肝星状细胞衍生Delta-like Homolog 1（DLK1）蛋白在肝再生中的作用^*

免疫组织化学

E6鸡胚的石蜡包埋切片来自南加州大学C.-M.Chuong博士的实验室，由南加州ALPD和肝硬化研究中心的形态学核心使用抗结蛋白（Sigma）、抗αSMA（Sigma-）和抗DLK1（Abcam）抗体进行免疫染色。用4%多聚甲醛固定小鼠胚胎或成年肝脏，冰冻切片（7μm）用抗DLK1（1/1000；MBL或Abcam）、白蛋白（1/3000；Nordic）、ALCAM（1/100；eBioscience）、结蛋白（1/400；Thermo Scientific）、p75NTR（1/1000，Abcam，或如前所述的Wilms肿瘤1（WT1，1/50；Cell Marque）(38). 用与Alexa Fluor 488或568（Invitrogen）缀合的第二抗体检测第一抗体。用DAPI（Invitrogen）对切片进行复染。

荧光激活细胞分选（FACS）

GFP公司⁺如前所述，通过FACS从Coll-GFP小鼠的E13.5胚胎或成年肝脏中分离细胞(38). 用胰蛋白酶-EDTA消化E13.5胚胎肝脏。通过胶原酶灌注法从成人肝脏中获得非实质细胞（NPC）(8). 使用FACS Vantage SE（BD Biosciences）对胚胎肝细胞或成人非实质细胞进行FACS(38). 野生型小鼠被用作阴性对照。

RNA提取和实时PCR

使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）从细胞中提取总RNA。使用SuperScript III第一链合成系统（Invitrogen）将RNA反向转录到cDNA，并使用下列引物和SYBR Green PCR Master Mix试剂（AB Applied Biosystems）扩增40个周期。每个计算机断层扫描值首先标准化为36B4计算机断层扫描值，并与处理样品和对照样品进行比较。使用的引物序列为：Ppar公司γ、 5′-CTG AAG CTC CAA GAA TAC CAAA和5′-AGA GTT GGG TTT CAG AAT AAG；α1（I）胶原蛋白，5′-TCG ATT CAC CTA CAG CAC GC和5′-GAC TGT CTT GCC CCA AGT TCC；深1，5′-GGC CAT CGT CTT TCT CAA CA和5′-ATC CTC ATC ACC AGC CTC CT；重量10b，5′-CGA GAA TGC GGA TCC ACAA和5′-CCG CTT CAG GTT TTC CGT TA；Wnt3a型，5′-CAT CGC CAG TCA CAT GCA CCT和5′-CGT CTA TGC CAT GCG AGC TCA；尼可丁，5′-TGA TGG TCC GTA TCG ACA AA和5′-GGA TGT TTC CTG TGC CAG TT; 嘘5′-CTG GCC AGA TGT TTT CTG GT和5′-TAA AGG GGT CAG CTT TTT GG，36个B4，5′-TTC CCA CTG GCT GAA AAG GT和5′-CGC AGC CGC AAA TGC。中使用的引物序列图6D类与前面描述的相同(38).

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图6。

A类免疫组织化学检测，E5鸡胚肝在岛状细胞周围的HSC或成肝细胞代码中显示结蛋白、αSMA和DLK1的表达。成肝细胞亚群中DLK1的弥漫染色也很明显。放大倍数，×200。B类E9.5、E13.5和E17.5小鼠胚胎的免疫组织化学。在E9.5胚胎中，DLK1在前肠内胚层表达(前景)和WT1⁺间质横隔(stm公司).小时，心脏。在E13.5胚胎中，DLK1以白蛋白表达⁺成肝细胞和ALCAM⁺间皮细胞(箭头)和亚等温细胞(箭头)在肝脏表面。一些结蛋白⁺HSC和血管周围间充质细胞表达DLK1(箭头). 在E17.5胚胎中，DLK1在成肝细胞中的表达减弱，但在ALCAM中持续表达⁺间皮细胞(箭头)和亚等温细胞(箭头). 一些结蛋白⁺HSC和p75Ntr⁺Sma公司⁺血管周围间充质细胞(箭头)快速DLK1。用DAPI对细胞核进行复染。（生成此图的原始斑点如所示补充图S1.)C类GFP的FACS⁺来自GFP-Coll小鼠E13.5胚胎或成年肝脏的细胞。WT室友被用作阴性对照。GFP公司⁺对群体进行mRNA表达分析。D类FACS分离的肝细胞定量PCR。表达式值根据Gapdh公司.GFP⁺来自E13.5或成人肝脏的人群富含结蛋白和Col1a1的表达。E13.5 GFP⁺与成体GFP相比，细胞强烈表达Dlk1、Lhx2和Ptn⁺单元格**，第页与E13.5 GFP相比<0.01⁺细胞。

免疫印迹分析

HSC在10-cm培养皿中培养7天，然后感染Ad.LacZ.shRNA或Ad.Dlk1.shRNA，感染次数为100次，再感染3天。然后用PBS清洗细胞一次，如前所述分离核蛋白和细胞溶质蛋白(三). 用SDS-PAGE分离等量的核或细胞溶质提取物（20μg），并将其电印在硝化纤维素膜上。抗DLK抗体（Abcam），p-AKT，AKT，p-ERK、ERK、p-cMET或cMET、β-catenin、非磷酸化β-catentin和磷酸化-Ser-552-β-catenin（细胞信号技术）在TBS（100 m米三氯化氢，1.5米NaCl，pH 7.4）与5%脱脂牛奶混合，然后与辣根过氧化物酶结合二级抗体（Santa Cruz Biotechnology）以1μg/10 ml的浓度孵育。使用ECL试剂盒（Amersham Biosciences）通过化学发光法检测蛋白质。

重组腺病毒载体的构建与应用

根据制造商的说明，使用BLOCK-iT腺病毒RNAi表达系统（Invitrogen）构建表达necdin shRNA的复制活性重组腺病毒。选择对抗大鼠和小鼠的最佳shRNA深1基因，我们首先使用Invitrogen shRNA设计器设计了四个shRNA寡核苷酸。其中，在+375（5′-GGACGAAAATTCTGCGAAAT-3′）时最有效。CACC的一个附加序列被添加到5′端，AAAA被添加到互补序列的5′端。这两个DNA寡核苷酸退火生成dsDNA，随后使用BLOCK-iT U6 RNAi Entry vector试剂盒将其克隆到pENTR/U6载体中。使用Gateway LR Clonase II Enzyme Mix和pAd/BLOCK-iT-DEST网关载体试剂盒，通过LR重组反应将pENTR/U6 necdin shRNA载体中的U6 RNAi盒转移到腺病毒表达质粒。然后用PacI消化分离的腺病毒表达克隆，以暴露倒置的末端重复序列，并使用Targefect F-2（高级靶向系统）转染到293A细胞中，以生产粗腺病毒库存。如前所述，在293A细胞中进行了腺病毒载体的大规模扩增(三,4). 用293A细胞的标准斑形成试验测定纯化病毒的滴度。构建了表达β-半乳糖苷酶shRNA的腺病毒（Ad.LacZ.shRNA）作为对照shRNA载体。在感染倍数为50、100和200的第6天培养激活的大鼠HSC中测试Nectin沉默效率。表达GFP、PPARγ和PPARγ显性阴性突变体（剑桥大学Krishna K.Chatterjee博士馈赠）或Dkk-1（斯坦福大学Calvin Kao博士馈送）的腺病毒也进行了类似的扩增和纯化，并测定了它们的滴度。

瞬时转染和报告基因检测

为了确定necdin、Wnt或DLK1本身对DLK1的调节，将全长深1通过使用Targefect F-2构建启动子（−1950/+36）-荧光素酶（首尔京熙大学Sang Hoon Kim博士的礼物），6小时后感染Ad.LacZ.shRNA、Ad.necdin.shRNA或Ad.Dkk1，感染100倍，持续2天。对于深1启动子联合转染分析中，细胞被联合转染不同数量的necdin（大阪大学吉川博士赠送）或DLK1-HA表达载体、LEF或dnTCF表达载体（华盛顿大学西雅图分校Randall T.Moon博士赠送）。为了测试Shh抑制对DLK1启动子活性的影响，嗯7瞬时转染启动子报告子的细胞，用不同浓度的环胺处理2天。TOPFLASH启动子-荧光素酶构建物（包含8个野生型T细胞因子（TCF）/淋巴增强因子结合位点，这是Randall T.Moon博士的礼物）也与Huh7细胞中不同数量的DLK1表达载体共同转染，以评估DLK1对典型Wnt通路的影响。收集细胞裂解液以测定萤火虫和雷尼利亚使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）进行荧光素素酶活性测定，结果通过雷尼利亚荧光素酶活性。

染色质免疫沉淀（ChIP）

用于测试DLK1静默是否减少MeCp2与Ppar公司以Raji细胞为载体染色质来源，进行γ启动子载体ChIP的研究。在本分析中，Raji细胞（1.4×10⁷)添加到培养的HSC中（0.2×⁶细胞）进行或不进行DLK1沉默或Wnt3或Ad.dnPPARγ处理，并在室温下用1%甲醛在旋转平台上短暂固定10分钟，然后添加甘氨酸至最终浓度0.125米将培养基中的刮除HSC和Raji细胞旋转下来，并用带有蛋白酶抑制剂的冷PBS清洗。用SDS缓冲液（1%SDS，10 m）分解细胞后米EDTA，50米米Tris-HCl，pH 8.1）和蛋白酶抑制剂，对裂解产物进行超声波处理，并将其冷冻在等分样品中。对于ChIP，首先用蛋白G-琼脂糖对稀释样品进行预处理，然后在4°C下用1μG/μl的MeCP2抗体（Abcam）孵育过夜，然后用蛋白G-琼脂糖沉淀。免疫沉淀复合物洗脱后，用5米NaCl和用蛋白酶K消化的蛋白质。提取的染色质使用位于Ppar公司最近描述的γ启动子(9).计算机断层扫描减去非免疫IgG样本的值，并与各自的输入值进行比较计算机断层扫描值。

Dlk敲除将激活的HSC逆转为静止细胞

接下来我们表达shRNA以对抗深1通过培养激活的HSC中的腺病毒载体来确定深1细胞命运调节。在感染表达shRNA的腺病毒（Ad.Dlk1.shRNA）后48～72小时内，主要全长Dlk1的表达比感染表达shRNA-LacZ公司（Ad.LacZ.shRNA）(图2A类). 这种操作将活化细胞的表型逆转为静止或分化HSC的表型，通过紫外线激发的维生素A自体荧光评估细胞内维生素A含量增加，通过油红O染色检测脂质含量增加(图2B类). 这种形态逆转伴随着HSC激活相关基因的抑制表达，如尼可丁（Ncd），α1（I）前胶原（Coll），规范Wnts(重量10b和Wnt3a型)、和嘘但静止基因的表达增加，如Ppar公司γ和C/ebp公司α (图2C类). 我们通过测试DLK1表达载体对TOPFLASH启动子活性的影响，进一步测试了DLK1在经典Wnt信号传导中的调节作用。在本实验中，我们使用Huh7细胞，因为活化的HSC或HSC系已经表达高水平的DLK1。如所示图2D类DLK1的表达显著增加了TOPFLASH活性。结合以下结果深1敲除，这些数据表明DLK1对典型Wnt通路的正向调节。

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图2。

A类，免疫印迹显示DLK1敲除(上部面板)通过表达shRNA的腺病毒深1（Ad.Dlk1.shRNA）与针对LacZ表达shRNA的控制载体（Ad.LacZ.shRNA）。下部面板是装载蛋白质的Ponceau染色。B类,深1用Ad.Dlk1.shRNA敲除可使培养激活的大鼠HSC形态逆转为静止表型，如紫外线激发的自体荧光所示，维生素a含量增加，油红O染色所示脂质含量增加。C类,深1敲除上调脂肪生成基因，Ppar公司γ和C/ebp公司α，同时下调激活标志物，如尼可丁（Ncd），α1（I）前胶原（Coll），规范重量10b和Wnt3a型、和嘘。*,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页与Ad.LacZ.shRNA感染的细胞相比<0.005。误差线、S.D。D类，DLK1的表达增加了瞬时转染启动子荧光素酶结构体和DLK1表达载体的Huh7细胞中TOPFLASH启动子的活性。*，第页与基础启动子活性相比<0.05。E类、Wnt3a添加或dnPPARγ表达增加MeCP2与Ppar公司γ启动子，而PPARγ表达降低它。Dlk1型敲除（Ad.Dlk1.shRNA）将MeCP2的富集降低到Ppar公司γ启动子，恢复Ppar公司γmRNA表达和下调α1（I）前胶原表达。但这些效应会因Wnt3a的添加或显性阴性突变体的表达而消失Ppar公司γ（Ad.dnPPARγ）。腺病毒载体（Ad.PPARγ）表达PPARγ在抑制MeCP2结合和α1（I）前胶原表达式，但不会对通过以下方式实现的这些参数的抑制产生累加效应深1击倒。*，第页与Ad.LacZ.shRNA或Ad.GFP感染的细胞相比，<0.05；†，第页与不含Wnt3a的Ad.Dlk1.shRNA或Ad.GFP的水平相比，<0.05。F类Wnt3a和Wnt10b的表达减少了深1通过表达dnPPARγ，敲除被废除。PPARγ表达可将Wnt3a和Went10b降低至深1击倒，但与深1击倒。*，第页与Ad.LacZ.shRNA或Ad.GFP相比<0.05；†，第页与未添加Wnt3a的Ad.Dlk1.shRNA或对照GFP表达相比，<0.05。

依赖Wnt抑制和Pparγ活性的Dlk1敲除表观性去抑制Pparγ

HSC的激活是由于失去Ppar公司γ表达和异位PPAR（购电协议）活化HSC中γ表达恢复其平静(三,4). 损失Ppar公司γ表达是由于MeCP2介导的表观遗传抑制(8,9). MeCP2协调异染色质的形成Ppar公司γ基因座不仅与启动子结合并招募HDAC和联合阻遏物HP-1α，而且上调EZH2并增加H3K27在3′外显子处的二甲基化或三甲基化(8,9). 正如我们之前的研究所预期的那样(8)，Wnt3a的添加进一步增加了MeCP2对Ppar公司培养活化HSC中的γ启动子(图2E类,左侧面板,第3根钢筋与第1根钢筋). 用腺病毒载体（Ad.dnPPARγ）表达PPARγ显性阴性突变体也增加了富集(第4条与第2条)而PPARγ（Ad.PPARγ）的表达有效地抑制了它(5档与2档bar），表明完整的PPARγ活性在防止MeCP2介导的表观遗传抑制Ppar公司γ. 接下来，我们确定是否恢复了Ppar公司γ表达和HSC表型逆转深1敲除伴随着MeCP2与启动子结合减少。事实上深1敲除显著降低MeCP2对启动子的富集(第6条与第1条). 因为深1击倒抑制典型Wnts(图2C类)哪一个调解Ppar公司γ表观遗传阻遏(8)，我们询问是否通过添加外源Wnt3a来消除敲除导致的MeCP2富集减少。这种治疗确实阻止了MeCP2结合的减少，甚至使其超过控制水平(8巴与6巴)表明表观遗传去抑制依赖于Wnt抑制。接下来，我们检查了Ad.dnPPARγ和Ad.PPARγ对深1击倒。dnPPARγ而非野生型PPARγ的过度表达阻止了通过深1敲除，表明这种去抑制效应也依赖于完整的PPARγ活性。并行分析Ppar公司γ和α1（I）前胶原mRNA水平表明Ppar公司γ和抑制的α1（I）前胶原表达式深1Wnt3a的添加或dnPPARγ的表达也阻断了敲除(图2E类,中间的和右侧面板). Ad.PPARγ升高Ppar公司γmRNA达到深1击倒并减少前胶原表达方式深1击倒（最后三个小节属于图2E类,中间的和右侧面板). 为了检查Wnt抑制和PPARγ活性之间的潜在联系，这两者都是去抑制所必需的Ppar公司γ基因，我们评估了dnPPARγ对典型Wnt3a和Wnt10b表达的影响。正如预测的那样，Dlk公司击倒调节两者Wnt3a型和重量10b，但dnPPARγ过度表达完全消除了这种作用(图2F类)表明PPARγ活性本身下调了Wnts公司由DLK1诱导。为了支持这一观点，PPARγ的表达将Wnt3a和Wnt10b降低到深蓝色shRNA，以及深蓝色敲除和PPARγ表达没有加性效应，这表明PPARγ的表达通过深蓝色敲低使Wnt表达受到最大抑制。总之，这些结果表明DLK1通过表观遗传抑制负调控PPARγ的表达，并通过减少PPARγ介导的抑制上调典型Wnt的表达。

Dlk1与其他形态因子相互作用的控制

接下来我们研究了如何Dlk1型HSC的表达受其他形态原调控，如Wnts公司,尼可丁、和嘘显示参与HSC激活(6,8,42). 在第7天培养激活的HSC中，深1mRNA表达受到Wnt共受体拮抗剂Dickkopf-1（DKK1）对典型Wnt信号的抑制，尼可丁shRNA和Shh抑制剂环胺(图3A类).深1TCF的表达上调启动子活性，而dnTCF或Wnt共受体拮抗剂DKK1的表达则抑制启动子活性(图3B类)在激活的HSC线路BSC中，表明标准Wnt信号诱导深1通过启动子激活表达。深1启动子同样被necdin激活，并被尼可丁shRNA(图3C类). 因为我们早期的工作确定necdin是Wnt10b转录的正调控因子(8)，我们接下来测试necdin是否诱导深1启动子的激活依赖于典型的Wnt途径。事实上，necdin诱导的启动子活性被DKK1的表达完全阻断(图3C类,右侧面板). 事实上，DKK1甚至抑制基础启动子活性，这表明内源性necdin在激活Wnt通路和Dlk1型发起人。环磷酰胺也抑制深1启动子活性(图3D类). 总的来说，这些结果表明深1受到Wnt、necdin和Shh的积极监管。因为Dlk1型敲除还减少Wnt10b、Wnt3a、necdin和Shh的表达(图2C类)DLK1与其他形态因子之间似乎存在正的交叉作用。此外，DLK1也具有自我传导作用，因为DLK1的表达会诱导DLK1表达，而DLK1敲除会减少Dlk1型启动子活性(图3E类).

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图3。

A类,深1通过腺病毒表达Wnt共受体拮抗剂DKK1或necdin shRNA，或通过使用环胺（16μ米). *,第页与由虚线。B类,深1通过瞬时转染BSC细胞系评估启动子活性深1启动子荧光素酶通过TCF表达上调（0.5～1.5μg TCF质粒），但通过显性阴性TCF（dnTCF）或DKK1.*表达降低，第页与基础启动子活性相比<0.05。C类，Huh7细胞中的Dlk1启动子活性因necdin（0.25～1μg质粒）的表达而增加，但因necdin-shRNA而降低(左侧面板). 由于necdin在BSC细胞系中过度表达，我们使用Huh7细胞检测necdin表达的影响。Wnt拮抗剂Dkk1的表达可消除necd诱导的深1启动子活性和降低基础启动子活性(右侧面板). *,第页与基础启动子活性相比<0.05†，第页与用Ad.GFP感染的细胞相比，<0.05。D类,深1BSC系中的Shh抑制剂环胺降低了启动子活性。*，第页与基础活性相比<0.05。E类,深1启动子活性通过DLK1表达增加（62.5～250 ng DLK1-HA质粒），通过深1用shRNA敲除Huh7细胞。与BSC系相比，使用Huh7细胞是因为DLK1的表达相对较低。*，第页与基础启动子活性相比<0.05。误差线、S.D。

Dlk1在肝再生中的上调作用

令人信服的证据表明，活化的HSC参与肝脏再生。为了测试HSC衍生的DLK1在肝脏再生中的潜在作用，我们首先检测了深1在70%PH后的前24小时和随后的7天期间，从小鼠再生肝脏中提取的总RNA中的mRNA。深1在PH之前表达非常低，并且在24小时时逐渐上调>40倍，并且这种诱导发生在诱导已知的有丝分裂原和共有丝分裂原基因之后，例如血红蛋白,天花α、 和伊尔6PH后1～4小时(图4A类,左边). 这个深蓝色消息在第3-7天减少到基础水平(图4A类，右）。诱导尼可丁和重量10b在第2天至第3天开始出现，震级低得多，并且嘘导入在第7天晚了(图4A类). 这个归纳法深124小时提示我们检查此时点分离的HSC和HCs。PH后24小时分离出的HSC显示深1与Sham术后24小时分离的HSC相比，mRNA水平(图4B类). 从Sham小鼠中分离出的HCs的深1表达，但在24小时后PH动物中显著增加(图4B类). 这些HSC和HCs在与孔底部的HSC和插入物上的HCs分离后立即进行共培养(图4C类). HCs的DNA合成由[^三H] 在培养基中不存在或存在抗DLK1抗体的情况下掺入胸苷。与Sham HCs相比，PH HCs的增殖显著增加。在培养基中添加抗DLK1抗体可消除PH-HC增殖的增加，但对Sham HCs无影响(图4C类). 在另一组相同的实验中，深1在HSC和HCs中测定mRNA水平。诱导深1抗DLK1抗体可完全消除PH小鼠两种细胞类型中的表达(图4D类)表明存在自分泌和旁分泌循环。

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图4。

A类，的表达式深1显示PH后的细胞因子和生长因子。请注意Dlk1型在诱导后逐渐诱导天花α,伊尔6、和血红蛋白在24小时达到峰值(左侧面板).深1诱导后2～3天Wnt10b和necdin轻度上调，第7天Shh轻度上调。B类PH后第1天分离的HCs和HSC在深1两种细胞类型的mRNA水平，第页与Sham-operated小鼠分离的相应细胞相比，<0.05。C类在PH后第1天分离的HCs和HSC共同培养，以测定在没有或存在抗DLK1抗体的情况下HC的DNA合成。注意，PH HC增加的DNA合成被抗DLK1抗体消除。*，第页与非免疫IgG的Sham HC相比<0.05；†，第页与非免疫IgG的PH HC相比，<0.05。D类，在一个与C类,深1测定两种细胞类型的mRNA水平。请注意深1通过添加抗DLK1抗体，两种细胞类型中的上调被完全消除。*，第页与非IgG治疗相比，<0.05。E类根据小鼠PH后第1、2和3天BrdU掺入测定，PH后6 h给予抗DLK1抗体显著减弱HC DNA合成。*，第页与PH小鼠非免疫IgG治疗相比，<0.05。F类中描述的抗DLK1抗体治疗E类如通过PH*后第1天和第2天的肝脏重量/体重分数评估的那样，减少肝脏生长，第页与IgG治疗相比<0.05。误差线、S.D。

接下来，我们在PH模型中测试中和抗体的效果体内在本实验中，抗体或等量的非免疫IgG（27μg）在PH后6小时（时间点）通过尾静脉注射深1mRNA开始增加。在牺牲前，注射BrdU，通过免疫组织化学法对HC DNA合成进行后续评估。在第1天、第2天和第3天，经抗DLK1抗体治疗的动物中，与注射非免疫IgG的动物相比，BrdU并入PH HCs的比例始终较低(图4E类). 第1天的中和抗体治疗也降低了通过肝脏重量与体重的比值评估的肝脏生长(第页<0.05）和第2天(第页=0.05，使用双尾t吨试验），但在第3天和第7天未观察到显著差异(图4F类). 这些对肝脏再生的抑制作用与深1（支持抗DLK1抗体充分阻断自我传导），第75页,重量10b、和Ptn公司mRNA，但不是Tnfa公司,伊尔6、和血红蛋白(图5A类); 减少的G₁（细胞周期蛋白D）和S（细胞周期素A）相细胞周期蛋白及其伴侣的细胞周期蛋白依赖激酶（CDK4和CDK1/2），以及p-ERK1/2和p-第1天、第2天和/或第3天的AKT盒装污渍在里面图5B类这些结果表明，在PH后HSC和HCs中诱导的DLK1在诱导生长因子基因如重量10b,铂族锡，或第75页DLK1的中和作用导致PH后生长信号减弱和早期肝脏生长重量10b因为它诱导典型的Wnt信号传导，进而激活许多被抗DLK1抗体抑制的细胞周期基因。为了解决这种可能性，我们检测了第2天PH肝脏的肝蛋白提取物中非磷酸化（稳定）β-连环蛋白和总β-连环素的蛋白质水平。抗-DLK1抗体治疗确实使稳定的β-连环蛋白水平降低了75%，总β-连环素水平略有降低(图5C类). β-连环蛋白在Ser-552被活化的AKT磷酸化，这种修饰增加了其核转位和活性。因为p-AKT通过抗体治疗降低(图5B类)，我们认为p-β-catenin（Ser-552）水平也可能降低。的确，p-通过抗体治疗，β-catenin（Ser-552）水平降低了55%(图5C类). 总之，这些结果表明，DLK1-Wnt10b-β-catenin通路有助于肝再生中的HC增殖，并且HC DLK1是由HSC衍生的DLK1诱导的。为了测试后一种可能性，我们进行了一项交叉培养实验，其中来自Sham的HCs与来自Sham或PH的HSC共同培养深1和重量10b当与PH-HSC而不是Sham HSC共同培养时，在Sham HCs中诱导表达，并且通过在培养物中添加抗DLK1抗体可以消除这些诱导(图5D类)支持HSC-衍生DLK1通过DLK1-Wnt10b途径介导HCs有丝分裂反应的观点。

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图5。

A类，抗DLK1抗体治疗图4E类，减少深1,第75页,重量10b、和铂族锡PH后第1天、第2天或/和第3天再生肝脏中的mRNA表达。mRNA水平通过肝脏总RNA的定量PCR测定，并由看家基因标准化m36B4型，并表示为与第0天（在PH之前）的对照值相比的-倍变化。*，第页与非免疫IgG治疗组相比<0.05(免疫球蛋白G).B类抗DLK1抗体治疗可降低CDK4、细胞周期蛋白D、CDK1/2、细胞周期素A、p-ERK1/2、p-PH后第2天AKT。生成此图的原始斑点如所示补充图S1。C类，抗DLK1抗体治疗显著降低p-β-连环蛋白（Ser-552）、稳定的非β-连环素以及PH后2天再生肝脏中的总β-连链蛋白，通过免疫印迹密度分析测定。*，第页< 0.05; **,第页与非免疫性IgG处理小鼠的肝脏相比，<0.01。D类与Sham HCs和Sham或PH HSC的交叉共培养实验揭示了HC的诱导深1和重量10bPH-HSC的表达被抗DLK1抗体消除，表明HSC-衍生的DLK1激活HC中的DLK1-Wnt10b通路，第页与与Sham HCs共培养相比<0.05；†，第页与IgG治疗相比<0.05。误差线、S.D。