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公共科学图书馆一号。2012; 7（4）：e36027。
2012年4月23日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pone.0036027
预防性维修识别码：项目经理335073
PMID：22540017

神经一氧化氮合酶（nNOS）解偶联在胰岛素抵抗肥胖Zucker大鼠阴茎动脉功能失调性氮能血管舒张中的作用

安娜·桑切斯,1 克里斯蒂娜·孔特雷拉斯,1 玛丽亚·皮拉尔·马丁内斯,2 贝伦气候,1 萨拉·贝内迪托,1 阿尔比诺·加西亚·萨克斯坦,1 梅达多·埃尔南德斯,1和多洛雷斯-普列托1,*
卡洛·盖塔诺，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

目的

勃起功能障碍（ED）被认为是血管疾病的早期迹象，因为它在有心血管危险因素的患者中的发病率很高。涉及一氧化氮（NO）的内皮和神经功能障碍通常与糖尿病ED的病理生理学有关，但其潜在机制尚不清楚。本研究评估了氧化应激在肥胖Zucker大鼠（OZR）阴茎动脉功能失调性神经血管扩张反应中的作用，OZR是代谢综合征/糖尿病前期的实验模型。

方法和结果

与瘦Zucker大鼠（LZR）相比，在非肾上腺素能非胆碱能（NANC）条件下的电场刺激（EFS）可诱发OZR大鼠阴茎动脉的舒张作用显著降低。阻断NO合酶（NOS）可抑制LZR和OZ的神经松弛，而饱和浓度的NOS底物L-精氨酸可逆转这种抑制作用，并将OZ的松弛恢复到LZR动脉的水平。与LZR相比，OZR动脉中nNOS的表达没有变化，nNOS选择性抑制降低了LZR的EFS舒张，但OZR没有，而内皮细胞的去除并没有改变这两种菌株的反应。OZR勃起组织中的超氧阴离子生成和硝基酪氨酸免疫染色升高。NADPH氧化酶抑制剂apocynin治疗或NOS辅因子四氢生物蝶呤（BH4）急性孵育可将OZR的神经松弛恢复到对照动脉的水平，而抑制BH4合成GTP-环水解酶（GCH）的酶可减少LZR而非OZR动脉的神经松弛。与对照组相比，NO供体SNAP诱导OZR动脉中受损的细胞内钙降低。

结论

本研究表明，胰岛素抵抗条件下，阴茎动脉氧化应激和nNOS解偶联导致氮能功能障碍和神经NO信号受损。这种功能障碍可能与代谢综合征相关的ED有关，同时内皮功能障碍也涉及NO信号的改变。

介绍

由于勃起功能障碍（ED）在糖尿病、高血压和高脂血症等心血管危险因素患者中的高发病率，目前被认为是血管疾病的早期临床症状[1],[2]ED是男性糖尿病患者常见的并发症，也是生活质量下降的重要原因，男性阳痿在1型和2型糖尿病患者中的发病率是普通人群的三倍[3],[4].

阴茎勃起是一个复杂的多因素血流动力学过程，涉及需要激素平衡、神经和血管功能完整性的器官通路[5],[6]性刺激时，副交感神经激活，脊髓神经信号刺激神经元一氧化氮合酶（nNOS）活性，非肾上腺素能非胆碱能（NANC）神经末梢产生NO，从而导致海绵体组织血流量增加，从而启动勃起[5],[6],[7]内皮一氧化氮合酶（eNOS）随后被窦腔和动脉内皮衬里上的持续剪切应力激活，继续产生内皮源性一氧化氮，从而维持阴茎勃起的持续阶段[6],[7],[8].

糖尿病患者血管和神经功能障碍的风险增加，自主神经病变和内皮功能障碍被认为是糖尿病ED的主要病因[9],[10]高血糖、氧化应激和脂质分布改变会导致血管并发症，包括外周神经灌注不足，这在糖尿病神经病变的病因中起着重要作用[11]NO介导的神经和内皮舒张功能受损首次被证明是糖尿病患者勃起组织ED的原因[12].从那时起，我体外试验和体内动物和人类的研究表明，功能失调的氮能系统是糖尿病ED的病理生理学基础，从而解释了糖尿病阳痿的起源[12],[13],[14],[15]因此，在1型糖尿病相关ED的动物模型中，神经元和内皮依赖性一氧化氮的海绵体平滑肌松弛减弱[13],[15],[16]同样，糖尿病前期肥胖Zucker大鼠（OZR）对盆腔神经刺激的勃起反应降低，海绵体组织中NANC神经介导的舒张功能受损[17]2型糖尿病db/db小鼠[18],[19]相反，据报道，在Goto-Kakizaki非肥胖2型糖尿病大鼠中，尽管勃起功能受损，但NANC-介导的身体放松增强，并建议将其作为克服阴茎前动脉供血受限的代偿机制[20].

虽然已经明确了一氧化氮介导的血管舒张反应受损，但糖尿病相关ED背后的氮能缺陷机制尚不清楚，NOS表达水平和活性降低[14]氮能神经对阴茎的选择性变性[15],[21]改变NO信号[20],[22]已被提议。我们最近证实了OZR阴茎内皮的内皮功能障碍和NO信号的改变[23],[24]代谢综合征/糖尿病前期相关ED的已建立模型[17].

本研究的目的是评估神经NANC氮能松弛的损伤是否也可能导致该模型中勃起功能的降低，如果是这样，则阐明氮能功能障碍的相关机制，特别是氧化应激的作用和NO信号的变化。

材料和方法

道德声明

该调查符合欧盟《实验动物护理和使用指南》（欧洲经济共同体指令86/609/EEC），所有实验方案均获得马德里Complutense大学动物护理和利用委员会的批准。

动物模型

外螺纹OZR(fa/fa，n=25）及其对照品Lean-Zucker大鼠（LZR）(fa/−，n=25）购买自查尔斯河实验室（西班牙巴塞罗那）8-10周龄。这些动物在17至19周龄时被安置在药学院动物护理设施中，在用于研究之前，可以随意食用标准的食物和水。

解剖和安装

通过颈椎脱位和脱臼杀死大鼠。如前所述，通过去除结缔组织和脂肪组织，仔细解剖了阴茎动脉，即LZR和OZR大鼠阴茎背动脉的一级或二级分支[23]通过将两根40µm钨丝插入血管腔内，阴茎背动脉段被切割成环形段，并平行安装在双微血管肌电图仪（丹麦Myotechnology，丹麦）中。安装后，将动脉在37°C的Krebs溶液中平衡30分钟，溶液成分如下（mM）：NaCl 119，NaHCO三25、KCl 4.7、KH2人事军官41.17，硫酸镁41.18，氯化钙21.5，乙二胺四乙酸0.027和葡萄糖11，用5%CO的混合物连续充气2/95%O2将pH值保持在7.4。确定了每根动脉的被动壁张力和内周之间的关系，由此得出内径l1计算得出的周长等于100 mmHg内压给出的周长的90%[23].

实验程序

使用Cibertec刺激器（西班牙巴塞罗那）通过平行于血管节段安装的两个电极进行电场刺激（EFS），刺激器具有恒定电流输出。在20 s的不同频率（0.5至16 Hz）的序列中施加持续时间为0.3 ms的平方脉冲。刺激器的电压被调整为35 mA。记录等长力的变化。在每个实验开始时，用120 mM K冲击动脉一次+（高K+-生理盐水溶液（KPSS），以验证制剂的收缩能力。为了评估NANC条件下神经刺激的松驰反应，将LZR和OZR的阴茎动脉与胍乙啶（10−5M） 加上阿托品（10−6M） ，分别抑制肾上腺素能和胆碱能反应，这些药物在整个实验过程中一直存在，以阻断NANC介导的反应。为了评估α-肾上腺素能神经介导的反应，在β-肾上腺素能阻滞剂普萘洛尔（10−6M） 在没有或存在非选择性NOS抑制剂N的情况下G公司-硝基-L-精氨酸（L-NOARG，10−4M） ●●●●。在动脉中检查血管内皮的作用，通过在血管腔内插入一根人发并来回引导几次来机械去除内皮。功能性内皮细胞的缺失是由乙酰胆碱（10−5M） ●●●●。

在苯肾上腺素（Phe）（10−6M） 预收缩动脉比较LZR和OZR阴茎动脉舒张。NOS抑制剂L-NOARG（10−4M） NO合成底物L-精氨酸（3×10−3M） 在进行第二和第三EFS曲线之前测试L-精氨酸加L-NOARG的。机械去除内皮细胞、N选择性抑制nNOS的作用W公司-丙基-L-精氨酸盐酸盐（L-NPA，3×10−6M） 超氧化物清除剂，如超氧化物歧化酶（SOD）模拟温度（3×10−5M） 和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH）的抑制剂罗布麻素（10−4M） 还评估了EFS在NANC条件下诱导的舒张作用。NOS辅因子四氢生物蝶呤（BH4，10）治疗阴茎动脉−4M） ，具有非活性立体异构体（6R，S）-5,6,7,8-四氢-D-新喋呤盐酸盐（NH4，10−5M） 作为阴性对照，并用BH4合成酶抑制剂GTP-环水解酶，2,4-二氨基-6-羟基嘧啶（GCH-I，3×10−4M） 还测试了EFS诱导的舒张作用。当使用拮抗剂或抑制剂时，在进行第二次浓度或频率响应曲线前30分钟引入药物，并调整Phe浓度以匹配第一次对照曲线期间的收缩。

为了评估内皮非依赖性松弛剂反应，对NO供体S-亚硝基-N-乙酰青霉胺SNAP（10−8–10−4M） 在Phe（10）中获得−6M） 在SOD模拟节律（3×10）存在或不存在的情况下，LZR和OZR的预收缩阴茎动脉−5M） 或NADPH氧化酶抑制剂，罗布青素（10−4M） ●●●●。

免疫组织化学

将含有阴茎背动脉的阴茎组织样本在4%多聚甲醛和0.1 M磷酸钠缓冲液（PB）中混合固定，在30%蔗糖和PB中冷冻，在液氮中速冻，并在−80°C下保存。通过低温恒温器获得10µm的横截面，并按照亲和素-生物素过氧化物酶复合物（ABC）方法进行处理[25]切片首先浸入1%H的混合物中2O（运行）2和90%甲醇在蒸馏水中浸泡30分钟，在PB中洗涤，在含有0.3%Triton-X-100的10%正常山羊血清中预孵育2–3小时。然后，用针对神经元型一氧化氮合酶（nNOS）N末端的兔多克隆抗体孵育切片（AB5380 Chemicon International Inc）稀释1∶500或用兔抗硝基酪氨酸多克隆抗体（ab42789 abcam）在4°C下稀释1∶100 48 h。然后在室温下用山羊（Chemicon International Inc）培养的生物素化抗兔血清（稀释1∶400）孵育切片2小时，然后用1∶100稀释的亲和素-生物素复合物（ABC，Vector）在室温下孵育90分钟。免疫复合物用0.05%3.3二氨基联苯胺（DAB）和0.001%在H中显示2O（运行）2单位PB。在没有初级抗血清的情况下培养的切片中未检测到免疫反应。

化学发光法测定超氧化物的产生

如前所述，在勃起组织中，通过亮精蛋白增强化学发光检测到海绵体中超氧化物基础水平的变化[26]从LZR和OZR中分离海绵体（4-5 mm长的条带），在室温下在Krebs缓冲液中平衡30分钟，然后在有或无ROS清除剂tempol（3×10−5M） 在37°C下保持30分钟。然后将海绵体转移到含有5×10的微孔板上−6用10缓冲的空气平衡克雷布斯溶液中的M亮氨酸（双-N-甲基吖啶硝酸盐）−2M HEPES-NaOH，在没有（对照）和存在tempol的情况下。化学发光在光度计（BMG Fluostar Optima）中测量，计算时从不同实验条件下的计数值中减去基线值，并将超氧物生成归一化为组织重量。

细胞内钙的测量2+（[钙2+]我)

同时测量[Ca2+]我如前所述，在完整的阴茎动脉中施力[27]将肌电图仪安装在倒置显微镜（Axiovert S100 TV）上，该显微镜配备有双激发波长显微荧光测定功能。阴茎动脉在37°C的PSS中与8µM呋喃2-乙酰氧基甲酯在黑暗中孵育3小时，1.5小时后改变溶液。然后清洗动脉45分钟，以去除剩余的呋喃-2乙酰氧基甲基酯。加载后，使用基于单色仪的系统（Deltascan，PTI）用340和380nm的交替光照射动脉。荧光发射检测波长为510 nm。在每个实验结束时，Ca2+-用25 mM Mn淬火后测定不灵敏信号2+，并且所获得的值是从实验期间所获得的值减去的。比率（R）F340/如果380作为[钙2+]我.

最初用KPSS刺激动脉以测试血管存活率。然后，NO供体SNAP的累积浓度响应曲线（10−8–10−4M） 在LZR和OZR与Phe（10−6M） ●●●●。

数据呈现和统计分析

结果表示为Nm−1张力或每根动脉对Phe或KPSS反应的百分比，即6-10根动脉（每只动物1-2根）的±SEM。动脉对松弛剂激动剂或EFS的敏感性以EF表示50或EC50值，其中pEF50是−logEF50和pEC50为−logEC50、EF50或EC50分别是激动剂的频率或浓度，要求产生50%的响应，并通过使用非线性交互式拟合程序（Graph Pad Prism 5.0，Graph Pad-Software Inc.，San Diego，CA，USA）对经典Hill方程抑制剂的频率响应曲线进行非线性曲线拟合来计算。EF公司50或EC50首先获得每条曲线的值，然后计算给定实验组的平均值。通过单因素方差分析或成对或非成对Student’st吨适当时进行测试。小于5%的概率水平被认为是显著的。

结果

一般参数

在实验时（17-18周龄），OZR显著重于LZR（分别为518±7 g和383±5 g，P（P）<0.0001，n=25）。我们报告称，在这个年龄段，OZR组的动物出现轻度高血糖、高胰岛素和血脂异常，总胆固醇和甘油三酯水平升高[23].标准化内腔直径，l1,OZR的阴茎动脉明显小于LZR（分别为124±4µm，n=49和144±4μm，n=22，P（P）<0.001). OZR组对KPSS的收缩减少（1.2±0.1 N/m，N=49），而LZR组（1.8±0.13 N/m，P（P）<0.001; n=52），表明动脉平滑肌收缩力改变。

一氧化氮介导的LZR和OZR阴茎动脉神经源性舒张

据报道，在糖尿病相关ED的几种模型中，神经源性血管舒张反应受损。与OZ相比，LZR的阴茎动脉中评估了氮能抑制性神经传递。在NANC条件下，EFS（0.5至16 Hz）在Phe预收缩的动脉中诱导频率依赖性舒张，与LZR相比，OZR显著降低(图1A和B). 因此EF50LZR和OZ分别为4.89±0.48（n=8）和3.14±0.40（P<0.005，n=7），与OZ的动脉相比，高频刺激（4至16Hz）在健康动脉中产生的舒张作用显著更大(图1B). 这表明肥胖动物阴茎动脉中的抑制性神经传递受损。

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OZR的阴茎动脉中NANC血管舒张药反应受损。

答：。显示EFS（0.5–16 Hz）在Phe（10−6M） 在非肾上腺素能非胆碱能（NANC）条件下，与LZR相比，OZR显著受损。B。LZR和OZR阴茎动脉对EFS舒张的平均频率响应曲线。数据显示为7条和9条动脉（每只动物1-2条）的平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01与LZR公司。

为了验证EFS松驰反应是否是氮能神经的特异性反应，测试了NO合成抑制剂和底物的作用。L-NOARG治疗（10−4M） 从LZR和OZR明显抑制EFS诱导的阴茎动脉舒张(图2). 急性给予NO合成底物L-精氨酸（3×10−3M） 显著逆转了L-NOARG在两组中诱导的抑制作用(图2A和B)L-精氨酸在肥胖动物动脉中的作用更大，这些动物的一氧化氮依赖性舒张恢复到与对照动脉相似的水平(图2D). 这些结果表明，EFS在勃起过程中诱导的阴茎动脉血管扩张主要由NO生成介导，OZR受损。与NO-介导的神经原性反应相比，LZR和OZR之间NO供体SNAP诱导的舒张反应没有显著差异(图2E)，pEC50LZR中的值为6.30±0.21（n=7），6.39±0.18（n=7；P（P）>0.05）。这些结果表明，NO神经原性反应减少是由于肥胖大鼠阴茎动脉中NO生物利用度受损所致。

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NO-介导的神经血管舒张药反应受损，但OZR的阴茎动脉对NO供体SNAP的舒张药反应未发生改变。

A、 B。显示NOS抑制剂（L-NOARG，10）作用的代表性痕迹−4M） 以及L-NOARG与NO合成底物L-精氨酸（L-精氨酰，3×10−3M） LZR和OZR阴茎动脉EFS频率依赖性舒张（0.5–16 Hz）。L-精氨酸的急性治疗使OZR的神经NO-介导反应恢复到LZR的控制水平。C、 D。NOS阻断和L-精氨酸对LZR和OZR阴茎动脉EFS舒张作用影响的平均频率响应曲线。E.公司。来自OZR的阴茎动脉对NO供体SNAP的松弛反应没有改变。SNAP松弛作用的浓度响应曲线（10−8–10−4M） LZR和OZR的阴茎动脉。结果是6-8条动脉的平均±SEM。一P＜0.05，b条P<0.01，c（c）P<0.001与控制；d日P<0.05，e（电子）P＜0.01，（f）P<0.001与经L-NOARG处理。

考虑到阴茎主要通过交感神经激活和血管收缩剂去甲肾上腺素的释放维持在松弛状态，我们接下来评估NO在EFS诱导的肾上腺素能收缩中的作用。在普萘洛尔（10−6M） 为了抑制β-肾上腺素能受体，EFS诱发频率依赖性收缩，而肾上腺素能毒素胍乙啶（未显示）可消除这种收缩，OZR可显著增强阴茎动脉的收缩(图3A)提示对α肾上腺素能刺激的敏感性增强。因此，EF50数值分别为18.5±0.8（n=7）和17.5±1.3（n=7；P（P）>0.05），最大效应29±3%（n=7）和46±7%（n=8；P（P）KPSS诱导的收缩，LZR和OZR分别为<0.05）。通过NOS阻滞剂L-NOARG的治疗，EFS诱导的血管收缩增强(图3B和C)OZR阴茎动脉的这种增强作用较小(图3C). 因此，在LZR和OzrNOS阻断后，由EFS在16Hz下诱导的收缩反应分别增强了4.5倍和2倍。这些结果表明，在基础条件下，NO调节阴茎肾上腺素能血管收缩，并证实肥胖动物动脉中NO生物利用度降低。

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部分由于NO释放受损，OZR阴茎动脉的神经血管收缩反应增强。

答：。LZR和OZR阴茎动脉的平均EFS频率依赖性收缩（1–32 Hz）。B、 C、。抑制NO合成大大增强了LZR和OZR对EFS激动剂的神经血管收缩反应。NOS抑制剂L-NOARG的作用（10−4M） LZR和OZR阴茎动脉EFS频率依赖性收缩。结果是6-8条动脉的平均±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与控件。

阴茎动脉中的nNOS神经

糖尿病血管组织中NO生物利用度降低可能是由于一氧化氮合酶含量或活性的改变导致NO合成减少。用抗nNOS多克隆抗体对横断动脉切片进行免疫染色，发现nNOS不仅在血管外膜周围神经中定位较高，而且在阴茎动脉内皮衬里中定位也较高(图4A和B). 与LZR大鼠相比，在OZR的阴茎动脉中未观察到这种组成性NOS亚型的存在或分布差异(图4A和B).

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来自nNOS的NO有助于LZR阴茎动脉的神经介导舒张，但不参与OZR。

A、 B。血管周围神经纤维中nNOS存在的免疫组织化学显示：在LZR和OZR阴茎动脉的外膜（箭头）和内皮细胞层（箭头）中。注意nNOS免疫反应在LZR和OZ中的定位相似。C、 D。N对nNOS的选择性抑制W公司-丙基-L-精氨酸盐酸盐（L-NPA，3×10−6M） 减少了LZR而非OZR阴茎动脉EFS频率依赖性舒张。。E、 F、。在LZR和OZ切除内皮的阴茎动脉中，EFS频率依赖性舒张没有改变。结果是5-7条动脉的平均±SEM*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与控件。

nNOS在NO介导的阴茎动脉神经源性舒张中的作用

L-NPA（3×10）对nNOS的选择性抑制−6M） 导致EFS诱导的LZR阴茎动脉舒张显著减少(图4C)表明nNOS衍生NO有助于健康阴茎动脉的神经源性舒张。相反，抑制nNOS并没有减少而是改善OZR动脉低频EFS的舒张(图4D)这表明nNOS活性可能受损，这种酶会在肥胖动物的动脉中释放收缩因子。

机械去除内皮细胞不会改变LZR或OZR动脉对EFS的舒张反应(图4E和F)这初步排除了内皮型NOS产生的NO对EFS诱导的OZR和LZR阴茎动脉舒张的任何重要贡献。

超氧化物产生在OZ受体阴茎动脉受损的神经源性NO介导反应中的作用

接下来，我们研究了NO介导的反应减少是否是ROS增加NO消耗的结果。用超氧化物歧化酶模拟物tempol（3×10）孵育动脉进行急性抗氧化治疗−5M） 不影响内源性神经源性NO在对照动脉中诱导的舒张反应(图5A)也不能恢复肥胖动物动脉中EFS引起的受损NO-介导反应(图5B). 然而，用NADPH氧化酶抑制剂-罗布青素（10−4M） 减少超氧物的产生显著改善了OZR动脉中的EFS氮能弛豫，并将这种反应恢复到与LZR相似的值(图5C和D)表明NADPH氧化酶衍生超氧化物的产生增加抑制肥胖动物动脉中的神经源性舒张。在LZR或OZR的阴茎动脉中进行tempol治疗后，对NO供体SNAP的舒张没有改变，但在OZR中进行罗布青素孵育后得到改善(图5E和F).

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NADPH氧化酶抑制可恢复OZR阴茎动脉受损的神经松弛反应。

A、 B。超氧物清除剂温度（3×10−5M） 对EFS诱导的神经no-介导的舒张作用均无影响。C、 D。NADPH氧化酶抑制剂罗布青素（10−4M） 恢复了OZR动脉的EFS氮能松弛。E、 F、。tempol和apocynin对NO供体SNAP松弛反应的影响（10−8–3×10−5M） LZR和OZR的阴茎动脉。结果是6-11条动脉的平均±SEM*P<0.05，**P<0.01与控件。

另一方面，通过阴茎动脉和海绵体切片中增强的3-硝基酪氨酸染色，免疫组化研究证明肥胖大鼠勃起组织中ROS生成增加。3-硝基酪氨酸免疫反应主要定位于阴茎动脉的内皮内层(图6B)以及海绵窦间隙的内皮层(图6D)，并且最终可能被发现局限于OZ R阴茎动脉中层的小病灶(图6B). 在对照LZR的勃起组织中未观察到3-硝基酪氨酸染色或轻微染色(图6A和C). 通过荧光素化学发光法测量基础超氧物的生成，证实了与LZR相比，OZR海绵体组织中超氧物生成增加(图6E). tempol预孵育（3×10−5M） LZR和OZR阴茎海绵体组织中勃起组织的化学发光显著降低(图6E)，确认超氧化物的特异性(图6E).

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OZR勃起组织中过氧亚硝酸盐和超氧物生成的硝基酪氨酸免疫染色升高。

A–D。硝基酪氨酸免疫反应在OZR中强烈，主要分布于阴茎动脉（B）和海绵体间隙（D）的内皮细胞层（箭头），最终分布于动脉平滑肌（箭头）和靠近动脉的神经干（双箭头）（B）。LZR阴茎动脉（A）和海绵体（C）中的硝基酪氨酸免疫反应轻微。E.公司。用荧光素增强化学发光法检测LZR和OZR海绵体组织中碱性超氧化物的产生。天妇罗的作用（3×10−5M） 以每毫克组织每分钟计数（cpm）表示的基础上产生的超氧化物。数据显示为6-7个海绵体样本的平均值±SEM*P<0.05，**P<0.01与控件。††P<0.01与LZR公司。

一氧化氮合酶辅因子BH4和GCH-I抑制剂对一氧化氮介导的神经源性舒张的影响

NO生物利用度降低可能是由于氧化应激增强和NOS辅因子BH4水平降低导致NOS解偶联到NO合成的结果。通过药物补充增加血管BH4水平可提高从头开始或NO的循环生物合成。用BH4（10）预孵育阴茎动脉−4M） 将OZR阴茎动脉中神经源性NO-介导的血管扩张恢复到与对照动脉相似的水平(图7B)对LZR EFS诱导的舒张作用无影响(图7A)表明BH4减少可能是OZR中NO神经源性舒张功能受损的原因。为了排除BH4的任何抗氧化作用，NH4被用作阴性对照，因为这种蝶呤具有BH4的抗氧化作用，但对NOS解偶联没有影响。添加NH4（10−5M） 对EFS诱导的LZR或OZR舒张没有影响(图7C和D). 用BH4合成酶抑制剂培养GCH（2,4-二氨基-6-羟基嘧啶，3×10−4M） LZR显著降低NO介导的阴茎动脉神经源性舒张，而OZR则无此作用(图7E和F)因此，支持肥胖动物神经源性阴茎松弛受损可能是由于GCH活性降低导致辅因子BH4水平降低和nNOS解偶联。

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BH4从OZR恢复受损的神经NO-介导的阴茎动脉血管舒张。

一氧化氮合酶辅因子BH的作用4(10−4M）(A、 B类)非活性蝶呤NH4（10−5M）(C、 D类). BH4合成酶抑制剂GTP-环水解酶-I（GCH-I，3×10−4M）(E、 F类)EFS对LZR和OZR阴茎动脉的舒张作用。结果是6-7条动脉的平均±SEM*P<0.05，**P<0.01与LZR公司。

NO钙信号的变化

为了评估氧化应激增强是否会损害OZR阴茎动脉的NO信号通路，尽管保留了NO诱导的舒张作用2+]我对LZR和OZR的动脉进行张力测定。高钾对LZR和OZ刺激阴茎动脉的作用+溶液（KPSS）诱导两种[Ca同时增加2+]我（Δ（F340/如果380)LZR中=0.23±0.06，n=5，OZR中0.31±0.05，n=6，P（P）>0.05）和张力（1.87±0.50 Nm−1，n=5英寸LZR和1.37±0.19牛米−1，n=6英寸OZR，P（P）>0.05) (图8A和C). α1-肾上腺素受体激动剂Phe（10−6M） 还诱发[Ca持续增加2+]我（Δ（F340/如果380)LZR中=0.19±0.04，n=5，OZR中0.22±0.03，n=6，P（P）>0.05）和张力（2.05±0.47 Nm−1，n=5英寸LZR和1.84±0.28牛米−1，n=6英寸OZR，P（P）>0.05) (图8A和C).

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OZR的阴茎动脉中NO钙信号受损。

A、 C、。[Ca的同时记录2+]我（顶部）和张力（底部）显示NO供体SNAP的作用（10−8–10−5M） 来自LZR（A）和OZR（C）的Phe-precontracted阴茎动脉。B、 D。显示[Ca变化的汇总数据2+]我以及对SNAP的反应力，以及[Ca的受损下降2+]我针对OZR（D）中应用的最高浓度（10µM）SNAP。响应是F增长的百分比340/如果380Phe引起的收缩。结果是5-6条动脉的平均±SEM。†P<0.05与LZR公司。

NO供体SNAP（10−8–10−5M） 在预先收缩的动脉中，Phe伴随着[Ca同时降低2+]我尤其是在LZR阴茎动脉中SNAP浓度最高时(图8A和B). 相反，[Ca的减少2+]我SNAP诱导的OZ受体动脉受损(图8C和D)而舒张作用与对照动脉无差异(图8C和D). 因此，在最高浓度下（10µM），SNAP降低了[Ca2+]我LZR为70±9%，35±12%(P（P）<0.05）Phe引起的OZR阴茎动脉收缩(图8B和D).

讨论

由于来自NANC神经和内皮的NO对阴茎勃起至关重要，因此氮能系统的功能障碍在血管生成性ED的病理生理学中起着关键作用。本研究表明，由于氧化应激和胰岛素抵抗OZR阴茎动脉中nNOS解偶联，神经NO-介导的松驰反应发生改变。这种功能障碍可能与内皮功能障碍有关，内皮功能障碍也涉及NO信号的改变[23],[24]在代谢综合征/糖尿病前期模型中发现勃起反应降低[17].

糖尿病阳痿男性的阴茎海绵体和1型糖尿病动物模型的阴茎一直显示出选择性氮能功能障碍的发展[12],[13],[15],[21]而据报道，氮能神经放松要么不足[18],[19]或增强以补偿勃起反应的改变[20]胰岛素抵抗/2型糖尿病模型。本研究表明，来自OZR的阴茎动脉中NANC抑制性神经传递显著受损，这与减少体内代谢综合征模型中盆腔神经刺激的勃起反应[17]这些神经松弛剂反应在很大程度上被非选择性NOS阻断所抑制，并且这种抑制通过与NO合成底物L-精氨酸孵育而逆转，这一事实表明NO是参与这些神经介导的松弛剂的主要神经介质。另一方面，内皮细胞去除效果的缺乏，以及选择性nNOS阻断对EFS诱导的健康阴茎动脉舒张的抑制，表明神经源性舒张是由主要来源于神经性nNOS的NO介导的。然而，选择性nNOS抑制并没有减少，相反地倾向于改善OZR中受损的EFS诱导的松驰反应，因此表明nNOS对神经源性松驰的贡献受损，并且该酶似乎在肥胖动物中释放了一种收缩因子。

糖尿病的血管功能障碍包括血管收缩增强，这被归因于异常的平滑肌反应性或内皮功能障碍。交感神经通过释放收缩血管的去甲肾上腺素收缩动脉和鼻窦的平滑肌，负责阴茎的消肿[5],[6]根据胰岛素抵抗/2型糖尿病动物模型报道的对去甲肾上腺素能刺激引起勃起反应降低的高度收缩敏感性，本研究显示，胰岛素抵抗OZR对阴茎动脉的神经刺激引起的去甲肾上腺素血管收缩增强[17],[18]有趣的是，这种增强的血管收缩似乎部分是由于氮能系统功能失调所致，如NOS阻断对OZR引起的阴茎动脉肾上腺素能收缩的影响较小所示。在LZR中，NO合成的抑制大大增强了神经去甲肾上腺素诱导的收缩，从而表明NO在健康动脉中对抗去甲肾上腺素反应，并支持早期的研究，即氮能神经调节人类阴茎勃起组织中的交感血管收缩[28]随后，如本研究所示，NO信号改变可能导致胰岛素抵抗条件下勃起反应受损，不仅损害NO诱导的血管扩张，还增强去甲肾上腺素介导的抗勃起作用。

在本研究中，神经NO-介导的血管舒张反应减少，并没有伴随OZR对阴茎动脉中NO供体SNAP的舒张减少，这最初表明平滑肌中NO信号完整，但NO生物利用度受损。后者可能是NO合成和活性降低的结果，反过来又是由于NOS酶含量或活性的改变。据报道，1型糖尿病动物阴茎中nNOS表达和活性降低，同时勃起功能降低[14],[15],[21],[29]其中，神经纤维中nNOS的丢失和氮能功能障碍证明了选择性氮能退化[15],[21]在本研究中，未观察到OZR阴茎动脉血管周围含nNOS神经的明显变化，这与该模型中阴茎nNOS蛋白含量缺乏变化一致[17]以及其他2型糖尿病模型[20]有趣的是，nNOS也定位于健康和胰岛素抵抗肥胖动物的阴茎内皮细胞，这与糖尿病大鼠海绵体的早期报道一致[29]并支持血管组织的功能发现，表明内皮依赖性血管扩张可能至少部分依赖于nNOS相关机制[30].

活性氧（ROS）生成增强是糖尿病血管并发症和冠状动脉疾病发病的主要因素，并被认为与糖尿病大鼠心脏和阴茎的自主神经功能障碍有关[31],[32]NOS功能和NO生物利用度的改变主要归因于血管超氧化物的产生、NADPH氧化酶的激活、功能失调的eNOS和线粒体电子传递链，它们是ROS生成的主要来源[33]本研究的结果表明，NADPH氧化酶衍生的ROS生成增强可能干扰NO信号传导，从而损害OZR动脉中NO-介导的神经源性松驰反应，如超氧化物水平增加和NADPH氧化酶抑制剂罗布麻素对肥胖动物勃起组织中外源性和神经源性NO诱导的松弛作用的有益作用所示。

血管组织产生的超氧化物及其与NO的相互作用可能产生强大的氧化性和剧毒的过氧亚硝酸盐自由基，导致DNA、蛋白质和脂质的氧化损伤，eNOS解偶联，细胞凋亡增加，组织损伤和炎症[33]糖尿病神经病变与神经细胞内代谢紊乱直接或血管功能障碍间接引起的亚硝化应激有关[15],[21],[34]在本研究中，通过主要发现于阴茎动脉血管内皮的增强硝基酪氨酸免疫染色，证实OZR阴茎勃起组织中存在亚硝化应激，胰岛素抵抗型OZR患者的阴茎内海绵状间隙内壁的内皮细胞，以及靠近动脉和窦的神经干。

过氧亚硝酸盐可氧化并降低NOS辅因子BH4的可用性，还可减少eNOS底物L-精氨酸的细胞转运，导致eNOS解偶联。未偶联的eNOS产生超氧物而非NO，继续改变血管内皮细胞和平滑肌细胞的细胞信号传递过程[35],[36],[37]eNOS解偶联和内皮功能障碍最近在高胆固醇血症和年龄相关性ED模型中得到证实[38],[39]; 然而，关于非偶联nNOS引起神经和血管功能障碍的信息有限。我们的结果表明，阴茎循环中的氮能血管舒张反应异常可能是由于nNOS解偶联导致NO生成减少所致。因此，与NO合成底物L-精氨酸孵育或添加NOS辅因子BH4，可将刺激阴茎动脉神经引起的氮能松弛从OZR恢复到与健康动脉相似的水平。事实上，添加BH4可以恢复肥胖动物受损的NO-介导的神经反应，这表明NOS解偶联是因为BH4相对缺乏。此外，选择性nNOS抑制剂改善神经松弛剂反应的矛盾作用以及缺乏去除肥胖动物动脉内皮细胞的效果，进一步表明神经nNOS亚型可能解偶联并产生超氧阴离子而不是NO，超氧物反过来又充当血管收缩因子。

由于ROS不仅直接将eNOS辅因子BH4氧化为BH2，而且还触发BH4合成中速率限制酶的蛋白酶体依赖性降解，GCH-I[40]，我们评估了GCH-I阻滞对阴茎动脉神经松弛的影响。该治疗仅显著抑制了LZR中EFS诱导的血管舒张，但不抑制OZR，表明GCH-I酶功能改变是BH4缺乏和OZR中nNOS解偶联的原因。这些发现与最近发现的胰岛素抵抗OZR导致脑动脉GCH表达减少以及eNOS和nNOS解偶联导致ROS生成增加相一致[41].

另一方面，L-精氨酸对OZR阴茎动脉神经刺激后受损的血管舒张反应的增强作用与早期研究一致，研究表明，饮食中补充L-精氨酰，以及急性输注L-精氨酸可改善糖尿病和老年大鼠阴茎中NO的释放，增强内皮和神经依赖性舒张[42],[43],[44]在实验性糖尿病动物中，L-精氨酸的血浆浓度和血管含量降低[45]以及糖尿病患者[46]在本研究中，急性L-精氨酸给药对NO-介导的神经松弛剂反应的有益影响最初表明，在代谢综合征条件下，阴茎动脉中的L-精氨酸缺乏。由于过氧亚硝酸盐可以通过对L-精氨酸转运体CAT-1的亚硝化作用减少L-精氨酸运入细胞[47]胰岛素抵抗OZR勃起组织中发现的氧化应激和高水平过氧亚硝酸盐可能解释了L-精氨酸对恢复NO-介导的神经反应的急性作用。

最后，目前的结果表明，尽管OZ引起的阴茎动脉中外源性NO引起的舒张作用没有改变，但平滑肌中的NO信号传导受损。因此，NO舒张反应伴随着细胞内Ca的减少2+可能是钙激活的结果2+和/或电压相关K+通道和随后的超极化[48],[49]而在胰岛素抵抗动物的动脉中，NO-合法舒张对细胞内Ca变化的依赖性显著降低2+表明钙的贡献更大2+-独立机制。NO的血管舒张作用部分由钙介导2+通过抑制RhoA诱导的钙的独立机制2+敏化与肌动蛋白细胞骨架组织[50]因此，Ca的主要参与2+OZR中NO血管舒张作用的脱敏机制可能归因于动脉钾离子受损+过氧亚硝酸盐的通道功能[51],[52]和/或增强RhoK活性，如糖尿病动物的阴茎所示[53]在增广的Ca中2+胰岛素抵抗的OZR对阴茎动脉血管收缩的致敏作用[54]因此，氧化应激导致RhoK活性增强[55]可能参与胰岛素抵抗条件下勃起组织NO信号的变化。

持续的高血糖是1型和2型糖尿病的标志，被认为是导致氧化应激和信号改变的驱动力，这些信号改变会损害阴茎神经和内皮细胞，并降低nNOS和eNOS活性和NO生成。在胰岛素抵抗/2型糖尿病的高血糖模型中，勃起功能受损伴有轻微的[18]或nule[20]神经一氧化氮介导的松弛剂反应受损，这表明功能性改变的一氧化氮介导信号与2型糖尿病高血糖模型中ED的发生没有太大的病理生理相关性。相反，OZR只显示轻微的高血糖，但血脂异常，同时勃起功能受损[17],[23].目前的结果首先表明，氧化应激和nNOS解偶联导致勃起组织的NO介导神经松弛受损，这与内皮功能障碍有关[23],[24]在代谢综合征条件下，可能导致ED。流行病学研究已确定血脂异常是糖尿病神经病变的一个独立的、潜在的可改变因素[11]它也是血管性ED的已知危险因素[2]本研究证实，在代谢综合征和脂质代谢异常的情况下，由nNOS解偶联和氧化应激引起的氮能功能障碍是ED的发病机制之一[38].

致谢

我们感谢Manuel Perales和Francisco Puentes提供的专业技术援助。

脚注

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

基金：本研究得到了西班牙科学与创新部长Grant n°SAF2009-10448的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

工具书类

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