糖尿病。2012年5月；61(5): 1234–1242.
摄入蔗糖和阿尔茨海默病引起的代谢改变促进类似的脑线粒体异常
，1,2 ，1,2 ，1,2 ，1,2 ，1,2 ，1,三 ，1,4和1,5
克里斯蒂娜·卡瓦略
1葡萄牙科英布拉大学神经科学和细胞生物学中心
2葡萄牙科因布拉科因布拉大学生命科学系-科学与技术学院
苏珊娜·卡多佐
1葡萄牙科英布拉大学神经科学和细胞生物学中心
2葡萄牙科因布拉科因布拉大学生命科学系-科学与技术学院
Sónia C.Correia科雷亚
1葡萄牙科英布拉大学神经科学和细胞生物学中心
2葡萄牙科因布拉科因布拉大学生命科学系-科学与技术学院
雷纳托·X·桑托斯
1葡萄牙科英布拉大学神经科学和细胞生物学中心
2葡萄牙科因布拉科因布拉大学生命科学系-科学与技术学院
玛丽亚·桑托斯
1葡萄牙科英布拉大学神经科学和细胞生物学中心
2葡萄牙科因布拉科因布拉大学生命科学系-科学与技术学院
伊恩斯·巴尔德斯
1葡萄牙科英布拉大学神经科学和细胞生物学中心
三葡萄牙哥印布拉科印布拉大学医学院科英布拉大学神经化学实验室
卡塔琳娜·奥利维拉
1葡萄牙科英布拉大学神经科学和细胞生物学中心
4葡萄牙科英布拉科英布拉大学生物化学学院医学院
保拉·莫雷拉
1葡萄牙科英布拉大学神经科学和细胞生物学中心
5葡萄牙科英布拉科英布拉大学医学院生理学研究所
1葡萄牙科英布拉大学神经科学和细胞生物学中心
2葡萄牙科因布拉科因布拉大学生命科学系-科学与技术学院
三神经化学实验室科英布拉大学医院和神经病学系科英布拉大学医学院，科英布拉，葡萄牙
4葡萄牙科英布拉科英布拉大学生物化学学院医学院
5葡萄牙科因布拉科因布拉大学医学院生理研究所
2011年8月24日收到；2012年1月26日接受。
- 补充资料
补充数据
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摘要
有证据表明，糖尿病增加了患阿尔茨海默病（AD）的风险。为了阐明糖尿病和AD之间的联系机制，我们做了许多工作。为了证明线粒体可能代表这两种病理之间的功能联系，我们比较了AD和蔗糖诱导的代谢改变对小鼠脑线粒体生物能量学和氧化状态的影响。为此，从野生型（WT）、三重转基因AD（3xTg-AD）中分离出脑线粒体，并用20%蔗糖加糖水喂养7个月。采用极谱法、分光光度法、荧光法、高效液相色谱法和电子显微镜评估线粒体功能、氧化状态和超微结构。Western blotting检测AD致病蛋白水平。摄入蔗糖会引起代谢改变，就像在2型糖尿病中发现的那样。3xTg-AD和蔗糖处理的WT小鼠的线粒体表现出类似的呼吸链和磷酸化系统损伤，钙累积能力下降，超微结构异常和氧化失衡。有趣的是，糖处理的WT小鼠淀粉样β蛋白水平显著升高，这是AD的标志。这些结果表明，在小鼠中，与糖尿病相关的代谢改变有助于形成AD样病理特征。
阿尔茨海默病（AD）是一种渐进性神经退行性疾病，可导致痴呆，约10%的65岁以上人口会受到影响。AD的特征是严重的神经元丢失和两种脑损伤，即老年斑和神经纤维缠结，它们分别由淀粉样β（aβ）和高磷酸化τ蛋白构成(1).
2型糖尿病（T2D）是一种众所周知的代谢紊乱，通常发生在30岁以上的人群中，影响全球7%以上的人口。这种疾病的特征是相对胰岛素缺乏，胰岛素作用减弱，葡萄糖转运的胰岛素抵抗，尤其是骨骼肌和脂肪组织。T2D和血管疾病的风险因素很多，包括高血糖、肥胖、血三酰甘油升高和胰岛素抵抗。所有这些因素单独或共同增加了AD和血管性痴呆的风险。流行病学研究证实了糖尿病是血管性痴呆和AD的危险因素的观点(2，三). AD和T2D具有相似的人口统计学特征、风险因素，以及可能更重要的临床和生化特征(4).
我们实验室以前的研究表明，从T2D大鼠大脑中分离出的线粒体更容易接触Aβ蛋白(5)这表明线粒体是糖尿病和AD之间的功能联系。线粒体在细胞存活和死亡的调节中起着关键作用(6). 这些细胞器通过氧化磷酸化和调节细胞内钙（Ca2+)体内平衡。因此，线粒体能量代谢障碍最终导致ATP生成和Ca2+缓冲损伤并加剧活性氧（ROS）的生成。除其他外，高水平的ROS通过脂质过氧化导致细胞膜损伤，并加速线粒体DNA的高突变率。线粒体DNA突变的积累会加剧氧化损伤，导致能量消耗，并在恶性循环中增加活性氧的产生(7). 此外，由于大脑中多不饱和脂肪酸含量高，耗氧量高，过渡金属含量高，抗氧化能力差，因此大脑特别容易受到氧化应激诱导的损伤。
文献表明，线粒体功能障碍和氧化应激在AD的早期病理学中很重要。事实上，有强有力的迹象表明，氧化应激发生在AD症状出现之前，并且氧化损伤不仅存在于受疾病影响的大脑的脆弱区域，也存在于外周(8). 此外，氧化损伤发生在Aβ斑块形成之前(8)支持线粒体功能障碍和氧化应激在AD中的致病作用。
因为我们相信脑线粒体可以成为糖尿病（和糖尿病前期状态）和AD之间的功能桥梁，所以本研究旨在评估和比较蔗糖诱导的代谢改变和AD对小鼠脑线粒体的影响。为此，使用了三组实验动物：1)野生型（WT）对照小鼠，2)蔗糖处理的WT小鼠，以及三)三重转基因AD（3xTg-AD）小鼠。之所以使用蔗糖溶液，是因为有令人信服的证据表明过量摄入糖在肥胖和T2D流行中起着关键作用(9).
评估了几个参数：线粒体呼吸链（呼吸状态2、3和4、呼吸控制比[RCR]和ADP/O指数）、磷酸化系统（线粒体跨膜电位[ΔΨm]、ADP诱导的去极化、复极滞后期和ATP-ADP比）、Ca2+-诱导渗透率转换孔（Ca2+通量和线粒体超微结构）、线粒体乌头酸酶活性、过氧化氢（H2哦2)非酶（维生素E、谷胱甘肽（GSH）-谷胱甘苷二硫化物（GSSG）比值）和酶（谷胱甘蛋白还原酶[GR]、谷胱甘肽过氧化物酶[GPx]）和锰超氧化物歧化酶[MnSOD]）抗氧化防御。还评估了Aβ和磷酸化τ（p-τ）蛋白的水平。
研究设计和方法
动物。
雄性WT和3xTg-AD小鼠（4个月大）被安置在我们的动物群中（科英布拉大学医学院动物设施/神经科学和细胞生物学中心）。WT小鼠被随机分为两组：1)对照组和2)蔗糖处理动物7个月内自由接触20%蔗糖溶液。小鼠保持在受控光照（昼夜循环12小时）和湿度下，自由饮水（禁食期除外）（WT和3xTg-AD小鼠在基础条件下）或20%蔗糖溶液（经蔗糖处理的WT）和鼠食粉（URF1；Charles River）。按照实验动物科学协会联合会（FELASA）批准的程序，这些动物（11个月大）在治疗期结束时被颈部移位和断头处死。
生化参数的测定。
血糖、胰岛素、HBA1c个使用标准程序测定甘油三酯和胆固醇水平。
脑线粒体的分离。
通过Moreira等人的方法从小鼠体内分离出脑线粒体(5)添加0.02%洋地黄素，从突触体部分释放线粒体。
线粒体呼吸测量。
用克拉克氧电极极谱法记录耗氧量(10)连接到恒温水套密闭室中的合适记录仪，并进行磁力搅拌。反应在30°C下，在1 mL标准培养基（100 mmol/L蔗糖、100 mmol/L KCl、2 mmol/L KH2警察4，5 mmol/L Hepes和10μmol/L EGTA，pH 7.4），含0.5 mg蛋白质。线粒体呼吸的呼吸状态2在2μmol/L鱼藤酮存在下由5 mmol/L琥珀酸盐（线粒体通过复合物II激发）启动。RCR是呼吸状态3（在琥珀酸盐和ADP存在下的氧气消耗）和4（在ADP被消耗后的氧气消耗量）之间的比率。ADP/O指数由呼吸状态3期间添加的ADP的量与消耗的氧气之间的比率表示。
ΔΨ的测量米。
ΔΨ米通过评估亲脂阳离子四苯基鏻（TPP）的跨膜分布进行监测+)使用TPP+-根据Kamo等人(11)使用Ag/AgCl饱和电极（Tacussel，型号MI 402）作为参考。火力发电厂+根据TPP下降测量摄取量+电极感应到的介质中的浓度。用静电计测量选择电极和参比电极之间的电位差，并在线性1200记录仪中连续记录。在1 mL标准培养基（100 mmol/L蔗糖、100 mmol/L KCl、2 mmol/LKH）中的磁搅拌室中进行反应2警察4，5 mmol/L Hepes和10μmol/L EGTA；pH 7.4），含3μmol/L TPP+在2μmol/L鱼藤酮存在下，用5 mmol/L琥珀酸对线粒体（0.5 mg/mL）进行激发。TPP稳态分布后+已达到（记录的~1分钟），ΔΨ米记录波动。
腺嘌呤核苷酸水平的测定。
腺嘌呤核苷酸通过反相高效液相色谱分离进行评估。
钙的测量2+通量。
线粒体钙2+通过监测钙的变化来测量通量2+使用钙在反应介质中的浓度2+-选择性电极(12).
电子显微镜。
通过在0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.3）中添加3%戊二醛来固定线粒体组分以进行电子显微镜检查，并在4°C下培养2 h。在1%琼脂中预培养后，样品在等级乙醇中脱水并包埋在Spur中。超薄切片在LKB超粘液切片机Ultrotome III中获得，用甲醇-乙酸铀酰染色，然后用柠檬酸铅染色，并用80 kV操作的Jeol Jem-100SV电子显微镜检查。
乌头酸酶活性的测量。
根据Krebs和Holzach测定乌头酶活性(13).
H的测量2哦2水平。
H（H）2哦2用改进的Barja描述的方法用荧光法测量水平(14).
GSH和GSSG水平的测量。
在含有H的脱蛋白线粒体的上清液反应后，用荧光检测法测定GSH和GSSG水平三警察4/NaH（氢化钠）2警察4-EDTA或H三警察4/NaOH分别与o个-根据Hissin和Hilf的邻苯二甲醛（pH 8.0）(15).
维生素E含量的测量。
按照Vatassery和Younoszai先前描述的方法，从脑线粒体中提取和分离维生素E（α-生育酚）(16).
测定GPx、GR和SOD活性。
GPx的活动(17)，希腊(18)和SOD(19)如前所述，用分光光度法测定。
评估Aβ和p-τ蛋白水平。
在含有50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L-NaCl、1%NP-40、1%脱氧皮质酮和0.1%十二烷基硫酸钠（pH 7.4）、蛋白酶抑制剂（罗氏商用蛋白酶抑制剂鸡尾酒）、磷酸酶抑制剂（罗氏商用磷酸酶抑制剂鸡尾液）、0.1 mol/L苯甲基磺酰基氟化物（西格玛）、，0.2 mol/L二硫苏糖醇（Sigma），在液氮中冷冻三次，并在13200下离心克10分钟。随后将印迹与各自的一级抗体在4°C下温和搅拌孵育过夜（Signet Laboratories的1:1000小鼠单克隆人β淀粉样蛋白[克隆6E10]；赛默飞世尔科学公司的1:1000小鼠单克隆配对螺旋丝-τ单克隆抗体[克隆AT8]；或来自Sigma的1:10000单克隆抗α-微管蛋白抗体）。使用Bio-Read Versa-Doc成像仪检测荧光信号，并使用Quantity One软件确定带密度。
统计分析。
结果显示为所示实验次数的平均值±SEM。使用配对学生确定统计显著性吨检验和Kruskal-Wallis检验进行多重比较，然后进行事后邓恩检验。
结果
实验动物的特征。
与WT小鼠相比，3xTg-AD动物的体重和大脑重量显著下降，因此大脑重量与体重的比率下降(). 这些动物也表现出HbA增加1c个和餐后血糖水平(). 与基础条件下的WT小鼠相比，在WT小鼠中，蔗糖摄入促进了体重的增加，脑重量的减少，从而降低了脑重量与体重的比率。此外，蔗糖摄入促进HbA的增加1c个血糖、胰岛素和甘油三酯水平()葡萄糖耐量降低(补充图1)与相应的对照小鼠进行比较。未观察到胆固醇水平的变化().
AD和蔗糖诱导的代谢改变损害线粒体呼吸链和氧化磷酸化系统。
经蔗糖处理的野生动物呼吸状态2（分别为～35%和～41%）和4（分别为约46%和～54%）增加，呼吸状态3（分别为至33%和～31%）和RCR（分别为~15%和~17%）降低；). ADP/O指数无明显变化(). 线粒体跨膜电位（∆Ψ米)是氧化磷酸化现象的基础，氧化磷酸化导致ADP通过ATP合酶转化为ATP。与WT对照小鼠的线粒体相比，3xTg-AD和蔗糖处理的WT小鼠的线粒体ΔΨ显著降低米（分别为～9%和～7%），ADP诱导的去极化（两组均为～23%）和ATP-ADP比值（分别为约48和约42%），复极滞后期显著增加，磷酸化外源性ADP所需的时间分别为～37%和～40%；).
AD和蔗糖诱导的代谢改变对线粒体呼吸的影响。在2μmol/L鱼藤酮存在下用5 mmol/L琥珀酸激发的1 mL反应介质中，在新鲜分离的脑线粒体部分（0.5 mg）中评估呼吸状态2、3和4以及RCR和ADP/O指数。所示数据表示五到六个独立实验的平均值±SEM。nAtgO/min/mg，nAtom-gram氧气/min/mg*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
AD和蔗糖诱导的代谢改变增强了Ca诱导的线粒体通透性转换孔的开放2+。
线粒体通透性转换孔（PTP）的特征是线粒体膜通透性增加，导致ΔΨ损失米，Ca变化2+通量、线粒体肿胀、线粒体膜和嵴破裂(5，6). 在80 nmol Ca存在下2+，从3xTg AD中分离的线粒体(，迹线6)和经蔗糖处理的WT(，迹线5)动物积累和保留的钙较少2+与WT控制线粒体相比(，记录道4). 寡霉素/ADP对(，记录道1，2、和三)，在阻止脑线粒体PTP开放方面比环孢霉素A更有效(5)，显著增加线粒体积累和保留钙的能力2+关于超微结构，蔗糖处理动物的线粒体(、2）和3xTg-AD(与WT对照线粒体相比，线粒体受损率高，特征是线粒体肿胀，线粒体膜和嵴断裂(, 1).
AD和蔗糖诱导的代谢改变对线粒体钙的影响2+通量和超微结构。A类：用5 mmol/L琥珀酸对1 mL反应介质中新分离的脑线粒体（0.5 mg）进行激发。钙2+在线粒体通电前1min加入80nmol/mg蛋白。在Ca前2分钟添加寡霉素（0.2μg/mL）和ADP（100μmol/L）2+添加。这些痕迹是五到六个独立实验的典型特征。微量1：寡霉素和ADP存在时WT控制线粒体；痕量2:WT蔗糖处理的线粒体，在寡霉素加ADP存在下；微量3:3xTg-AD线粒体在寡霉素和ADP存在下；迹线4：WT控制；微量5:WT蔗糖处理的线粒体；微量6:3xTg AD线粒体。B类：在钙实验后，线粒体被固定用于电子显微镜。图像表示WT控制线粒体(地下一层); WT蔗糖处理的线粒体(B2级); 3xTg-AD线粒体(地下三层)在钙的存在下2+（80 nmol/mg蛋白质），以及正常和受损线粒体的图示(B4类).箭头，线粒体正常；箭头，线粒体受损***P（P）与WT控制线粒体相比<0.001。
AD和蔗糖诱导的代谢改变促进氧化应激和损伤。
线粒体顺乌头酸酶活性是细胞内活性氧和氮物种的敏感氧化还原传感器。与WT对照线粒体相比，3xTg-AD小鼠脑线粒体的顺乌头酸酶活性显著降低（～54%）(). 有趣的是，与3xTg-AD小鼠相比，经蔗糖处理的WT小鼠的顺乌头酸酶活性表现出类似的降低（～51%）。因此，H显著增加2哦2在3xTg-AD（～25%）和蔗糖处理的WT（约18%）小鼠的线粒体中观察到该水平().
AD和蔗糖诱导的代谢改变对线粒体氧化应激的影响。A类：乌头酶活性。B类：H2哦2水平。所示数据表示五到六个独立实验的平均值±SEM*P（P）< 0.05; **P（P）与WT对照动物相比<0.01。
AD和蔗糖诱导的代谢改变损害抗氧化防御。
谷胱甘肽和维生素E是重要的细胞内抗氧化剂，可作为自由基清除剂，从而保护细胞免受氧化损伤。从3xTg-AD和蔗糖处理的WT动物分离的脑线粒体GSH-GSSG比率显著降低（分别为～60%和64%；)维生素E水平（分别为～60%和64%；)与WT线粒体相比。
AD和蔗糖诱导的代谢改变对非酶抗氧化防御的影响。GSH-GSSG比率(A类)和维生素E水平(B类). 所示数据表示五到六个独立实验的平均值±SEM*P（P）< 0.05; **P（P）与WT对照动物相比<0.01。
GPx和GR是两种参与ROS解毒的抗氧化酶。GPx催化H的还原2哦2以及各种水过氧化物。此外，GR负责使用NADPH作为H从GSSG中再生GSH+捐赠者。与WT小鼠相比，从3xTg-AD和蔗糖处理的WT小鼠分离的线粒体GPx活性显著增加（分别为～38和～48%），GR活性下降（分别为约70和～62%；和B类). 与野生型对照动物相比，3xTg-AD（～375%）和蔗糖处理野生型动物（～318%）的MnSOD活性显著增加().
AD和蔗糖诱导的代谢变化对酶抗氧化防御的影响。A类：GPx活动。B类：GR活动。C类：MnSOD活性。所示数据表示五到六个独立实验的平均值±SEM*P（P）< 0.05; **P（P）与WT对照动物相比<0.01。
蔗糖诱导的代谢改变增加了Aβ蛋白水平。
毫不奇怪，3xTg AD小鼠表现出高水平的Ab蛋白。然而，摄入蔗糖的WT也显著增加了aβ蛋白的水平，尤其是皮层。也观察到p-τ蛋白水平增加，尽管没有统计学意义().
AD和蔗糖诱导的代谢改变对Aβ和p-τ蛋白水平的影响。蛋白质印迹检测(A类)和条带密度(B类)对应于Aβ、总蛋白和p-τ蛋白。重量+S、，WT蔗糖处理动物；AD、3xTg-AD对照动物。
讨论
这项研究表明，与蔗糖摄入相关的代谢改变促进了大脑线粒体呼吸链、氧化磷酸化系统和钙的损伤2+体内平衡，以及与3xTg-AD小鼠模型中观察到的类似的氧化失衡。此外，在蔗糖处理小鼠的脑组织中观察到aβ蛋白水平显著升高，这是AD的标志。
糖摄入量降低的WT小鼠糖耐量(补充图1)血糖、HbA升高1c个胰岛素和甘油三酯水平(). 体重显著增加，脑重和脑重与体重之比下降()在蔗糖处理的WT和3xTg-AD小鼠中也观察到。以前的研究表明，糖尿病与体重增加和大脑总重量减少有关(20). 摄入蔗糖引起的变化表明这些动物处于糖尿病前期状态(21). 几项研究表明，与肥胖和/或胰岛素稳态改变相关的表型增加了发生认知衰退和痴呆的风险，即血管性痴呆和AD(22). 最近的一项研究还表明，多种血管危险因素与AD患者认知、功能和局部脑血流的更大下降率相关，这突出了血管危险因素对AD进展的作用(23). 此外，有已发表的文献表明，糖尿病会影响AD患者的生存(24).
有趣的是，HbA增加1c个在基础条件下，还观察到3xTg-AD小鼠的血糖水平，这可能是AD发生葡萄糖代谢改变的结果。这些AD小鼠餐后血糖水平升高的观察进一步证实了这一观点(). 血红蛋白A1c个是早期糖基化产物，也是晚期糖基化终产物（AGEs）的前体之一(25). 先前的研究表明，AGEs与其受体RAGE的相互作用导致ROS的形成，这也被认为是AD病理学的早期事件(26).
基础条件下的3xTg-AD动物也表现出体重和脑重量的下降，因此脑重与体重的比率也下降()，AD患者也观察到特征(27，28). 事实上，体重减轻是AD的常见并发症，40%的患者在所有疾病阶段都会出现体重减轻(27，28).
为了表明脑线粒体可能代表糖尿病（和糖尿病前期状态）和AD之间的功能联系，我们评估并比较了蔗糖诱导的代谢改变和AD对线粒体生物能量学和氧化状态的影响。我们实验室以前的研究表明，合成的Aβ25–35和Aβ1−40肽破坏呼吸链，解偶联氧化磷酸化系统，并降低分离的脑线粒体的ATP水平(5). 最近，Dragicevic等人(29)评估了从12个月的APPsw和APP+PS1 AD小鼠模型中获得的几个脑区分离的线粒体的功能。作者观察到两种动物模型的呼吸链受损，ΔΨm降低，这些缺陷在海马和皮层线粒体中更为明显(29). 因此，我们观察到3xTg-AD动物的线粒体存在呼吸链损伤()和磷酸化系统，最终导致ATP产量降低(). 在从AD血小板分离的线粒体中也观察到这种ATP缺陷(30). 细胞ATP水平低可能导致突触和突触功能的丧失，导致认知能力下降(31). 有趣的是，从蔗糖处理的野生动物中分离出的线粒体呈现出类似的呼吸链和氧化磷酸化系统损伤模式(，)支持线粒体功能障碍是糖尿病（和糖尿病前期状态）和AD之间的共同分母的观点。
PTP是一种跨越线粒体内外膜的非选择性高电导通道(32). 线粒体能耐受一定量的钙2+但最终，它们适应Ca的能力2+由于内膜通透性的深刻变化，负荷过重，线粒体完全去极化，反映了PTP的诱导(33). 尽管Ca2+被认为是最重要的诱导剂，基质pH、ΔΨm、Mg2+、Pi、亲环素D、氧化应激和腺嘌呤核苷酸也是有效的调节因子(34). 此外，PTP通过释放细胞色素c等多种凋亡因子在凋亡过程中发挥重要作用(32). 在目前的研究中，来自3xTg-AD和蔗糖处理的WT小鼠的线粒体的钙积累和保留能力下降2+(). 这些结果与我们实验室先前的研究一致，研究表明，暴露于合成Aβ肽的分离脑线粒体积累和保留钙的能力较低2+(5). Du等人(35)据报道，突变APP小鼠的突触线粒体显示出Aβ的年龄依赖性积累和线粒体改变，其特征是细胞色素氧化酶活性和呼吸降低，氧化应激和线粒体通透性转变增加。此外，研究表明N个-甲基-d日-天冬氨酸（NMDA）和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）受体，线粒体钙2+超负荷和线粒体损伤是Aβ低聚物神经毒性的基础(36). 我们还发现，暴露于Aβ肽的糖尿病大鼠脑线粒体更容易受到钙的影响2+-诱导PTP开放与对照动物线粒体的比较(5). 线粒体积累和保留钙的能力2+ADP和寡霉素的存在显著增加(). 尽管环孢菌素A被认为是PTP的特异性抑制剂，但先前的研究表明，ADP加寡霉素对预防脑线粒体中的PTP更有效(5). 根据Ca2+我们的电子显微镜分析显示，3xTg-AD和蔗糖处理的WT动物线粒体受损率很高，表现为线粒体肿胀、线粒体膜和嵴破裂().
由于线粒体是活性氧的主要细胞内来源，我们还评估了大脑线粒体制剂的氧化状态。我们观察到H的产量增加2哦2在3xTg-AD和蔗糖处理的WT小鼠中()与PTP开放敏感性增加呈正相关(). 事实上，内源性线粒体ROS的产生增加，包括H2哦2之前有报道称，这是为了促进PTP的开放(37). Manczak等人(38)还观察到H水平显著增加2哦2在Aβ斑块出现之前，将Tg2576小鼠与年龄匹配的WT同窝小鼠进行比较。线粒体ROS生成的增加与3xTg-AD和蔗糖处理野生动物线粒体乌头酸酶活性的降低呈正相关(). 线粒体乌头酸酶和超氧物之间的反应在线粒体氧化损伤中起着重要作用(39). 乌头糖在其活性中心有一个铁硫簇，对超氧物和其他活性物质高度敏感，从而使酶失活(40). 在几种神经退行性疾病的实验模型中也证实了乌头酶活性的降低(41).
因为氧化应激是由于活性氧生成和生物系统的能力之间的不平衡引起的，生物系统可以很容易地对活性中间体进行解毒，或者通过抗氧化防御很容易修复由此造成的损伤(26)，我们还评估了几种酶和非酶抗氧化防御。一种关键的细胞抗氧化剂是谷胱甘肽，它是一种有效的自由基清除剂，也是抗氧化酶GPx的共基质。细胞内GSH被GPx转化为GSSG，GPx催化H的还原2哦2和各种过氧化氢(42). GR还负责使用NADPH作为H从GSSG中再生GSH+捐赠者(43). 一些研究报告了AD和糖尿病患者谷胱甘肽水平的变化(44，45). 因此，我们观察到3xTg-AD对照组和蔗糖处理的WT动物的脑线粒体GSH-GSSG比率显著降低(). 此外，这两组实验动物的GR活性下降，GPx增加(和B类)被观察到，证明谷胱甘肽水平下降是合理的(). 我们之前已经证明，3-5个月龄雌性3xTg-AD小鼠的脑组织中GSH和维生素E水平较低，SOD和GPx活性增加(46). 因此，我们还观察到3xTg-AD和蔗糖处理野生动物的维生素E水平显著下降(). 糖尿病患者血浆中的维生素E水平也有所下降(47)和AD(48)患者。3xTg-AD和WT蔗糖处理小鼠的MnSOD活性增加()也观察到，这与H的增加一致2哦2在这些动物中观察到的水平(). SOD催化超氧物转化为H2哦2其活性对氧化状态的调节无疑是重要的。这些结果与先前在AD成纤维细胞系中获得的结果一致，其中MnSOD活性与正常整倍体细胞系相比显著提高了30%(49).
另一个有趣的发现是，蔗糖摄入引起的代谢变化会增加Aβ和（轻微）p-τ蛋白的水平()AD的特征，支持糖尿病前期是AD的危险因素的观点。因此，先前的研究表明，T2D BBZDR/Wor大鼠和1型糖尿病BB/Wor大鼠脑内存在aβ和p-τ蛋白的蓄积，这种蓄积在T2D大鼠中更为明显(50).
总之，我们的结果表明，在小鼠模型中，与糖尿病或糖尿病前期疾病相关的代谢改变会导致线粒体异常、氧化失衡和Aβ蛋白水平增加，与AD大脑中发现的情况类似。
致谢
作者的工作得到了Ciência e a Tecnologia基金会（FCT）、欧洲环境基金会（PTDC/SAU-NEU/103325/2008）和国家环境基金会（QREN DO-IT）的支持。
C.C.拥有FCT博士奖学金（SFRH/BD/43965/2008）。
没有报告与本文相关的潜在利益冲突。
C.C.研究数据，参与讨论，并撰写手稿。S.C.、S.C.C、R.X.S.和I.B.研究了数据。M.S.S.、C.R.O.和P.I.M.参与了讨论，并审查和编辑了手稿。P.I.M.是这项工作的保证人，因此，他可以完全访问研究中的所有数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。
作者衷心感谢加利福尼亚大学的Frank LaFerla博士赠送的3xTg-AD小鼠和相应的WT小鼠。
参考文献
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