胰腺β细胞中HGF/c-Met信号传导的缺失导致母体β细胞不完全适应和妊娠期糖尿病

葡萄糖稳态。

使用便携式血糖仪（马萨诸塞州贝德福德市Medisense）分析眼眶后出血获得的血液中的葡萄糖，并使用放射免疫分析法分析血浆胰岛素（密苏里州圣路易斯市Linco Research）(11). 对禁食16-18小时注射2克葡萄糖/千克体重的小鼠进行腹膜内葡萄糖耐量试验，对随机喂养的小鼠注射1.5单位人胰岛素/千克体重（胡姆林；印第安纳波利斯礼来）进行胰岛素耐量试验(12).

GSIS和胰岛胰岛素含量。

在5或20 mmol/L葡萄糖中孵育30分钟后，测量10个胰岛当量（IEs）（1个IE=125μm直径）的胰岛素释放(12). 胰岛素分泌结果以胰岛总胰岛素含量的百分比表示。在70%乙醇中0.18 mol/L HCl均质的胰岛中测量胰岛素含量，并在−20°C下提取24小时。试管在4°C下以2500 rpm离心10分钟，上清液在−2°C下保存，直到通过放射免疫法测定胰岛素为止(11).

免疫组织化学、组织形态计量学和β细胞大小、凋亡和5-溴-2-脱氧尿苷掺入。

如前所述，对石蜡包埋胰腺切片进行胰岛素和5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU）免疫染色（Amersham，Piscataway，NJ）(11,14). 使用ImageJ软件（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）在每只小鼠的三个胰岛素染色胰腺切片中测量β细胞质量(11,14). 使用奥林巴斯CH2直立显微镜和眼内校准网格，以盲法手动定量这三个胰岛素染色切片中的胰岛数量(22).

在腹腔注射BrdU的小鼠胰腺切片中测量BrdU在β细胞中的掺入，6小时后处死，并对胰岛素和BrdU进行染色(11). 用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记（TUNEL）方法（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）对胰腺切片进行胰岛素染色，测定β细胞死亡(15). 胰岛图像是在共聚焦奥林巴斯Fluoview 1000（匹兹堡大学生物成像中心）上获得的。β-细胞大小如前所述测定(22). 使用先前描述的方法对STAT5（Cell Signaling，Danvers，MA）和p27（BD Pharmingen，San Jose，CA）进行免疫染色(15).

胰岛分离和实时PCR。

如前所述，通过胰管注射胶原酶P后分离小鼠胰岛(11). 人类胰岛由综合胰岛分布计划和青少年糖尿病研究基金会基础科学胰岛分布计划提供。使用特定引物（引物序列可按要求提供）通过实时PCR对c-Met、叉头盒M1（FoxM1）、胰岛素、GLUT2、葡萄糖激酶和Pdx-1 mRNA表达进行分析(15).

循环HGF水平。

使用ELISA（马萨诸塞州坎布里奇Abcam）并按照制造商的说明，从怀孕和非怀孕野生型小鼠的血清中测量HGF水平。

蛋白质印迹分析。

小鼠胰岛提取物在7.5-12%SDS-PAGE上分离，转移到Immobilion-P膜（Millipore，Bedford，MA）上，封闭在5%脱脂奶粉中，然后与抗c-Met和催乳素（PRL）受体（PRLR）的一级抗体（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）、p27（BD Pharmingen）、微管蛋白（Calbiochem，La Jolla，CA）一起孵育，和HGF（研发系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州）。经过几次洗涤后，用过氧化物酶结合的二级抗体培养印迹，然后进行化学发光检测（Amersham）(15).

胰岛细胞培养和β细胞死亡的测定。

如前所述培养小鼠和人类胰岛细胞(14)用不同剂量的地塞米松和HGF孵育24小时，然后固定在2%多聚甲醛中。通过TUNEL分析、胰岛素和DAPI染色测定β细胞死亡。每孔至少计数2000个β细胞。图像是在共聚焦奥林巴斯Fluoview 1000显微镜上获得的。

HGF/c-Met信号通路是妊娠期间母亲β细胞扩增所必需的。

成年PancMet KO小鼠在基础条件下表现出正常的葡萄糖稳态、β细胞质量和增殖(15). 为了探讨HGF/c-Met信号是否对妊娠期间母体β细胞的扩增很重要，我们分析了8至10周龄妊娠和非妊娠雌性PancMet KO小鼠和野生型同卵鼠的β细胞质量。两种小鼠的体重和整个妊娠期的平均子代数没有显著差异(图2A类和B类). GD11和-15以及非妊娠状态下的β细胞质量也相似(图2C类). 相反，当正常怀孕小鼠出现最大β细胞质量膨胀时，PancMet KO小鼠在GD19时表现出显著的β细胞质量下降(23–27) (图2C类). 产后第4天，β细胞质量持续下降(图2C类). 最近的研究表明，怀孕小鼠的胰岛数量增加(27)而PancMet KO小鼠在GD19时表现出β细胞质量下降，我们在两种类型的怀孕小鼠中量化了这一参数。在GD19时，在野生型和PancMet KO小鼠之间未观察到胰岛数量的改变(图2D类)表明胰岛大小而非胰岛总数量的减少可能是怀孕PancMet KO小鼠β细胞质量减少的原因。

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图2。

妊娠期PancMet KO小鼠的β细胞不完全膨胀。A类：妊娠、PPD4、非妊娠（NP）野生型（WT）和PancMet KO小鼠在不同妊娠日的体重。结果是非孕妇的平均值±SEM(n个=7）和怀孕(n个=4–8）只小鼠*P（P）与相同基因型的非妊娠小鼠相比，<0.05。B类：妊娠期间野生型产仔数(n个=24）和PancMet KO(n个=20）只小鼠。未发现显著差异。C类：代表性显微照片(顶部面板)非妊娠和妊娠（GD19）野生型和PancMet-KO小鼠胰腺切片的胰岛素染色（棕色）和苏木精-伊红复染。β细胞质量的量化(底部面板)孕妇、PPD4和非孕妇野生型(n个=4–8）和PancMet KO(n个=4–7）只小鼠。结果为平均值±SEM*P（P）与相应基因型的非妊娠小鼠相比，<0.05^P（P）在相同GD或PPD4下，与野生型相比<0.05。D类和E类：每个胰腺区域的胰岛数(D类)非妊娠和GD19妊娠野生型的β细胞大小(n个=6–8）和PancMet KO(n个=5–7）只小鼠(E类). 结果为平均值±SEM*P（P）与相应基因型的非妊娠小鼠相比，<0.05。（该图的高质量彩色表示可在在线期刊上找到。）

HGF/c-Met信号通路是孕期母亲β细胞增殖所必需的。

然后，我们探讨了在怀孕的PancMet KO小鼠中观察到的β细胞大小、增殖和凋亡的改变是否有助于β细胞扩张受损。在GD19时，PancMet KO和野生型小鼠的β细胞大小相似(图2E类)表明β细胞大小的变化与在此胎龄时在PancMet KO小鼠中观察到的不完全β细胞质量膨胀无关。在GD11和GD19时，未怀孕或怀孕的PancMet KO和野生型窝友的β细胞增殖没有显著差异(图3E类). 然而，在GD15时，当小鼠出现最大β细胞增殖时(23–27)，与野生型小鼠相比，PancMet KO小鼠的β细胞复制显著减少(图3A类–E类). 这些结果表明，β细胞中的HGF/c-Met信号传导是妊娠期适应性β细胞复制和质量扩张所必需的。此外，在PPD4时，PancMet KO小鼠的β细胞复制也显著降低(图3E类)当这些小鼠的β细胞质量降低时(图2C类).

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图3。

妊娠期PancMet KO小鼠的β细胞增殖。A类–D类：非孕妇（NP）的代表性显微照片(A类和B类)并且怀孕了(C类和D类)（GD15）野生型（WT）和PancMet-KO小鼠胰腺切片，胰岛素（绿色）和BrdU（红色）染色。箭头表示BrdU阳性的β细胞核。E类：孕妇、PPD4和非孕妇野生型中BrdU阳性β细胞百分比的量化(n个=4–8）和PancMet KO(n个=4–7）只小鼠。结果为平均值±SEM*P（P）与相应基因型的非妊娠小鼠相比，<0.05^P（P）在相同GD或PPD4下，与野生型相比<0.05。（该图的高质量数字表示可在在线期刊上获得。）

HGF/c-Met信号调节妊娠期间胰岛PRLR水平。

通过PRLR的胎盘催乳素（PL）/PRL信号是妊娠期间母亲适应性增加β细胞增殖所必需的(1,26). 由于怀孕的PancMet KO小鼠在GD15时表现出β细胞增殖降低，我们在妊娠当天测量了野生型和PancMet-KO小鼠胰岛中的PRLR水平。非妊娠和妊娠PancMet KO小鼠的胰岛PRLR mRNA均显著下调(图4A类). 重要的是，Western blot分析还显示，PancMet KO小鼠胰岛在GD15时PRLR降低，而非妊娠小鼠的PRLR水平没有显著差异(图4B类). PRL通过磷酸化/活化和增强STAT5的核定位来增加β细胞增殖(28). 野生型小鼠GD15胰腺切片中的胰岛素和STAT5联合免疫抑制清楚地显示了该转录因子在β细胞中的核定位(图4C类). 然而，在GD15时，PancMet KO小鼠胰岛在β细胞中显示几乎唯一的细胞质STAT5染色(图4C类)这表明妊娠期PancMet-KO小鼠胰岛PRLR的降低可能导致胰岛PL/PRL信号减少，STAT5激活减少，从而导致母体β细胞增殖减少。转录因子FoxM1是PRL细胞周期靶点，在妊娠期间调节母体β细胞的扩增(24). 重要的是，与野生型小鼠胰岛相比，GD15的PancMet KO小鼠胰岛未能上调FoxM1 mRNA的表达(图4D类). 此外，细胞周期素依赖性激酶抑制剂Cip/Kip家族成员p27的下调与妊娠期FoxM1上调和β细胞增殖增强有关(23,24). 如前所示，与未怀孕小鼠相比，GD15时野生型小鼠的胰岛显示p27显著降低(图4E类) (23,24). 在GD15时，在PancMet KO小鼠中未观察到这种减少(图4E类). GD15时野生型和PancMet KO小鼠胰腺切片的胰岛素和p27共免疫组化显示，与野生型同胞相比，PancMet-KO小鼠β细胞中p27的表达增加(图4F类). 总之，这些结果表明，妊娠期间β细胞的增殖、PRLR水平、STAT5核定位和细胞周期调节需要HGF/c-Met信号。

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图4。

妊娠期PancMet KO小鼠胰岛显示β细胞中参与细胞周期进展的标记物水平和/或细胞定位发生改变。A类：实时PCR分析非妊娠（NP）和妊娠（GD15）野生型（WT）胰岛总RNA中PRLR mRNA的表达(n个=3–4）和PancMet KO(n个=4-5）只小鼠。结果为平均值±SEM*P（P）与相应基因型的非妊娠小鼠胰岛相比，<0.05^P（P）在相同GD、HPRT、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶下，与野生型相比<0.05。B类：非妊娠和妊娠（GD15）野生型胰岛蛋白提取物中PRLR的Western blot(n个=4）和PancMet KO(n个=4）小鼠。结果为平均值±SEM^P（P）<0.05，与同一GD的野生型相比。C类：孕鼠（GD15）野生型和PancMet-KO小鼠胰腺切片的代表性显微照片，胰岛素染色（绿色）和STAT5染色（红色）。请注意，STAT5在野生型胰岛中的核定位，而PancMet-KO胰岛中没有这种野生型。D类：实时PCR分析从非妊娠和妊娠（GD15）野生型胰岛分离的胰岛总RNA中FoxM1 mRNA的表达(n个=3–4）和PancMet KO(n个=4-5）只小鼠。结果为平均值±SEM*P（P）与相应基因型的非妊娠小鼠胰岛相比，<0.05^P（P）<0.05，与同一GD的野生型相比。E类：非妊娠和妊娠（GD15）野生型胰岛蛋白提取物中p27表达的Western blot分析(n个=4–5）和PancMet KO(n个=4-5）只小鼠。结果为平均值±SEM*P（P）与相应基因型的非妊娠小鼠胰岛相比，<0.05^P（P）<0.05，与同一GD的野生型相比。F类：胰岛素（绿色）和p27（红色）染色的妊娠（GD15）野生型和PancMet-KO小鼠胰腺切片的代表性显微照片。注意PancMet-KO胰岛中p27的染色强度增加。（该图的高质量数字表示可在在线期刊上获得。）

胰腺HGF/c-Met信号缺失导致母体β细胞过早凋亡。

β-细胞死亡发生在妊娠末期和产后早期，以使扩大的母体β-细胞质量正常化(1,29). 根据我们之前的观察，β细胞中HGF/c-Met信号缺陷导致对链脲佐菌素和细胞因子诱导的细胞死亡的敏感性增强(15)，我们检测了妊娠期间PancMet-KO小鼠的β细胞凋亡是否发生改变。如所示图5C类野生型和PancMet KO小鼠在GD19和PPD4时，与未怀孕的同窝小鼠相比，β细胞凋亡显著增加。然而，与相同胎龄的非妊娠小鼠或妊娠野生型小鼠相比，GD15时PancMet KOβ细胞的凋亡提前且显著增加(图5A类–C类). 这表明，β细胞中HGF的促生殖器效应是妊娠期间母体β细胞适当扩增所必需的。

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图5：。

妊娠期PancMet KO小鼠GD15时β细胞死亡增加。A类和B类：妊娠期PancMet KO小鼠和野生型（WT）同窝鼠GD15胰岛的代表性显微照片，胰岛素染色（红色）和TUNEL染色（绿色）。箭头表示TUNEL阳性的β细胞核。C类：量化妊娠、PPD4和非妊娠（NP）野生型中TUNEL阳性β细胞的百分比(n个=4–8）和PancMet KO(n个=4–7）只小鼠。结果为平均值±SEM*P（P）与相应基因型的非妊娠小鼠相比，<0.05^P（P）在相同GD或PPD4下，与野生型相比<0.05。D类–我：野生型小鼠胰岛培养物的代表性显微照片(D类–F类)和PancMet KO(G公司–我)用0 nmol/L处理的小鼠(D类和G公司)，200毫摩尔/升(E类和H（H）)，或500 nmol/L(F类和我)地塞米松24小时，TUNEL（绿色）、胰岛素（红色）和DAPI（蓝色）染色。箭头表示TUNEL阳性的β细胞核。J型：对PancMet KO和用0、200或500 nmol/L地塞米松处理的野生型小鼠的胰岛细胞培养物进行重复的四个实验中TUNEL阳性β细胞核的定量。结果为平均值±SEM*P（P）<0.05 vs.0 mmol/L的相应基因型^P（P）与野生型小鼠胰岛细胞培养中的相同剂量相比，<0.05。K（K）–N个：用0 ng/mL处理的人类胰岛培养物的代表性显微照片(K（K）和L（左）)或25纳克/毫升(米和N个)HGF和0 nmol/L(K（K）和米)或500 nmol/L(L（左）和N个)地塞米松24小时，TUNEL（绿色）、胰岛素（红色）和DAPI（蓝色）染色。箭头表示TUNEL阳性的β细胞核。O（运行）：在未经HGF和0或500 nmol/L地塞米松处理或未经HGF处理的人胰岛细胞培养物的两个重复实验中，对TUNEL阳性β-细胞核进行量化。结果为平均值±SEM*P（P）<0.05 vs.0 nmol/L和^P（P）<0.05 vs.不含HGF的500 nmol/L。（该图的高质量数字表示可在在线期刊上获得。）

啮齿类动物的循环类固醇激素水平在妊娠最后一周升高，并被认为在妊娠晚期和产后可诱导β细胞凋亡和使β细胞质量正常化(2,30–32). HGF/c-Met信号缺陷可能使β细胞对低水平类固醇激素诱导的凋亡更敏感，正如我们之前在细胞因子中观察到的那样(15). 事实上，PancMet KOβ细胞对低剂量合成类固醇激素地塞米松的细胞毒性作用更为敏感，这种激素不会导致野生型胰岛中的β细胞死亡(图5D类–J型). 较高剂量的地塞米松对PancMet KO和野生型β细胞的细胞毒性相同(图5J型). 有趣的是，HGF完全消除了地塞米松诱导的人β细胞毒性(图5K（K）–O（运行）). 这些结果表明，HGF是β细胞抵抗类固醇激素细胞毒性剂量的保护因子，β细胞中HGF/c-Met信号的丢失可以提高对这些激素低剂量诱导的细胞毒性的敏感性。

β细胞中缺乏HGF/c-Met信号导致GDM。

由于β细胞中c-Met的丢失导致母体β细胞的质量膨胀、增殖和存活率发生变化，我们接下来分析了妊娠期间PancMet KO小鼠的葡萄糖稳态。与未怀孕的小鼠或怀孕的野生型同胎鼠相比，GD19时PancMet-KO小鼠的血糖显著升高(图6A类). 血糖升高与血浆胰岛素降低相关(图6B类). 此外，与野生型小鼠相比，PancMet KO小鼠在GD19时的空腹血糖也显著升高(图6C类).

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图6。

妊娠期PancMet-KO小鼠的葡萄糖稳态。怀孕的PancMet KO小鼠血糖显著升高(A类)血浆胰岛素显著降低(B类)GD19。结果为平均值±SEM，来自孕妇、PPD4和非孕妇（NP）野生型（WT）(n个=4–8）和PancMet KO(n个=4–7）只小鼠*P（P）与相应基因型的非妊娠小鼠相比，<0.05^P（P）<0.05，与同一GD的野生型相比。C类：野生型腹膜内葡萄糖耐量试验(n个=7）和PancMet KO(n个=6）GD19时的小鼠。结果为平均值±SEM^P（P）在同一时间点，与野生型相比，<0.05。D类：根据非妊娠和妊娠野生型患者的腹腔葡萄糖耐量试验计算的曲线下面积（AUC）(n个=5–7）和PancMet KO(n个=6–8）对GD15、-19和PPD4的小鼠进行检查。结果为平均值±SEM*P（P）与相应基因型的非妊娠小鼠相比，<0.05^P（P）在同一GD或PP日，与野生型相比<0.05。E类：妊娠野生型胰岛素耐受性试验(n个=5）和PancMet KO(n个=6）处于GD18的小鼠。这两种类型的小鼠对胰岛素的使用表现出相似的反应。F类：实时PCR分析从非妊娠和妊娠（GD19）野生型胰岛分离的胰岛总RNA中葡萄糖激酶、GLUT2、Pdx-1和胰岛素mRNA的表达(n个=5-6）和PancMet KO(n个=3-5）只小鼠。结果为平均值±SEM*P（P）与野生型非孕妇相比，<0.05^P（P）与野生型GD19相比<0.05。HPRT，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶。G公司：非妊娠和妊娠（GD19）野生型胰岛中的胰岛素含量(n个=6）和PancMet KO(n个=6）小鼠。结果为平均值±SEM*P（P）与野生型非孕妇相比，<0.05^P（P）与野生型GD19相比<0.05。H（H）：对从非妊娠和妊娠（GD19）野生型获得的10个大小相似的胰岛进行GSIS(n个=5）和PancMet KO(n个=5）小鼠，并用5或20mmol/L葡萄糖孵育30分钟。结果为平均值±SEM*P（P）<0.05 vs.相应基因型的5 mmol/L葡萄糖+P（P）在20 mmol/L葡萄糖下，与非妊娠野生型相比<0.05；和^P（P）在20 mmol/L葡萄糖下，与野生型GD19相比<0.05。

与未怀孕小鼠相比，野生型小鼠在GD19时的葡萄糖耐量受损(图6D类). 重要的是，在这个妊娠日，PancMet-KO小鼠的葡萄糖耐量进一步受损(图6C类和D类)当这些小鼠的β细胞质量减少时(图2C类). 妊娠期PancMet KO小鼠葡萄糖耐量的增强损害与胰岛素敏感性的变化无关，因为这两种妊娠小鼠在GD18时对胰岛素耐量试验的反应相似(图6E类). PancMet KO小鼠的糖耐量受损维持在PPD4(图6D类)令人惊讶的是，他也出席了GD15(图6D类)当β细胞质量没有变化时(图2C类). 这表明，β细胞中c-Met的缺失也可能改变妊娠期间的胰岛素分泌，而不受其对β细胞质量和增殖的影响。

本研究得到了美国糖尿病协会（1-10-BS-59）和美国国立卫生研究院（NIH）的资助（DK067351和DK077096授予A.G.-O.，DK072264授予R.C.V.）。C.D.是劳森·威尔金斯儿科内分泌学会（Lawson Wilkins Pediatric Endocrine Society）研究奖学金的获得者。S.E.是NIH研究培训拨款T32DK07052-32资助的研究员。人类胰岛由青少年糖尿病研究基金会和国家卫生研究院/国家研究资源中心（NIH/National Center for Research Resources）以及国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases）支持的综合胰岛分布计划（Integrated Islet Distribution Program）提供。

未报告与本文相关的潜在利益冲突。

C.D.和S.E.进行研究，分析数据，设计研究，并参与讨论。J.C.A.-P.进行了研究，分析了数据，并为讨论做出了贡献。T.R.、S.V.、V.S.和G.P.C.进行了研究。L.C.A.和R.C.V.设计了研究，分析了数据，并为讨论做出了贡献。A.G.-O设计了研究，分析了数据，为讨论做出了贡献，并撰写了手稿。A.G.-O.是这项工作的担保人，因此，他可以完全访问研究中的所有数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。

作者感谢哈佛大学哈佛干细胞研究所的Douglas A.Melton博士和美国国家癌症研究所实验致癌实验室的Snorri Thorgeirsson博士分别提供Pdx-Cre和loxP-c-Met小鼠。作者还感谢来自内分泌学系的安德鲁·斯图尔特（Andrew F.Stewart）、唐纳德·斯科特（Donald K.Scott）和Nathalie Fiaschi-Taesch，以及来自匹兹堡大学儿科系的多萝西·贝克尔（Dorothy Becker）的深思熟虑的讨论。