，并测试了PG9和PG16对每个突变伪病毒的中和活性(15). 导致病毒从PG9和PG16中和中逃逸的突变被认为对PG9和PG16表位的形成很重要(表2和表S6). 根据这些数据，并与竞争实验一致，形成PG9和PG16识别的表位的残基主要位于gp120的V2和V3环的保守区域(表S6和图S6). 某些共受体结合位点突变也对PG9和PG16的中和作用产生影响，尽管影响程度较小(表S6). 虽然PG16对V3环取代比PG9更敏感，但PG9和PG16在很大程度上依赖于相同的残基。有趣的是，尽管两种抗体都不与野生型HIV-1结合_JR-FL公司转染细胞，HIV-1 V2环168位E到K突变_JR-FL公司产生高亲和力的PG9和PG16识别(图S7). V2 N-糖基化位点N156和N160对形成PG9和PG16表位至关重要，因为这些位置的替换导致抗体中和逃逸(表2和图S8). 艾滋病病毒1型_SF162系列在160位含有罕见的N至K多态性（不允许N-糖基化），该残基突变为N使该分离物对PG9和PG16敏感(图S9). 单体gp120的去糖基化消除了PG9的结合(图S8)，证实聚糖在形成表位中直接或间接起重要作用(15).

在单独的窗口中打开

图2

绘制PG9和PG16表位

（A）PG9和PG16相互竞争，并与细胞表面Env结合的CD4结合位点（CD4bs）抗体b12竞争。竞争对手抗体显示在每个图表的顶部。(B）可溶性CD4（sCD4）对PG9和PG16与细胞表面环境结合的影响。2G12被包括在内以控制CD4诱导的gp120的脱落。（C）PG9与针对V2环（10/76b）、V3环（F425/b4e8）和CD4i位点（X5）的抗体竞争gp120结合。在所示的实验中，抗原被直接涂覆到ELISA微孔上，但当抗原被非竞争性表位抗体捕获时，也获得了类似的结果。（D）PG9和PG16与可变环缺失HIV的结合-_1个JR-CSF293T细胞表面表达变异体。2G12用于控制细胞表面环境表达。所有实验均重复进行，数据代表至少两个独立实验的平均值。

PG9和PG16与天然三聚体的优先结合可能是因为它们的表位跨越一个以上的gp120亚基，也可能是因为抗体在三聚体上稳定的构象中识别单个亚基。为了解决这个问题，我们研究了PG9和PG16与混合HIV-1的结合谱_YU2公司三聚体，其中两个gp120亚单位包含点突变，以消除两种抗体的结合(15). 第三个取代基消除了与单体gp120和三聚体Env都具有高亲和力的2G12的结合，也被引入同一结构中作为内部控制。细胞表面结合分析表明，与野生型三聚体相比，所有三种抗体与混合三聚体的结合具有相似的表观亲和力，并且所有结合都在类似的较低水平上饱和(图S10). 这一结果表明，PG9和PG16对三聚体Env的偏好是由于gp120亚基在三聚体棘突的背景下呈现，而不是gp120交联。

其他研究表明，与包含部分V2或V2和V3结构域的表位结合的NAb可以表现出与PG9和PG16相当的效力，尽管这些抗体迄今已显示出较强的菌株特异性(17,24). 重要的是，这些抗体识别的表位与B族共有序列的表位仅通过单个氨基酸替换而不同，这表明V2结构域中存在相对保守的结构(17,18). 在这里，我们已经确认该区域是一个有效的中和靶点，并证明识别V2和V3保守部分的抗体可以具有广泛的反应性。

鉴于这是对如此大量抗体进行直接功能筛选的首次尝试，该方法很可能会产生更多bNAbs，尤其是那些与重组形式的Env结合不良的bNAbs。PG9和PG16表现出的中和广度，特别是对非分支B分离株的中和广率，表明具有类似特异性的疫苗诱导抗体可能对世界各地流行的各种最流行的HIV-1分离株提供保护。此外，这些抗体表现出的特殊中和效力在体外表明这种特异性抗体可能在疫苗接种可达到的相对较低血清浓度下提供保护。设计用于将免疫反应集中于三聚体棘波背景下可变环的保守区域的免疫原将决定这些类型的抗体是否容易被疫苗诱导。

补充材料

致谢

脚注

参考文献和注释